高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定天王補(bǔ)心丸中山麥冬

李麗莉，呂軼峰，寧崇良，覃麗酈，白桂昌，何頌華

（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

天王補(bǔ)心丸來源于明代洪基《攝生秘剖》天王補(bǔ)心丹，最早被《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)1977年版收載，現(xiàn)收載于中國藥典2020年版一部[1]，有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸等劑型。天王補(bǔ)心丸由丹參、當(dāng)歸、石菖蒲、黨參、茯苓、五味子、麥冬、天冬、地黃、玄參、制遠(yuǎn)志、炒酸棗仁、柏子仁、桔梗、甘草、朱砂16 味藥材組成，具有滋陰養(yǎng)血，補(bǔ)心安神的功效。其中麥冬滋陰清熱，為方中臣藥?！吨袊幍洹分幸?guī)定麥冬的來源為百合科植物麥冬的干燥塊根[1]，山麥冬為百合科植物湖北麥冬或短葶山麥冬的干燥塊根。目前市場上由于麥冬需求量大，而山麥冬市場需求較少、產(chǎn)量大且與麥冬形態(tài)相近，有部分廠家以山麥冬代替麥冬或在麥冬中混入山麥冬為原料生產(chǎn)中成藥。雖然麥冬和山麥冬性狀相近，療效類似[2]，但現(xiàn)代研究表明兩者的化學(xué)成分和藥理作用具有一定區(qū)別[3-7]。鑒于古今麥冬藥用習(xí)慣、現(xiàn)代化學(xué)與藥理研究基礎(chǔ)和中醫(yī)臨床實(shí)際，《中國藥典》將麥冬和山麥冬歸屬為兩個不同的藥味，不允許二者混用。

根據(jù)文獻(xiàn)[8-11]記載，山麥冬皂苷B為湖北麥冬的特征性成分，短葶山麥冬皂苷C 為短葶山麥冬的特征性成分，而麥冬幾乎不含以上兩種成分。筆者以山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 為指標(biāo)性成分，建立天王補(bǔ)心丸中山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C的HPLC-MS/MS檢查方法，若樣品中檢出一定量的山麥冬皂苷B 或短葶山麥冬皂苷C，則認(rèn)為存在以山麥冬替代麥冬投料的摻偽情況。該方法對于天王補(bǔ)心丸的規(guī)范生產(chǎn)以及質(zhì)量安全具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串連三重四級桿質(zhì)譜儀：Agilent 1290-6490型，美國安捷倫科技有限公司。

分析天平：(1) ML204 型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；(2) XS205型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-250DU 型，昆山超聲儀器有限公司。

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司。

天王補(bǔ)心丸樣品：大蜜丸，市售。

山麥冬皂苷B 對照品：批號為111907-201103，中國食品藥品檢定研究院。

短葶山麥冬皂苷C 對照品：批號為111908-201102，中國食品藥品檢定研究院。

乙腈：色譜純，美國費(fèi)希爾公司。

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜儀

色譜柱：Waters CORTECS?C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；流動相：A相為0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)的甲酸溶液，B相為乙腈，流量為0.2 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.1 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧電離源；掃描模式：正負(fù)離子同時掃描(ESI+/ESI-)；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；干燥氣：氮?dú)猓髁繛?2 L/min，溫度為350 ℃；霧化氣壓力：1.379×105Pa；鞘氣：氮?dú)?，流量?1 L/min，溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓：4 kV；噴嘴電壓：500 V。山麥冬皂苷B和短亭山麥冬皂苷C質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 山麥冬皂苷B和短亭山麥冬皂苷C的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液制備

取大蜜丸樣品，剪碎，混勻，取適量，精密稱定，加入兩倍量的硅藻土，研勻，取約4.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率為180 W，頻率為50 kHz) 30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。精密吸取續(xù)濾液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過，濾液作為樣品溶液。

1.3.2 陰性樣品溶液制備

按《中國藥典》2020年版一部天王補(bǔ)心丸處方，取除麥冬以外的15味藥材，按大蜜丸的配比和制備方法制成45 g不含麥冬成分的陰性對照制劑。取陰性對照制劑1 g，按1.3.1 樣品溶液制備方法制成不含麥冬成分的陰性樣品溶液。

1.3.3 對照制劑溶液制備

按《中國藥典》2020年版一部天王補(bǔ)心丸處方，以正品麥冬為原料，按大蜜丸的配比和制備方法制成45 g 對照制劑。取對照制劑1 g，按1.3.1 方法制成對照制劑溶液。

1.3.4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

(1) 定量用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成含山麥冬皂苷B 9 ng/mL、短葶山麥冬皂苷C 120 ng/mL的混合溶液，作為定量用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(2) 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別稱取山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 對照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，配制成山麥冬皂苷B 質(zhì)量濃度分別為5.18、10.37、20.74、51.85、103.70、207.40 ng/mL，短葶山麥冬皂苷C 質(zhì)量濃度分別為5.20、20.80、52.00、208.00、1040.00、2 080.00 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.5 定量方法

按1.2儀器工作條件測定，以定量用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，以外標(biāo)單點(diǎn)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法優(yōu)化

根據(jù)處方，樣品中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%～47.2%的煉蜜，采用硅藻土與樣品混勻，可以達(dá)到去除蜂蜜干擾的目的。采用甲醇提取，與采用不同濃度的甲醇水溶液提取相比，可大幅度減少強(qiáng)極性雜質(zhì)的提取量，且有利于樣品溶液在質(zhì)譜中的霧化與離子化，使得靈敏度得到進(jìn)一步的提高。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件優(yōu)化

比較了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液3 種流動相體系，分別采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相時，電離模式為正離子模式時，山麥冬皂苷B 有較強(qiáng)的響應(yīng)，母離子為m/z723.4，為[M+H]+；電離模式為負(fù)離子模式時，短葶山麥冬皂苷C 有較強(qiáng)的響應(yīng)，母離子為m/z915.5，為[M+COOH]-。故采用0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，采用正、負(fù)離子模式同時測定，在保證靈敏度的同時，減少了流動相的用量。山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 和天王補(bǔ)心丸樣品檢測離子色譜圖如圖1所示。

圖1 山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品及天王補(bǔ)心丸樣品檢測離子色譜圖

2.3 專屬性試驗(yàn)

在1.2 儀器工作條件下，分別取陰性樣品溶液、對照制劑溶液進(jìn)行測定，色譜圖如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可以看出，陰性樣品和對照制劑色譜圖中均未出現(xiàn)與山麥冬皂苷B、短葶山麥冬C 對照品色譜保留時間相同的色譜峰，表明陰性樣品和對照制劑中共存成分對方法無干擾。

圖2 陰性樣品溶液監(jiān)測離子色譜圖

圖3 對照制劑溶液監(jiān)測離子色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

2.4.1 對照品線性

取1.3.4.中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.2 儀器工作條件下，分別進(jìn)樣1 μL 進(jìn)行測定，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可知，山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C的質(zhì)量濃度分別在5.18～207.4、5.2～2 080 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 3。

表3 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.4.2 摻偽線性

在1.2儀器工作條件下，按天王補(bǔ)心丸(大蜜丸)的處方和制備方法，分別制備處方含量的5%、10%、20%、50%、80%、100%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))摻湖北麥冬、短葶山麥冬樣品，按1.3.1方法配制成不同摻偽比例的樣品溶液，測定并計算色譜峰面積，以目標(biāo)物摻偽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x)為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。由表4 數(shù)據(jù)可知，麥冬摻偽(湖北麥冬、短葶山麥冬)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5%～100%范圍內(nèi)與色譜峰峰面積線性關(guān)系良好，可以準(zhǔn)確定量。

表4 天王補(bǔ)心丸中湖北麥冬和短葶山麥冬摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)

2.5 方法檢出限

取摻偽樣品溶液，不斷稀釋并測定，以信噪比為3 對應(yīng)的樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限，得山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的檢出限分別為56、134 ng/g。

2.6 精密度試驗(yàn)

取6份不含山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的樣品，各4.5 g，分別精密加入山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 的質(zhì)量濃度分別為4.14、4.16 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，按1.3.1方法制備成同時含有山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C的樣品溶液，分別測定，結(jié)果列于表5。由表5可知，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 6次測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.57%、5.27%，表明該方法精密度良好。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取摻偽樣品溶液1 份，分別于溶液配制后第0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測定，色譜峰面積測定結(jié)果列于表6。由表6 可知，24 h 內(nèi)山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C色譜峰峰面積測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.67%、3.93%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表6 不同放置時間時色譜峰面積測定結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取陰性對照制劑約4.5 g，平行稱取9份，分別精密加入高、中、低不同質(zhì)量濃度水平的山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各0 mL，按1.3.1 方法制備加標(biāo)樣品溶液，每種溶液分別測定3次，結(jié)果列于表7。由表7數(shù)據(jù)可知，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 的平均回收率分別為99.16%、101.54%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)語

中藥材是中成藥生產(chǎn)的基礎(chǔ)物質(zhì)，其質(zhì)量狀況將會直接影響藥品質(zhì)量，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及中藥材資源的短缺，中藥的質(zhì)量問題屢屢發(fā)生。中藥制劑中，以山麥冬代替麥冬作為料的現(xiàn)象常見報道[12-17]，說明藥品生產(chǎn)企業(yè)對中藥制劑的原料把控缺失，企業(yè)質(zhì)檢人員缺乏一定的鑒別能力或企業(yè)存在失信的行為，需引起相關(guān)技術(shù)部門和監(jiān)管部門的注意。采用HPLC-MS/MS 法測定天王補(bǔ)心丸中山麥冬專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可以簡化樣品處理過程，提高檢測準(zhǔn)確性。通過優(yōu)化梯度洗脫程序與質(zhì)譜條件，采用MRM 模式，正負(fù)離子同時測定，節(jié)省了測定時間，為藥品質(zhì)量監(jiān)督提供了技術(shù)支持。