雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)對肺炎克雷伯菌多黏菌素耐藥機(jī)制影響的研究進(jìn)展

楊文麗，王東亮，馮鈞帥，陳 莉，齊保立，史惠文，袁 媛

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（蘭州 730000）

2. 甘肅省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（蘭州 730000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, KP）是一種重要的人類病原體，被歸類為一種常見的機(jī)會性醫(yī)院相關(guān)細(xì)菌，涉及多種感染，包括尿路感染、肺部感染、肝膿腫和手術(shù)傷口感染[1]。在過去十年中，全球范圍內(nèi)耐多藥KP 分離株的報告顯著增加。

多黏菌素（多黏菌素B 和黏菌素）是于1947年從多黏菌芽孢桿菌中分離出的一種具有抗革蘭氏陰性菌活性的多陽離子抗菌肽[2]。在20 世紀(jì)80 年代，由于多黏菌素的神經(jīng)毒性和腎毒性，其應(yīng)用受到限制。21 世紀(jì)初，隨著多重耐藥（multi-drug resistance, MDR）微生物數(shù)量的增加，尤其是碳青霉烯耐藥菌的出現(xiàn)，多黏菌素再次受到臨床的關(guān)注[3]。多黏菌素是治療KP 感染的最后手段藥物，然而臨床中出現(xiàn)了不同程度的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae, CRKP）耐多黏菌素的情況。2022 年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告數(shù)據(jù)顯示，CRKP 對多黏菌素B 的耐藥率為7.9%，對黏菌素的耐藥率為8.2%[4]。研究顯示，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two-component regulatory systems, TCSs）可通過感知環(huán)境變化調(diào)節(jié)KP 對多黏菌素耐藥的修飾[5]。KP 可通過TCSs 修飾脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、mgrB 負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子、外排泵等介導(dǎo)多黏菌素耐藥。

1 細(xì)菌雙組分調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)

典型的TCSs 由一對蛋白質(zhì)組成，包括一個傳感器組氨酸激酶（histidine kinase, HK）和一個反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（response regulator, RR）?？勺僅K n 端結(jié)構(gòu)域感知環(huán)境變化，通過結(jié)合細(xì)胞外配體或通過其他構(gòu)象變化，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）水解觸發(fā)保守的c 端組氨酸殘基的自磷酸化。HK 結(jié)合的磷酸被轉(zhuǎn)移到RR 保守的n 端結(jié)構(gòu)域的天冬氨酸殘基上，RR 是一種位于細(xì)胞質(zhì)中的同型二聚體蛋白，激活RR 的可變c 端輸出結(jié)構(gòu)域，允許其通過靶向DNA 來調(diào)節(jié)基因組表達(dá)。通過磷酸化的信息流，細(xì)菌能夠有效感知其周圍環(huán)境的變化（營養(yǎng)、pH 值、滲透壓、抗生素等），并以一種允許對動態(tài)環(huán)境進(jìn)行快速反應(yīng)的方式協(xié)調(diào)基因表達(dá)[5]。

2 TCSs對多黏菌素耐藥的影響機(jī)制

細(xì)菌細(xì)胞外膜（outer membrane, OM）的陰離子性質(zhì)是由LPS 的存在所決定的，它包含一個帶負(fù)電荷的脂質(zhì)A 部分。LPS 是多黏菌素的初始靶點(diǎn)，多黏菌素可與LPS 的脂質(zhì)A 區(qū)域的磷酸基相互作用[2,6]。一旦附著，多黏菌素就會通過取代二價陽離子Ca2+和Mg2+來破壞OM，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

當(dāng)暴露在陽離子抗菌肽，如多黏菌素B和黏菌素下，細(xì)菌會通過改變LPS 保護(hù)自己免受不利環(huán)境的刺激。暴露在陽離子抗菌肽下激活了細(xì)菌的TCSs，從而導(dǎo)致磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine, PEtN）和4-氨基阿拉伯糖（4-aminoarabinose, L-Ara4N）陽離子基團(tuán)的合成和轉(zhuǎn)移，對LPS 的脂質(zhì)A 進(jìn)行共價修飾[7]。這些LPS 共價修飾可以中和OM 上的負(fù)電荷，使OM 帶正電荷，阻礙多黏菌素與OM 的結(jié)合，導(dǎo)致抗生素作用的減少或消失，從而形成多黏菌素耐藥[8]。

3 PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB對肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制

在介導(dǎo)KP 對多黏菌素耐藥中最典型的兩個TCSs 是PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB。研 究 發(fā) 現(xiàn)，在暴露于多黏菌素的KP 中，PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB 系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)[9]。Naha 等[10]的研究顯示，在多黏菌素耐藥的KP 大多數(shù)菌株的TCSs 基因表達(dá)上調(diào)，包括PhoP（4～6 倍）、PhoQ（5～9 倍）、PmrA（4～13 倍）和PmrB（6～11 倍）。

PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB 的激活是由環(huán)境刺激和TCSs 內(nèi)的特定突變觸發(fā)的，這些突變導(dǎo)致它們的構(gòu)成激活和隨后的過表達(dá)[11-12]。

3.1 PhoP/PhoQ系統(tǒng)

PhoP/PhoQ 系統(tǒng)是KP 中研究最廣泛的TCSs 系統(tǒng)，其在許多致病性和非致病性細(xì)菌中較為保守。

在各種致病菌中，PhoP/PhoQ 具有感知宿主細(xì)胞內(nèi)信號并在感染期間調(diào)節(jié)細(xì)菌生活方式的能力[13]。反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoP 在許多革蘭氏陰性菌中高度保守，傳感器激酶PhoQ 位于細(xì)胞內(nèi)膜（intracellular membrane, IM），可通過自磷酸化對幾種環(huán)境變化作出反應(yīng)，包括低pH 值、低Mg2+濃度和抗生素的存在，然后磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoP，它激活了參與LPS 修飾的下游基因的表達(dá)，通過遺傳調(diào)控對OM 進(jìn)行修飾[14-17]。

PhoP/PhoQ 系統(tǒng)的激活，主要受到mgrB基因突變的負(fù)反饋系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的影響，PhoP/PhoQ系統(tǒng)通過PmrD 間接激活PmrA/PmrB 系統(tǒng)來促進(jìn)多黏菌素抗性[18-20]。mgrB的插入失活與PhoP/PhoQ 系統(tǒng)和pmrHFIJKLM 操縱子的過表達(dá)有關(guān)，PhoP/PhoQ 系統(tǒng)一旦被激活，磷酸化的PmrA 就會結(jié)合到pmrCAB 操縱子和pmrHFIJKLM 操縱子的啟動子區(qū)域，增加RNA 聚合酶的識別和結(jié)合，并導(dǎo)致操縱子的上調(diào)，介導(dǎo)PEtN 與L-Ara4N 的合成和轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A[21]。

多黏菌素對易感表型抗性的逆轉(zhuǎn)與PhoP和PhoQ基因的非同義突變相關(guān)。在智利的一項(xiàng)研究中，ST25 中PhoP 的104 位氨基酸替換、ST1161 中PhoQ 的A351D 氨基酸替換在黏菌素異質(zhì)性耐藥分離株中被檢測到[22]。另外，PhoP基因的L26Q 突變可導(dǎo)致黏菌素耐藥[23-24]。羅馬尼亞的一項(xiàng)研究提示PhoP基因的L4F 突變、PhoQ基因的L26Q、Q426L、L224Q、Q317K 突變也會增加黏菌素的抗性[25]。此外，Halaby 等[26]在黏菌素異質(zhì)性耐藥（colistin heteroresistant, CST-HR）和產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum betalactamase, ESBL）的KP 分離物中發(fā)現(xiàn)了PhoQ 中的A21S 替代，使黏菌素最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration, MIC） 從2 μg/mL 增 加 到16 μg/mL，表明該氨基酸替代在CST-HR 的表型中發(fā)揮了重要作用。

mgrB基因編碼一個小的跨膜蛋白是PhoP/PhoQ 系統(tǒng)的負(fù)調(diào)控因子。mgrB的突變導(dǎo)致PhoP/PhoQ 雙組分系統(tǒng)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致pmrCAB和pmrHFIJKLM 操縱子的過表達(dá)[27-29]。pmrCAB和pmrHFIJKLM 操縱子的上調(diào)歸因于磷酸化的PmrA，PmrA 被PmrD 激活，而PmrD 反過來又被mgrB破壞導(dǎo)致PhoP 磷酸化激活[9,30]。此外，激活的PhoP 也可直接激活KP 中的pmrHFIJKLM操 縱 子[31]。與TCSs 突 變（PmrA/PmrB 或PhoP/PhoQ）相比，mgrB突變/失活導(dǎo)致KP 對多黏菌素耐藥的作用更大[24]。這一結(jié)果表明，mgrB在KP 的多黏菌素耐藥性中起著重要作用。印度的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IS903 樣和ISKpn26 樣插入元件造成的mgrB的破壞導(dǎo)致KP 對黏菌素敏感性降低[32]。

有研究稱IS5 樣插入元件是KP 中mgrB破壞的主要元素，但I(xiàn)SKpn14（IS1 家族成員）的插入也偶有報道[33-34]。Morales-León 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)IS5 樣和IS1 樣轉(zhuǎn)座子插入序列使mgrB失活，降低了mgrB的mRNA 水平，從而影響多黏菌素的抗性。然而，沙特阿拉伯的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)存 在ISKpn14、ISKpn28、IS903 導(dǎo) 致mgrB基 因破壞，而ISKpn14 是主要的IS，59%的分離株存在mgrB基因破壞是由ISKpn14 介導(dǎo)的[23]。在羅馬尼亞的一項(xiàng)研究中，ISL3（ISKpn25）和IS5（ISKpn26）在不同的核苷酸位置破壞mgrB基因，增加CPKP 的黏菌素抗性[25]。另外，生物信息學(xué)工具預(yù)測mgrB基因M27K 突變，提示同樣是有害的。相比之下，Liu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，MgrB 蛋白的表達(dá)不受M27K 突變的影響。

在Naha 等[10]的研究中，mgrB中的氨基酸替換（C28G，V32G）導(dǎo)致突變是有害的，影響主要功能域，可能調(diào)節(jié)蛋白活性，有助于黏菌素抗性的增加。mgrB的失活也被證明可以通過抑制宿主防御反應(yīng)的啟動和限制多種抗菌肽的作用來增強(qiáng)KP 分離株的毒力[36]。

3.2 PmrA/PmrB系統(tǒng)

KP 的多黏菌素耐藥也歸因于PmrA/PmrB基因的突變，該基因是另一個編碼控制L-Ara4N 和PEtN 合成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)[22,37-38]。

在大腸桿菌和腸道沙門氏菌中，PmrB 作為一種傳感器細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合激酶，被高價鐵（Fe3+）和酸性環(huán)境（pH=5.5）激活。激活后，它通過磷酸化激活PmrA[39]。在體內(nèi)，PmrA/PmrB 參與感知環(huán)境，幫助細(xì)菌在體內(nèi)侵襲上皮細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)生長、細(xì)胞間擴(kuò)散、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，并且與細(xì)菌毒力表達(dá)相關(guān)[40]。PmrA或PmrB基因的突變通常會導(dǎo)致PmrA 的結(jié)構(gòu)性激活，可以上調(diào)pmrCAB 操縱子和pmrHFIJKLM 操縱子，pmrCAB操縱子參與PEtN 對脂質(zhì)A 修飾，而pmrHFIJKLM操縱子編碼的酶負(fù)責(zé)合成和將L-Ara4N 轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A[40]?？偟膩碚f，PmrA 的這種構(gòu)成性激活導(dǎo)致了更多正電荷的LPS，從而降低了帶正電荷的多黏菌素的親和力。

PmrB基因的突變已在具有耐藥性或敏感性降低的KP 分離株中被廣泛描述。一項(xiàng)研究顯示，CRKP 中PmrB基因P95L、T157P、R256G、V352E 突變與黏菌素的耐藥性增加相關(guān)[25]。此外，Jayol 等[41]描述了6 個黏菌素耐藥菌株的PmrB 中一個單一的T157P 氨基酸取代，而這種取代會破壞PmrB 蛋白的α-螺旋二級結(jié)構(gòu)，并連續(xù)激活PmrA，從而產(chǎn)生PmrC 的過表達(dá)，最終導(dǎo)致黏菌素抗性。另一項(xiàng)研究在ST25 和ST11 中也發(fā)現(xiàn)了PmrB 的相關(guān)氨基酸（分別是P95L 氨基酸和A256G 氨基酸）取代導(dǎo)致KP 對黏菌素的耐藥性增加[22]。而Liu 等[35]的研究顯示，PmrB 中的氨基取代D313N 使黏菌素MIC 提高到8 mg/L，比原菌株高16 倍，而PmrB 中的M285L 和PmrA 中的S204L 并沒有增加黏菌素對原菌株的MIC 值。

Wand 等[42]的研究在PmrA中只發(fā)現(xiàn)了G53C突變導(dǎo)致黏菌素MIC 增加到64 mg/L。目前，關(guān)于PmrA基因突變導(dǎo)致多黏菌素耐藥性增加的研究相對較少。

PmrA/PmrB 和PhoP/PhoQ 的突變和構(gòu)成性激活可能共同導(dǎo)致pmrCAB 操縱子和pmrHFIJKLM操縱子的激活，從而導(dǎo)致多黏菌素耐藥性[2,8]。與多黏菌素抗性相關(guān)的PhoP/PhoQ 和PmrA/PmrB 調(diào)控關(guān)系見圖1。

圖1 與多黏菌素抗性相關(guān)的PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB調(diào)控圖Figure 1. Regulatory plots of PhoP/PhoQ and PmrA/PmrB associated with polymyxin resistance

4 其它TCSs對肺炎克雷伯菌的耐藥機(jī)制

進(jìn)化實(shí)驗(yàn)表明，KP 中多黏菌素耐藥性也可能由于CrrB基因的突變而出現(xiàn)[43]。CrrA/CrrB 雙組分系統(tǒng)通過PmrAB 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了對pmrHFIJKLM 和CrrC 操縱子的控制，而CrrB 調(diào)控pmrHFIJKLM 操縱子的表達(dá)是通過CrrC 操縱子介導(dǎo)的[44]。研究發(fā)現(xiàn)，臨床CrrB 突變導(dǎo)致L-Ara4N和PEtN 同時添加到脂質(zhì)A 中，誘導(dǎo)更高的多黏菌素抗性[45]。Naha 等[10]的研究也提示，CrrA/CrrB突變導(dǎo)致KP 對黏菌素產(chǎn)生耐藥性。在羅馬尼亞的一項(xiàng)研究中，CrrB基因罕見的P151S 替換，使異質(zhì)性耐藥KP 的黏菌素MIC ＞64 mg/L[25]。另一項(xiàng)研究已證實(shí)GrrB基因突變可誘導(dǎo)KP 對黏菌素的耐藥性升高，且該研究發(fā)現(xiàn)CrrB基因Q10L、Y31H、W140R、N141I 和S195N 錯義突變均會引起KP 對黏菌素的MIC 值增加64～1024 倍[44]。類似地，Jayol 等[46]報道了一個具有細(xì)微差異的突變，CrrB中的P151L 賦予了黏菌素耐藥性，而Pitt 等[47]證實(shí)了同一基因中的P158R 替換。此外，CrrA/CrrB 可激活PmrA，而CrrB的功能獲得突變可激活導(dǎo)致黏菌素耐藥性的基因表達(dá)，而不受PmrA/PmrB 系統(tǒng)的影響[48-49]。

KP 編碼另外兩種TCSs 為CpxAR 和PhoBR，它們抑制KpnO 孔蛋白，降低了對多種抗生素的敏感性，包括氯霉素、阿米卡星、萘啶酸和四環(huán)素[50-51]。兩個TCSs 都由于OM 在應(yīng)激狀態(tài)下而激活。此外，在KP 中CpxA/CpxR 可同時上調(diào)三個MDR RND 家族外排泵以響應(yīng)OM 應(yīng)激[50]。

TCSs 對多種細(xì)菌的生存發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它為細(xì)菌提供了感知和反應(yīng)周圍環(huán)境的不可或缺的工具。鑒于TCSs 在細(xì)菌穩(wěn)態(tài)中的重要作用以及可通過它們激活的多種抗生素耐藥性機(jī)制，TCSs是開發(fā)新的抗菌療法的一個較好靶點(diǎn)[52-53]。使用預(yù)測軟件來識別結(jié)合一個或多個TCSs 以使其無效的假定化合物的能力，將是藥物靶向TCSs 的一個重要工具[54]。例如PmrB基因，71%的耐藥性非同義突變發(fā)生在Hamp（存在于組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶、甲基接受蛋白和磷酸酶）連接子和DHp（二聚化和組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移）結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)果增強(qiáng)了研究人員對支持多黏菌素耐藥性的調(diào)控機(jī)制的理解，并可能有助于開發(fā)新的策略來減少耐藥性的出現(xiàn)[55]。此外，有研究顯示，與對碳青霉烯類抗生素敏感的菌株相比，CRKP 中OmpK35/36 孔蛋白減少與EnvZ-OmpR、PhoPQ 和BaeSR 等TCSs 的下調(diào)有關(guān)[56]。

5 結(jié)語

耐多藥KP 是一項(xiàng)全球性的公共衛(wèi)生問題。本文通過闡述TCSs 導(dǎo)致KP 對多黏菌素耐藥的機(jī)制，將TCSs 設(shè)想為未來可能的抗菌靶點(diǎn)，為規(guī)劃抗擊KP 耐藥性的策略提供依據(jù)，拓寬耐藥菌研究的視野，從而為未來的研究提供更多思路，并為臨床上更加有效的治療耐多藥KP 感染提供參考。