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    ADSCs、VEGF和GM-CSF修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究

    2023-09-12 06:20:19尹小芳秦嶺楊超閻海萍栗穎利李敏
    中國美容醫(yī)學(xué) 2023年8期
    關(guān)鍵詞:成纖維細(xì)胞輻射血管內(nèi)皮生長因子

    尹小芳 秦嶺 楊超 閻海萍 栗穎利 李敏

    [摘要]目的:研究對比脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)對放射后成纖維細(xì)胞(Fibroblasts,F(xiàn)b)修復(fù)的影響機(jī)制。方法:使用劑量為8 Gy的X線放射源,對大鼠的成纖維細(xì)胞進(jìn)行單次X線照射,建立ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。分別設(shè)置單純放射后成纖維細(xì)胞為Fb2組,ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)為Fb3組,VEGF+放射后成纖維細(xì)胞為VEGF組,GM-CSF+放射后成纖維細(xì)胞為GM-CSF組。通過VEGF、GM-CSF、ADSCs分別干預(yù)放射損傷的成纖維細(xì)胞,觀察細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期及Western-Blot檢測信號通路激活情況驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果:VEGF、GM-CSF、ADSCs分別作用于放射損傷的成纖維細(xì)胞,可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡,加快細(xì)胞周期由G2/M向G1/S進(jìn)展,與照射組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其程度強(qiáng)弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF。VEGF組和GM-CSF組p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達(dá)較照射組上調(diào),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);相同濃度ADSCs、GM-CSF和VEGF促進(jìn)p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達(dá),作用程度強(qiáng)弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K-Akt)通路和絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)通路可能發(fā)揮著重要作用,比如在VEGF和GM-CSF作用于ADSCs治療放射損傷后成纖維細(xì)胞過程中。ADSCs修復(fù)放射損傷后成纖維細(xì)胞的效果明顯好于VEGF和GM-CSF單獨(dú)修復(fù)放射損傷后成纖維細(xì)胞,表明可能還有其他的潛在作用因子。結(jié)論:ADSCs、VEGF和GM-CSF干預(yù)的放射損傷后成纖維細(xì)胞主要通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及加快細(xì)胞周期由G2/M向G1/S發(fā)展。

    [關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞;成纖維細(xì)胞;輻射;粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子;血管內(nèi)皮生長因子

    [中圖分類號]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455(2023)08-0029-05

    Study on the Mechanism of ADSCs, VEGF and GM-CSF in Repairing Radiation Damage of Fibroblasts

    YIN Xiaofang1,QIN Ling1,YANG Chao3,YAN Haiping4,LI Yingli2,LI Min1

    (1.Department of Nuclear Medicine of the 960th Hospital of the PLA,Jinan 250031,Shandong,China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery, 960th Hospital of the People's Liberation Army,Jinan 250031,Shandong,China; 3.People's Liberation Army Navy Special Medical Center Plastic Surgery,Shanghai 200000,China; 4.Jinan Military Region 11th Retired Cadre Rest Center,Jinan 250000,Shandong,China)

    Abstract: Objective? To discuss the effect mechanism of adipose-derived stem cells(ADSCs) on irradiation fibroblasts (Fb) through vascular endothelial growth factor (VEGF) and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). Methods? Rats Fb were irradiated with a dose of 8 Gy X-ray source, and the co-culture of ADSCs and post-irradiated Fb was established. ADSCs were co-cultured with irradiation Fb as ADSC group, VEGF+ irradiation Fb was set as VEGF group, and GM-CSF+ after-radiation Fb was set as GM-CSF group. VEGF, GM-CSF and ADSCs were used to intervene in radiation-injured fibroblasts, respectively, and cell apoptosis, proliferation, cell cycle, and activation of signaling pathways by Western-Blot were analyzed to verify the results. Results? VEGF, GM-CSF and ADSCs intervened in radiation-injured fibroblasts, respectively, and the degrees of promoting cell proliferation, anti-apoptosis and accelerating cell cycle. Compared with the irradiation group, the differences were statistically significant(P<0.05), and its degree was ADSCs, GM-CSF, and VEGF in order. The expressions of p-Akt protein and p-Erk protein in the VEGF group and GM-CSF group were up-regulated compared with the irradiation group, and the difference was statistically significant (P<0.01). The expression of p-Erk protein and the degree of action were ADSCs, GM-CSF, and VEGF in order, and the difference was statistically significant (P<0.01). The PI3K-Akt (phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B) pathway and the MAPK (mitogen-activated protein kinase) pathway may play an important role, such as the role of VEGF and GM-CSF in the treatment of ADSCs on irradiation fibroblasts. The effect of VEGF and GM-CSF is much weaker than that of ADSCs, which implies that they may only be part of the cytokines during the progress of radiation-induced skin repairment. Conclusion? The radiation-injured fibroblasts treated with VEGF and GM-CSF demonstrated enhanced proliferation activity, reduced apoptosis, and accelerated cell cycle progressed from G2/M to G1/S.

    Key words: adipose-derived stem cells; fibroblasts; radiation; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Vascular endothelial growth factor

    放射性皮膚損傷是指皮膚受輻射線作用發(fā)生的皮膚損傷,臨床上近85%~95%的腫瘤患者因放射性治療出現(xiàn)不同程度的皮膚損傷[1]。臨床上,常見的治療有高壓氧、激光局部治療、局部藥物涂抹及外科手術(shù)等,但這些方式往往效果欠佳,易導(dǎo)致局部損傷加重,病變范圍擴(kuò)大。脂肪干細(xì)胞是一種具有自我更新及向多種組織細(xì)胞分化能力的多能干細(xì)胞,并可分泌多種細(xì)胞因子、生長因子,具有延緩輻射纖維化、促進(jìn)新生血管及肉芽組織形成等作用,在再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用[2]。

    輻射損傷引起成纖維細(xì)胞功能障礙,而肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)的主要細(xì)胞,成纖維細(xì)胞增殖受抑制及ECM生成減少會導(dǎo)致傷口愈合不良。Haubner F等發(fā)現(xiàn)ADSCs可能通過分泌細(xì)胞因子和生長因子修復(fù)損傷后成纖維細(xì)胞及加速微血管密度的形成,同時不會造成成纖維細(xì)胞過度活化,形成皮膚瘢痕[3]。但是,目前的研究都是通過蛋白質(zhì)檢測篩選出可能影響修復(fù)的細(xì)胞因子,而沒有具體驗(yàn)證這些細(xì)胞因子是否對放射性皮膚損傷修復(fù)過程產(chǎn)生影響。

    本研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可能通過分泌血管內(nèi)皮生長因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Endothelial cell growth factor,EGF)等多種因子影響放射后成纖維細(xì)胞的修復(fù)[4]。為了驗(yàn)證這些細(xì)胞因子是否在該過程中起作用,本實(shí)驗(yàn)選取了ADSCs、GM-CSF和VEGF,設(shè)置照射組以及ADSCs組、GM-CSF組、VEGF組分別與體外放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),來初步驗(yàn)證它們對放射后成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1? 材料和方法

    1.1 主要儀器和試劑:康寧DMEM培養(yǎng)液(低糖)、美國Gibco胎牛血清、美國Gibco胰蛋白酶(0.25%)、美國GibcoⅠ型膠原酶(0.1%)、美國Gibco Dispase酶;直線加速器(德國西門子);5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific,美國);倒置顯微鏡(Olympus,日本);熒光顯微鏡(Olympus,日本);流式細(xì)胞儀(Mihenyi Biotec,德國);麻醉劑戊巴比妥鈉(Sigma,美國);Tunnel凋亡試劑盒(羅氏)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物:10只成年雄性SD大鼠,生長周齡為10周齡,體重300~400 g,由長海醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究經(jīng)長海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.3 大鼠ADSCs及皮膚成纖維細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定:SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后,于小燒杯中加入適量75%酒精浸泡5 min消毒,剖腹取腹股溝處脂肪組織,并用有齒鑷和顯微剪刀將筋膜、淋巴組織及小血管剔除干凈,然后用適量含1%雙抗的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution,PBS)溶液沖洗3次。用無菌眼科剪將脂肪組織剪碎至糊狀后放置于裝有適量PBS的培養(yǎng)皿中,然后加入約等體積的含0.1%膠原酶I,搖晃均勻后,置于37℃溫箱中1 h,每間隔5 min手動搖勻一次。于干凈離心管中放入消化后的脂肪組織液,取等量含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基加入至消化后的脂肪組織液,以結(jié)束膠原酶的繼續(xù)消化作用,然后放入離心機(jī)中,以1 000 r/min離心10 min,倒掉上層脂肪后,余液體用75μm細(xì)胞濾網(wǎng)濾去雜質(zhì)后置于無菌50 ml離心管,繼續(xù)以1 000 r/min,離心5 min,離心后倒掉表層的淡紅色液體,切記不要倒掉底部的沉淀,然后加入含胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞液。將細(xì)胞懸液加入至無菌培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)于條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,每隔48 h更換一次培養(yǎng)基,每次倒掉培養(yǎng)基后在倒置顯微鏡下觀察,當(dāng)培養(yǎng)瓶的瓶底單層細(xì)胞豐度達(dá)到80%以上時,就可以進(jìn)行胰酶消化后的傳代操作。取3代細(xì)胞活力良好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面CD分子流氏鑒定、體外成脂誘導(dǎo)分化及成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。同上步驟取大鼠背部皮下真皮組織消化離心重懸處理后傳代培養(yǎng),取第3代成纖維細(xì)胞切片做波形蛋白(Vimention)免疫組化。具體實(shí)驗(yàn)步驟及細(xì)胞表面CD分子、蛋白及誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果參考課題組前期方法[5]。

    1.4 成纖維細(xì)胞放射模型的建立:取第3代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,加入1~2 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min后,加入等量含胎牛血清低糖DMEM的培養(yǎng)基制成混合細(xì)胞液。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,以1.5×105個/孔均勻吸取放入6孔板底部,條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基,然后將6孔板置于直線加速器平臺,調(diào)整培養(yǎng)板位置使光源投射區(qū)中心正對培養(yǎng)板,為使放射能量集中于培養(yǎng)板上,可加蓋一塊放射板。直線加速器設(shè)置參數(shù)能量為6 MV,距離100 cm,劑量8 Gy。停止照射后立即將成纖維細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)步驟參考課題組前期方法[6]。

    1.5 共培養(yǎng)模型及分組:共培養(yǎng)模型參考前期實(shí)驗(yàn)組建立的模型。取第3代成纖維細(xì)胞和ADSCs,放射后成纖維細(xì)胞為Fb2組、ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)的放射后成纖維細(xì)胞為Fb3組、VEGF+放射后成纖維細(xì)胞為VEGF組、GM-CSF+放射后成纖維細(xì)胞為GM-CSF組。

    1.6 CCK-8法檢測Fb細(xì)胞增殖活性:取第3代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù),均勻鋪至24孔板中(3.5×104個細(xì)胞/孔),F(xiàn)b2組、GM-CSF組和VEGF組的成纖維細(xì)胞采用普通24孔板,24孔Transwell板下室內(nèi)放置Fb3組的成纖維細(xì)胞。8 Gy X線照射每組貼壁后的成纖維細(xì)胞,照射后將取3×104個ADSCs接種在Transwell培養(yǎng)皿可取出的上室,GM-CSF組分別加入GM-CSF濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的培養(yǎng)基,VEGF組分別加入VEGF濃度為10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml的培養(yǎng)基,各組設(shè)置6個復(fù)孔,于37℃、5%CO2條件的孵箱共培養(yǎng)。分別于6 h、12 h、24 h和48 h下室及培養(yǎng)孔中加入含40~50 μl CCK-8的培養(yǎng)基,于37℃孵箱培養(yǎng)0.5~4 h,用光度儀檢測450 nm處OD值,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 流式細(xì)胞儀檢測Fb細(xì)胞凋亡和周期:取第3代成纖維細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后,以每孔1.5×105個細(xì)胞鋪至6孔板中,F(xiàn)b2組、GM-CSF組和VEGF組成纖維細(xì)胞鋪在普通6孔板中,Transwell 6孔板的下室中放置Fb3組成纖維細(xì)胞。8 Gy X線照射各組貼壁細(xì)胞,照射完后ADSCs組成纖維細(xì)胞置于接種ADSCs的上室(1.0×105個細(xì)胞/孔),GM-CSF組和VEGF組分別加入上述濃度VEGF和GM-CSF培養(yǎng)基,37℃孵箱共培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,各組貼壁細(xì)胞經(jīng)適量胰酶消化處理,Buffer重懸細(xì)胞后加入5 μl細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-APC)在室溫條件下培養(yǎng)30 min,然后加入5 μl 7-AAD(7-氨基放線菌素)復(fù)染,然后用流氏細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。檢測細(xì)胞周期時,用適量PBS將消化后的細(xì)胞洗2遍,并加入100 μl PBS,用-20℃的PBS將無水乙醇稀釋至75%,室溫放置約6 h。檢測前離心機(jī)以轉(zhuǎn)速為1 500 r/min離心,倒掉上層乙醇后用適量PBS沖洗,加入熒光染料PI(碘化丙啶)后室溫培養(yǎng)30 min上檢測。

    1.8 Western-blot檢測通路變化

    1.8.1 蛋白的抽提:各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉培養(yǎng)基后,用適量PBS沖洗,六孔板每孔加入100~150μl 4℃預(yù)冷蛋白裂解液?;厥盏鞍琢呀庖河贓P管,冰上放置30 min,4℃條件下1 200 r/min離心機(jī)離心15 min,留取上清液。采用BCA蛋白定量法,于567 nm波長的吸光光度儀測定OD值,確定蛋白濃度,用Loading Buffer調(diào)整樣品濃度一致。

    1.8.2 電泳和轉(zhuǎn)膜:配制凝膠固定后,加入電泳液至電泳槽中。用生理鹽水清洗上樣孔后,分別加入等量marker和樣品。電壓調(diào)至60 V,待溴酚藍(lán)至分離膠后更換100 V電壓跑至底部。剪取適量凝膠及PVDF膜,放入甲醛溶液中30 s。取出凝膠及PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜電泳槽中,加入適量轉(zhuǎn)膜液,周圍放置適量冰塊,以200 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min。

    1.8.3 免疫和顯影:取出電泳后的PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉2 h,加入按說明書方法稀釋后的一抗,4℃搖床過夜。第2天用TBST溶液清洗PVDF膜3次,每次持續(xù)10 min。然后加入按說明書方法稀釋后的二抗孵育2 h,TBST溶液清洗PVDF膜3次,每次持續(xù)10 min。拍照記錄確定膜在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中的坐標(biāo)后,將膜置于HRP底物過氧化物溶液與HRP魯米諾等體積混合液中,30 s后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:Western-blot用Quantity One4.64計(jì)算條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算,使用Excel軟件匯總統(tǒng)計(jì)CCK-8、凋亡等數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,所有數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。所得的值采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用多組單因素方差分析處理數(shù)據(jù),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖形采用GraphPad Prism 6.0制作。

    2? 結(jié)果

    2.1 大鼠ADSCs與成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定:ADSCs貼壁后,倒置顯微鏡下觀察呈多角形,細(xì)胞核呈圓形。培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后細(xì)胞變成長梭形,細(xì)胞核變?yōu)闄E圓形。ADSCs表面標(biāo)記流式檢測結(jié)果CD29、CD44、CD31和CD45陽性率分別為97.4%、96.9%、4.37%和0.61%。第3代ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后胞漿內(nèi)可見脂滴,油紅O染色呈紅色;經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞由長梭形變成多角形,可見鈣鹽結(jié)晶沉積及礦化結(jié)節(jié),誘導(dǎo)15 d后經(jīng)AKP及茜素紅染色呈陽性。另提取的成纖維細(xì)胞外形呈長梭形或多角形,和ADSCs形態(tài)類似;同時細(xì)胞可檢測出高表達(dá)的Vimentin蛋白。見圖1。

    2.2 細(xì)胞增殖力、凋亡和周期結(jié)果:GM-CSF組成纖維細(xì)胞較Fb2組成纖維細(xì)胞增殖快(P<0.05)。25 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml濃度GM-CSF處理后增殖程度遞增。VEGF組成纖維細(xì)胞增殖程度較Fb2組快(P<0.05),10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml濃度的VEGF處理后增殖程度遞增,有劑量依賴關(guān)系。50 ng/ml GM-CSF組較50 ng/mlVEGF組Fb增殖快(P<0.05)。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞抗凋亡作用弱于Fb3組(P<0.01),較Fb2組強(qiáng)(P<0.01);50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞抑制凋亡作用弱于Fb3組(P<0.01),較Fb2組強(qiáng);50 ng/ml GM-CSF組抗凋亡作用強(qiáng)于50 ng/ml VEGF組(P<0.01)。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)明顯少于Fb3組P<0.05);50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于Fb2組(P<0.01);50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞較Fb3組G2期細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01);50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于Fb2組(P<0.05);50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于50 ng/ml VEGF組處于G2期細(xì)胞數(shù),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、圖2~3。

    2.3 VEGF和GM-CSF作用通路檢測:結(jié)果顯示,50 ng/ml GM-CSF組的p-Erk蛋白表達(dá)高于Fb2組,50 ng/ml VEGF組的p-Erk蛋白表達(dá)高于Fb2組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);50 ng/ml GM-CSF組的p-Akt蛋白表達(dá)多于Fb2組,50 ng/ml VEGF組的p-Akt蛋白表達(dá)高于Fb2組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ADSCs、GM-CSF和VEGF對信號通路的激活程度ADSCs>GM-CSF>VEGF。見圖4。

    3? 討論

    放射性皮膚損傷是腫瘤患者接受放射治療后常見的皮膚并發(fā)癥,近年來,隨著惡性腫瘤術(shù)后放療的普及、外照射和放射性粒子內(nèi)照射治療逐步成為治療規(guī)范,這使得放射性皮膚損傷成為臨床常見病和多發(fā)病之一[7]。放射性皮膚損傷傳統(tǒng)治療方法往往難以達(dá)到理想的效果,主要是因?yàn)殚L期以來放射性皮膚損傷的預(yù)防和管理通?;趥€人經(jīng)驗(yàn),缺乏高質(zhì)量的大樣本研究和統(tǒng)一的評估標(biāo)準(zhǔn),各研究結(jié)果往往相互矛盾,缺乏科學(xué)證據(jù)[8]。成纖維細(xì)胞在修復(fù)放射性皮膚損傷過程中發(fā)揮重要作用,輻射損傷刺激后,成纖維細(xì)胞一方面在趨化因子的作用下募集至創(chuàng)面分裂增殖,分泌大量膠原纖維及ECM填補(bǔ)創(chuàng)面,與新生毛細(xì)血管及炎細(xì)胞組成肉芽組織,保護(hù)創(chuàng)面。另一方面,成纖維細(xì)胞在遷徙運(yùn)動過程中分化為肌成纖維細(xì)胞,具有收縮傷口效應(yīng),減小創(chuàng)面面積[9]。

    ADSCs目前已廣泛應(yīng)用于修復(fù)各種難治性創(chuàng)面、燒傷燙傷及放射性皮膚損傷等皮膚創(chuàng)面。ADSCs被認(rèn)為是修復(fù)皮膚損傷及重建皮膚損傷組織細(xì)胞的來源,將來在大面積皮膚缺損修復(fù)方面具有明顯優(yōu)勢。ADSCs可通過分泌多種細(xì)胞因子、生長因子加速血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖和新生血管形成,還可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和膠原生成,對肉芽組織基質(zhì)形成、創(chuàng)面再上皮化及瘢痕組織的形成將產(chǎn)生重要的作用[10]。GM-CSF是調(diào)節(jié)急性皮膚反應(yīng)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子,GM-CSF可促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成及分泌多種細(xì)胞因子及生長因子,促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,加速創(chuàng)面再上皮化及新生血管形成的作用[11]。劉宏東等在評估GM-CSF治療深Ⅱ度燒傷時,發(fā)現(xiàn)GM-CSF可提高創(chuàng)面組織中多種生長因子的表達(dá)水平,加速創(chuàng)面修復(fù)[12]。VEGF主要由成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞合成,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化、新生血管生成的作用,在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肉芽組織生長及成纖維細(xì)胞增殖等方面促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合[13]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,VEGF與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),其促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡以及加快細(xì)胞周期方面弱于GM-CSF與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組和ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組。進(jìn)一步說明,ADSCs修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞是多因子共同作用的結(jié)果。VEGF與GM-CSF能直接或間接作用于成纖維細(xì)胞,促進(jìn)放射后成纖維細(xì)胞的修復(fù);還可通過刺激Erk的磷酸化狀態(tài),激活MAPK細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使處于G2期細(xì)胞數(shù)增多,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化。VEGF和GM-CSF干預(yù)放射后成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、凋亡減少、并促進(jìn)細(xì)胞周期由G2/M向G1/S發(fā)展。本文初步研究了GM-CSF和VEGF對通路的激活情況,50 ng/ml VEGF組和GM-CSF組細(xì)胞的p-Akt和p-Erk較照射組明顯上調(diào),這說明VEGF和GM-CSF在ADSCs修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞過程中可能通過活化PI3K-Akt通路和MAPK通路發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號通路和MAPK通路可被VEGF等各種細(xì)胞因子、生長因子激活,通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的凋亡,誘導(dǎo)新生血管形成,從而修復(fù)皮膚損傷[14]。綜上所述,ADSCs、VEGF與GM-CSF可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡以及加速細(xì)胞周期,促進(jìn)放射后成纖維細(xì)胞修復(fù),為放射性皮膚損傷提供替代治療方法。由于實(shí)驗(yàn)中VEGF和GM-CSF細(xì)胞因子用量遠(yuǎn)大于ADSC的分泌量,且兩組Akt和Erk磷酸化效應(yīng)弱于ADSCs共培養(yǎng)組。所以VEGF和GM-CSF可能只是參與放射性損傷修復(fù)細(xì)胞因子中的一部分。本次實(shí)驗(yàn)不足之處在于沒有設(shè)置輻射后ADSCs對照組,無法直接證明VEGF和GM-CSF是ADSCs分泌。在下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上可以增加這一對照組以及逐步驗(yàn)證ADSCs分泌的其他細(xì)胞因子在修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞的作用,探討ADSCs修復(fù)放射性皮膚損傷的各種潛在機(jī)制。

    ADSCs、VEGF與GM-CSF在治療放射性皮膚損傷時由于穩(wěn)定性較差及半衰期較短,直接靜脈或局部注射會影響其活性及功能,且靜脈注射脂肪干細(xì)胞大部分會駐留在肺、肝、脾等臟器中,無法有效地將干細(xì)胞傳遞至損傷部位[15]。所以,合理利用載體穩(wěn)定細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)及提高干細(xì)胞的利用率,充分發(fā)揮它的生理功能是未來臨床研究的重點(diǎn)。最新研究表明,各種新興納米粒子支架材料已經(jīng)廣泛用做ADSCs、VEGF等的載體,可為ADSCs的分化和增殖提供適合的微環(huán)境,以及穩(wěn)定細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)。已有研究表明,載VEGF殼聚糖納米粒子能夠使VEGF持久釋放,可以有效的治療大鼠放射性皮膚損傷[16]。體外釋藥研究結(jié)果表明,負(fù)載VEGF的溫敏凝膠可以持續(xù)釋放生長因子,促進(jìn)大鼠全層皮膚創(chuàng)面愈合[17]。已有研究表明,磁靶向聚多巴胺修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可以維持間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生理功能,還可以定向歸巢至靶位修復(fù)損傷[18]。

    綜上所述,ADSCs、VEGF與GM-CSF與載體或支架的新興結(jié)合方式將會是未來治療大面積皮膚創(chuàng)面的有效治療途徑,且不存在倫理學(xué)爭議,未來在臨床會成為更好的替代治療途徑。

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    [收稿日期]2022-06-09

    本文引用格式:尹小芳,秦嶺,楊超,等.ADSCs、VEGF和GM-CSF修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué),2023,32(8):29-34.

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