恒溫實時熒光法快速檢測嬰幼兒輔助食品中胡蘿卜成分的研究

牛會敏， 蔣 靜， 戶瀚文， 王靜怡

（1. 河南省食品和鹽業(yè)檢驗技術(shù)研究院， 河南鄭州 450003；2. 河南省特殊食品工程技術(shù)研究中心， 河南鄭州 450003； 3. 國家市場監(jiān)管重點實驗室（食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù)），河南鄭州 450003）

胡蘿卜是傘形科草本植物，因其獨特的營養(yǎng)價值和保健作用， 常被作為食品配料用于各種飲料、糕點、面食以及功能性食品中[1-3]，尤其在嬰幼兒輔助食品中，其富含的胡蘿卜素能幫助嬰幼兒提高視力和免疫力，抵抗病菌侵襲，促進健康成長[4]。 但胡蘿卜也是一種常見食物過敏原，全世界約25%的過敏反應(yīng)是由食品中的胡蘿卜成分產(chǎn)生的[5]，我國《亞運食品安全食品過敏原標識標注》[6]列出的導致過敏反應(yīng)的食品中，胡蘿卜位列其中，目前關(guān)于胡蘿卜過敏的報道也時有發(fā)生[7-9]。 在嬰幼兒輔助食品的生產(chǎn)銷售中，若標簽標識不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充好謀取利益，或擅自改變產(chǎn)品組成，造成產(chǎn)品的真實屬性與標簽不符， 這種行為不僅涉及經(jīng)濟、營養(yǎng)價值，更直接影響嬰幼兒的健康安全，引發(fā)食源性過敏反應(yīng)。因此，嬰幼兒輔助食品中胡蘿卜成分的真實性檢測是市場監(jiān)管中亟待解決的問題。

環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的等溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計4 條特異引物， 利用一種鏈置換DNA 聚合酶在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應(yīng)[10]，縮短了檢測時間，無需昂貴的溫控和輔助設(shè)備且操作簡單，具有簡單、快速、準確等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于食品中致病微生物檢測[11-12]、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、摻假肉鑒別[13]及動植物病害檢測等方面。 但LAMP 擴增結(jié)果的表達方式有濁度分析法和目視熒光法，這2 種結(jié)果判斷方式都需要靠檢測人員肉眼去觀察，結(jié)果判讀受外界因素的影響較大。

基于LAMP 技術(shù)并結(jié)合實時熒光技術(shù)和恒溫熒光檢測設(shè)備，作者根據(jù)胡蘿卜的ITS1-5.8SRNAITS2基因，設(shè)計特異性引物，建立了快速檢測嬰幼兒輔助食品中胡蘿卜成分的恒溫熒光PCR 方法，旨在為標簽管理、食品安全監(jiān)管和食品質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料從當?shù)爻谢蜣r(nóng)貿(mào)市場購買大豆、玉米、大米、白蘿卜、心里美蘿卜、青蘿卜、水蘿卜、白菜、芹菜、韭菜、花生、核桃等用于特異性試驗。 不同品系的胡蘿卜種子隨機購自農(nóng)貿(mào)市場，用于靈敏度和適應(yīng)性試驗。 用于驗證方法實用性的樣本均為單位抽檢樣品。

1.1.2 主要試劑植物DNA 提取試劑盒、植物內(nèi)源恒溫擴增試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、異丙醇：市售分析純試劑。

1.1.3 主要儀器QuantStudio 7 flex 實時熒光定量PCR 儀：賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備及DNA 提取稱取適量待測新鮮胡蘿卜樣品， 用已滅菌的均質(zhì)杯打碎混合均勻，按照植物DNA 提取試劑盒說明書要求進行DNA 提取。 提取后的DNA 使用核酸蛋白分析儀測定A260nm和A280nm，通過A260nm/A280nm的比值確定DNA 濃度和純度。

1.2.2 引物設(shè)計根據(jù)Genbank 上公布的胡蘿卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因序列，設(shè)計并合成特異性引物， 包括2 條外引物F3 和B3，2 條內(nèi)引物FIP和BIP，2 條環(huán)引物FLP 和BLP，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 胡蘿卜引物序列Table 1 Primer sequences of carrot

1.2.3 恒溫擴增反應(yīng)使用實時熒光定量PCR 儀進行恒溫擴增反應(yīng)， 所有反應(yīng)均設(shè)置空白對照、陰性對照和陽性對照。 反應(yīng)條件為：63 ℃，15 s；63 ℃，45 s，共60 個循環(huán)。 反應(yīng)體系見表2。

表2 恒溫擴增的反應(yīng)體系Table 2 Reaction system of isothermal amplification

1.2.4 胡蘿卜成分恒溫實時熒光法的特異性驗證試驗分別提取常見農(nóng)作物如糧食類：大米、大豆、玉米；堅果類：核桃、花生；蔬菜類：芹菜、白菜、韭菜、白蘿卜、青蘿卜、心里美蘿卜和水果蘿卜等的DNA 作為模板， 用1.2.3 的方法進行胡蘿卜特異性恒溫擴增反應(yīng)。

1.2.5 胡蘿卜成分恒溫實時熒光法的靈敏度試驗稱取新鮮的胡蘿卜10 g、白蘿卜90 g，用均質(zhì)杯充分均質(zhì)混勻，制備成含胡蘿卜質(zhì)量分數(shù)為10%的樣本，取樣本10 g、白蘿卜90 g，充分均質(zhì)混勻，制備成含胡蘿卜質(zhì)量分數(shù)為1%的樣本，同法，分別制備質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%的樣本，分別提取DNA 進行恒溫擴增，確定胡蘿卜源性成分的恒溫擴增檢測靈敏度。

1.2.6 胡蘿卜成分恒溫實時熒光法適用性試驗為驗證引物和方法的適用性，購買不同品系的7 種胡蘿卜種子（改良八寸紅、農(nóng)大紅芯胡蘿卜、三紅特選八寸參、韓紅參王九寸紅、豫豐紅筍908、紅龍?zhí)丶壢t七寸參、新紅秀胡蘿卜），以確定方法的適用范圍。

1.2.7 預(yù)包裝食品中胡蘿卜成分恒溫實時熒光法檢測試驗選擇單位抽檢的7 種食品，其中包括嬰幼兒輔助食品米粉、果泥、面條等（6 種食品標簽標識含有胡蘿卜成分，1 種食品無胡蘿卜成分標識），提取DNA，按照1.2.3 的方法進行檢測，通過核對檢測結(jié)果與標簽標示是否相符，確定本方法檢測實際樣本中胡蘿卜成分的能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 引物特異性試驗

基于胡蘿卜的ITS1-5.8SRNA-ITS2基因設(shè)計的內(nèi)、外及環(huán)引物對胡蘿卜DNA 有顯著擴增，見圖1，對其他11 種常見農(nóng)作物尤其是白蘿卜、心里美蘿卜、青蘿卜等物種均無DNA 擴增，說明該引物對胡蘿卜源性成分恒溫擴增檢測有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應(yīng)。

圖1 胡蘿卜恒溫實時熒光特異性擴增結(jié)果Fig. 1 Results of real-time fluorescence isothermal specific amplification of carrot and others

2.2 靈敏度試驗

提取含有胡蘿卜質(zhì)量分數(shù)為10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%和0.001%樣品的DNA， 分別進行恒溫擴增，結(jié)果見圖2。 結(jié)果顯示，質(zhì)量分數(shù)為10%、1%、0.1%、0.05%、0.01%的樣品均出現(xiàn)典型的“S”形擴增曲線，且隨著胡蘿卜質(zhì)量分數(shù)增加，開始出現(xiàn)指數(shù)擴增的時間越短， 循環(huán)閾值（cycle threshold）越小，而0.005%和0.001%的樣品未呈現(xiàn)典型擴增曲線，因此本檢測方法對胡蘿卜檢測限可低至質(zhì)量分數(shù)0.01%。將新鮮胡蘿卜、白蘿卜樣品粉碎后按比例進行均勻混合，模擬實際樣本的混合情況，相對于直接對DNA 進行梯度稀釋，考慮了DNA提取效率的影響， 因此按質(zhì)量比進行靈敏度的測試，更能準確反映檢測方法的技術(shù)指標。

圖2 胡蘿卜恒溫實時熒光靈敏度檢測擴增結(jié)果Fig. 2 Results of real-time fluorescence isothermal sensitivity amplification of carrot

2.3 適用性試驗

提取不同品系的7 種胡蘿卜種子的DNA，按照1.2.3 的方法，對7 個樣本進行檢測，結(jié)果見圖3。實驗數(shù)據(jù)表明，7 個樣本均獲得典型的熒光擴增曲線， 說明建立的方法能檢測出不同品系的胡蘿卜，方法實用性良好。

圖3 不同品系胡蘿卜的恒溫實時熒光檢測擴增結(jié)果Fig. 3 Amplification results of different cultivars of carrot by isothermal real-time fluorescence amplification

2.4 實際樣本檢測

采用恒溫熒光擴增方法對抽檢的7 種預(yù)包裝食品，其中5 種是嬰幼兒輔助食品的樣本進行胡蘿卜成分檢測，檢測結(jié)果和擴增曲線見表3 和圖4。 7種食品中有6 種檢出胡蘿卜源，標簽標識有胡蘿卜成分的食品均有檢出，與配料表中胡蘿卜成分標識結(jié)果一致，表明作者建立的恒溫擴增方法可用于實際樣本尤其是嬰幼兒輔助食品中胡蘿卜成分的檢測，結(jié)果準確可靠。

3 結(jié) 語

作者設(shè)計了胡蘿卜成分恒溫熒光PCR 法快速檢測的特異性引物和反應(yīng)體系，使用多種不同植物物種進行特異性驗證，證實了該方法具有較高的特異性， 且可在1 h 內(nèi)檢測低至質(zhì)量分數(shù)0.01%的胡蘿卜成分，方法靈敏度較高，采用多種不同品系胡蘿卜進行適用性驗證，適用性廣泛且結(jié)果準確。 同時對多種不同種類的預(yù)包裝食品尤其是嬰幼兒輔助食品進行驗證，證明該方法對成分復(fù)雜、加工程度不同的市售食品中胡蘿卜成分的實際檢測亦有較好的適用性。

作者利用恒溫實時熒光PCR 技術(shù)，建立的胡蘿卜成分快速檢測的新方法，集恒溫擴增、實時熒光檢測、智能數(shù)據(jù)判讀及實時數(shù)據(jù)同步等優(yōu)勢，將樣品中存在的微量胡蘿卜核酸，擴大轉(zhuǎn)化為設(shè)備可讀的熒光信號，快速檢測嬰幼兒輔助食品中的胡蘿卜成分，為嬰幼兒輔助食品的標簽規(guī)范管理及過敏原成分檢測提供了依據(jù)。