蛋黃中免疫球蛋白提取副產(chǎn)物的綜合利用研究

高凈樂， 顧璐萍， 常翠華， 李俊華， 楊嚴俊， 蘇宇杰*

（1. 江南大學食品科學與資源挖掘全國重點實驗室， 江蘇無錫 214122；2. 江南大學國家功能食品工程技術研究中心，江蘇無錫 214122；3. 江南大學食品學院，江蘇無錫 214122）

蛋黃中含有多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)， 氨基酸配比均衡，消化率高達98%，生物學價值高達96，遠遠高于其他動植物性食物蛋白質(zhì)的消化率和生物學價值[1]。此外，蛋黃中還含有免疫球蛋白（immunoglobulin of egg yolk，IgY）、卵磷脂、卵黃高磷蛋白等活性成分，具有極高的營養(yǎng)價值。其中，IgY 因具有良好抑菌活性以及廉價易得、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，有望部分代替抗生素用于細菌感染性疾病的治療及提高免疫力[2]。 與傳統(tǒng)IgY 提取方法相比，凍融-水稀釋法[3]能有效簡化提取流程、提高產(chǎn)品純度，因而成為一種極具應用前景的IgY 提取新方法。 然而，在凍融-水稀釋法提取IgY 過程中將會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物—凍融蛋黃顆粒 （freeze-thaw egg yolk pellet，F(xiàn)YP）。FYP 因經(jīng)過凍融和高速剪切處理而發(fā)生嚴重變性，幾乎喪失其原有的溶解性、乳化性等功能特性，無法直接用于食品加工，大大降低了蛋品的附加值。 此外FYP 中還含有豐富的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值， 若不加以利用而直接丟棄，勢必造成蛋黃資源的嚴重浪費。 因此，如何充分利用FYP 成為IgY 提取與蛋黃資源綜合利用中一個亟待解決的課題。

近年來，限制性酶解技術因能顯著改善蛋白質(zhì)功能性質(zhì)而被廣泛應用于各種蛋白質(zhì)原料，如大豆蛋白[4]、乳清蛋白[5]、蛋黃粉[6]等。 Gu 等發(fā)現(xiàn)限制性酶解可使大分子蛋白質(zhì)分解為小分子的肽或氨基酸，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性[7]；Bao 等認為溶解性與蛋白質(zhì)的其他功能性質(zhì)密切相關，如乳化性等，并對堿性、 中性及風味蛋白酶的水解效果進行了比較，結果表明堿性蛋白酶能更顯著提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[8]。 因而采用限制性酶解將有望改善FYP 的溶解性及其他功能特性，拓寬其應用領域。

此外，針對FYP 不易保存的問題，可將經(jīng)酶解后的FYP 進行噴霧干燥處理，得到酶解蛋黃顆粒干粉（hydrolyzed egg yolk pellet powder，HYP）。HYP 水分含量低，在運輸與保質(zhì)期方面有顯著優(yōu)勢。 然而，其脂肪質(zhì)量分數(shù)為50%~60%， 膽固醇質(zhì)量分數(shù)為20 mg/g，這顯然與目前大眾追求的健康低脂消費觀相違背。 因此，選擇合適的方法對HYP 中的油脂進行分離，一方面可降低蛋黃顆粒中的脂質(zhì)及膽固醇含量， 有利于提高酶解蛋黃顆粒的消費者接受度、拓寬其應用范圍，與此同時又可以制得副產(chǎn)品蛋黃油，進一步提高蛋黃綜合利用率。 目前，蛋黃粉中蛋黃油分離的方法主要包括有機溶劑法、酶法[9]、超臨界萃取法、亞臨界萃取法等。 其中，超臨界和亞臨界萃取技術是2 種新型綠色油脂萃取技術，具有無溶劑殘留，提取率高，保護有益成分等優(yōu)點[10-11]。 且與超臨界萃取技術相比，亞臨界萃取成本更低，常溫萃取、低溫脫溶，易實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應用[12]。 目前國內(nèi)外對于采用亞臨界萃取技術提取蛋黃粉中脂質(zhì)的研究較少。

作者以凍融-水稀釋法提取蛋黃免疫球蛋白之后變性嚴重的凍融蛋黃顆粒副產(chǎn)物為原料，采用限制性酶解結合亞臨界萃取技術，制得低脂蛋黃粉與副產(chǎn)物蛋黃油，對亞臨界萃取工藝進行優(yōu)化，并對產(chǎn)品性質(zhì)進行研究，以期拓寬凍融蛋黃顆粒副產(chǎn)物的應用范圍，進而為蛋黃資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋和葵花籽油： 購自江蘇無錫超市；堿性蛋白酶：購自南寧龐博生物工程有限公司；鄰苯二甲醛（OPA）、1-4-二硫蘇糖醇（DTT）：購自Sigma公司；其余化學試劑：均為分析純，購于國藥化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平（AB204-N）：梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；pH 計：梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；噴霧干燥機（MOBILE MINOR）：基伊埃工程技術（中國）有限公司；冷凍離心機（5430R）：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風干燥器（DGG-9240A）：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀（K9840）：濟南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計（UH5300）： 日本日立公司產(chǎn)品； 高速剪切器（T25 basic）： 德國IKA 公司產(chǎn)品； 激光粒度分析儀（S3500）：美國Microtrac 公司產(chǎn)品；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8100）：日本株式會社日立高新技術公司產(chǎn)品；CBE-5L 亞臨界流體萃取實驗成套設備：河南省亞臨界萃取設備工程技術研究中心產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 凍融蛋黃顆粒（FYP）的制備參考王旭婷等[3]人提取IgY 的方法并作適當修改，人工分離蛋黃和蛋清，并將蛋黃在吸水紙上小心滾動以去除表面殘留蛋清。 用鑷子刺破蛋黃膜，收集蛋黃液，將其放置在（-18±2） ℃的溫度下冷凍8 h，之后在4 ℃的溫度下解凍，得到蛋黃凝膠。 將蛋黃凝膠與去離子水以質(zhì)量比1∶5 混合， 然后用高速剪切機以11 000 r/min 剪切15 s， 再將混合液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min， 得到上清液為IgY 粗提液，沉淀即為FYP。

1.3.2 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）的制備及成分分析將FYP 與去離子水以質(zhì)量比1∶2 混合，25 ℃攪拌30 min，使其混合均勻。 預熱至50 ℃，并用1 mol/L的NaOH 調(diào)節(jié)體系pH 至8.0。 加酶量分別為250、500、1 000、2 000 U/g， 反應4 h， 酶解過程中用1 mol/L 的NaOH 維持體系pH 值恒定，用磁力攪拌器攪拌使FYP 始終保持分散均勻。 酶解過程中每隔0.5 h 取0.4 mL 的水解液， 迅速用冰水浴冷卻至室溫，測定水解度（DH）。 同樣條件處理的未加酶組為對照組。 反應結束后，迅速將水解液用冰水浴冷卻至室溫，經(jīng)噴霧干燥得到酶解蛋黃粉（HYP），噴霧干燥入口溫度175~185 ℃，出口溫度80~90 ℃，適當調(diào)整不同水解度水解液的干燥時的進出口溫度，確保所得干燥產(chǎn)品的流動性基本接近，HYP 在4 ℃下貯存。 對制得的HYP 成分進行測定，水分質(zhì)量分數(shù)按照GB/T 5009.3—2016 中的第一法直接干燥法測定； 蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016 中的凱氏定氮法進行測定；脂肪含量采用氯仿－甲醇改良法[13]測定；磷脂含量參照GB/T 5537—2008 中的鉬藍比色法進行測定，并做適當修改：為排除其他含磷物質(zhì)的干擾，先提取總脂質(zhì)，再測定磷脂含量；膽固醇含量按照Sun 等[14]人的方法進行測定。

1.3.3 水解度（DH）的測定參照文獻[15]的方法對酶解過程中蛋白質(zhì)的水解度（DH）進行測定。首先配置鄰苯二甲醛（OPA）試劑，然后選用L-絲氨酸與OPA 試劑反應制作標準曲線。 將酶解物用去離子水稀釋至4 mg/mL，將400 μL 稀釋液與3 mL OPA 試劑混合， 反應2 min 后用紫外分光光度計測定340 nm 處的吸光度。 根據(jù)標準曲線和公式（1）計算蛋白質(zhì)水解度DH：

式中：DH 為水解度，%；h為每單位質(zhì)量斷裂的肽鍵質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g；htot為每單位質(zhì)量的肽鍵質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g[17]。

1.3.4 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）激光共聚焦分析參照Xu 的方法[18]用激光共聚焦顯微鏡觀察HYP 的微觀結構， 并做適當修改。 將對照組 （未酶解）與HYP 樣品溶解在去離子水中（質(zhì)量比1∶20），室溫下混勻5 min。 分別將尼羅紅和尼羅藍溶于質(zhì)量分數(shù)0.1%丙酮中。 脂肪用尼羅紅染色，蛋白質(zhì)用尼羅藍染色。 取10 μL 尼羅紅和尼羅藍溶液加入1 mL 樣品溶液中，染色20 min，取20 μL 樣品涂布于顯微鏡載玻片上。 蛋白質(zhì)的分析模式：綠色熒光通道發(fā)射波長為488 nm，激發(fā)波長為500~595 nm。 油脂的分析模式：紅色熒光通道發(fā)射波長為633 nm，激發(fā)波長為649~780 nm。 對焦后掃描并保存圖像。

1.3.5 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）溶解度分析溶解度的測定根據(jù)Tang 等[19]的方法并做適當修改，將1 g 樣品和30 mL 去離子水轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，振蕩5 min，然后于8 000 r/min 離心20 min，收集沉淀物，再加入30 mL 去離子水，同樣條件再次離心。最后將所有收集到的沉淀物于鼓風干燥箱中在105 ℃的溫度下干燥8 h。 以公式（2）計算蛋黃粉溶解度S。

式中：S為溶解度，g；m為樣品質(zhì)量，g；m1為沉淀及培養(yǎng)皿總質(zhì)量，g；m2為培養(yǎng)皿質(zhì)量，g。

1.3.6 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）乳化性分析采用比濁法測定樣品的乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）[20]。 將HYP 樣品分散在去離子水中（2 g/dL），室溫下磁力攪拌1 h。 取30 mL 樣品溶液，加入10 mL 葵花籽油，使用高速乳化器以11 000 r/min乳化1 min。 乳化后于0 min 和10 min 時分別從管底吸取100 μL 乳液移至10 mL 的0.1 g/dL 十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液中，然后在500 nm 下測定稀釋溶液的濁度。 ESI 值通過下式計算：

式中：ESI 為乳化后立即測定的吸光度；A0和A10分別為乳液在0、10 min 時的吸光度。

1.3.7 低脂蛋黃粉制備工藝優(yōu)化

1） 亞臨界萃取溶劑選擇 分別選擇丙烷或丁烷作為亞臨界萃取溶劑，制備蛋黃油與低脂酶解蛋黃粉， 以萃取后低脂酶解蛋黃粉中殘油率為指標，選擇最佳萃取溶劑。 具體制備工藝如下：

亞臨界丙烷萃取：稱取適量HYP 樣品，用150目尼龍紗布袋分裝，置于萃取罐，通過設備流量閥送入一定體積丙烷，萃取壓力1.1 MPa，萃取溫度35℃，每次萃取40 min，重復萃取3 次。 然后減壓脫溶，從分離罐底部收集萃取得到的蛋黃油，離心后取上清液置于4 ℃冰箱待分析。 從萃取罐內(nèi)收集剩余低脂酶解蛋黃粉用于進一步分析。

亞臨界丁烷萃?。悍Q取適量HYP 樣品，用150目尼龍紗布袋分裝，置于萃取罐（與丙烷相同），通過設備流量閥送入一定體積丁烷， 萃取壓力0.46 MPa，萃取溫度45 ℃，每次萃取40 min，重復萃取3次。 后續(xù)操作與上述丙烷相同。

2） 亞臨界萃取工藝優(yōu)化 最終選用丙烷作為萃取溶劑，以萃取后低脂酶解蛋黃粉中殘油率為指標，對萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、料液質(zhì)量體積比等可調(diào)工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

萃取溫度： 分別將萃取溫度設定為25、30、35、40、45 ℃，萃取壓力1.5 MPa，萃取時間120 min，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進行萃取。

萃取壓力：分別將萃取壓力設定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 MPa，萃取溫度35 ℃，萃取時間120 min，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進行萃取。

萃取時間： 分別將萃取時間設定為30、60、90、120、150 min，萃取溫度35 ℃，萃取壓力1.5 MPa，按照料液質(zhì)量體積比l g∶9 mL 加入亞臨界丙烷溶劑進行萃取。

料液質(zhì)量體積比：分別將料液質(zhì)量體積比設定為l g∶3 mL、l g∶5 mL、l g∶7 mL、l g∶9 mL、l g∶11 mL，萃取溫度35 ℃， 萃取壓力1.5 MPa， 萃取時間120 min，加入亞臨界丙烷溶劑進行萃取。

1.3.8 低脂蛋黃粉理化與功能性質(zhì)分析

1） 殘油率測定 參照氯仿－甲醇改良法[13]并做適當修改。 稱取1 g 左右的待測蛋黃粉， 加入1.2 mL 去離子水、5 mL 甲醇、2.5 mL 氯仿， 旋渦振蕩2 min，再加入2.5 mL 去離子水和2.5 mL 氯仿，振蕩3 min，使溶液從一相系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成二相系統(tǒng)。 離心分離出氯仿層，用氮氣吹去氯仿，稱質(zhì)量。

2） 粒度分析 將0.1 g 待測蛋黃粉溶于10 mL去離子水，旋渦振蕩5 min，保證蛋黃粉溶液混合均勻[7]。 采用激光粒度分析儀測量不同水解度樣品的粒徑分布。

3） 微觀結構分析 用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察蛋黃粉的微觀結構[21]。 取少量樣品用雙面膠固定，鍍金并進行觀察。 每個樣品選取放大倍數(shù)1 000和2 000 觀察并拍攝。

4） 溶解度分析 方法同1.3.5。

5） 乳化性分析 方法同1.3.6。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3 次， 實驗結果表示為平均值± 標準偏差。 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件的Duncan法檢驗進行顯著性分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。 實驗數(shù)據(jù)采用OriginPro 2018C 繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）成分分析

對HYP 進行成分分析，結果如表1 所示。 與對照組（未酶解）相比，酶解處理步驟并未顯著改變蛋黃粉主要營養(yǎng)物質(zhì)的含量。 經(jīng)過提取IgY 后剩余的HYP 仍然具有較高的營養(yǎng)價值，需要對其進行合理處理以實現(xiàn)蛋黃資源的充分開發(fā)利用。

表1 HYP 成分分析Table 1 Composition analysis of HYP

2.2 加酶量對酶解液水解度的影響

如圖1 可知，不同酶添加量的條件下，蛋黃顆粒水解度呈現(xiàn)相同的變化趨勢，蛋黃顆粒的快速酶解發(fā)生在反應最初的0.5 h 左右， 之后水解度上升趨勢明顯減緩，經(jīng)4 h 左右，酶解反應基本達到平衡狀態(tài)，該變化趨勢與Gu 等[7]人的研究結果一致。 此外， 當加酶量分別為250、500、1 000 和2 000 U/g時，隨著加酶量的增加，最終的DH 值逐漸升高，最終DH 分別為8.0%、11.22%、13.85%和13.99%。 這是由于體系中酶分子越多，與底物分子的接觸概率越大，蛋白質(zhì)被酶解產(chǎn)生氨基酸和小肽的量增加從而導致水解度提高。 當加酶量超過1 000 U/g 時，體系的最終水解度值基本無差異，這可能是由于在此加酶量條件下， 酶對底物的作用位點已趨于飽和，進一步增大加酶量對水解度的提高作用有限。 為了區(qū)分各組樣品，后續(xù)以加酶量來表示不同樣品。

圖1 不同加酶量下的酶解液水解度變化Fig. 1 Degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysate under different enzyme dosages

值得注意的是，與未經(jīng)凍融處理的新鮮蛋黃的酶解研究結果相比，本研究在相同的加酶量和反應時間下可以獲得相對較高的DH[7]。 這可能是由于IgY 提取過程中的凍融及剪切操作， 導致蛋黃脂蛋白結構被破壞，從而使堿性蛋白酶可以更好地與底物接觸，促進酶水解。

2.3 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）微觀結構分析

為了獲得樣品的微觀結構信息，采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在HYP 中的分布情況。 如圖2 所示，能夠從對照組樣品清楚地觀察到HYP 是由內(nèi)部的油滴和外部的蛋白質(zhì)共同構成的顆粒組成的，對照組樣品與原蛋黃粉相比具有更小的粒徑[7]，顆粒表面可以清晰觀察到許多孔洞，這可能與之前的凍融和剪切處理有關。 經(jīng)酶解處理后，顆粒尺寸變得更小、更為均一，這些結構上的變化可能導致隨著水解度的增加，樣品的溶解度逐漸增加。 值得注意的是，當水解程度較低時，沒有出現(xiàn)游離的脂肪滴，然而，當加酶量達到500~1 000 U/g時，可以觀察到許多游離的紅色脂肪滴，這可能是由于當處于較低的水解度時，顆粒的結構尚未被破壞，仍然保持其包裹脂質(zhì)分子的結構，隨著加酶量的增加，蛋黃顆粒表面的蛋白質(zhì)被水解，從而導致內(nèi)部脂質(zhì)的釋放[7]。 當加酶量達到1 000 U/g 時，出現(xiàn)相對較大的游離脂肪滴，這可能是由于此時蛋黃顆粒結構被嚴重破壞，更多的脂質(zhì)被釋放并聚集從而形成了較大的脂肪滴。 但當加酶量進一步增加到2 000 U/g 時，游離的脂肪滴反而減少，同時出現(xiàn)一些尺寸較大的顆粒， 可能是因為隨著水解度提高HYP 的乳化性逐漸提高， 游離的脂肪滴被重新乳化，蛋黃顆粒非極性表面之間發(fā)生疏水相互作用而聚集在一起[19]。

圖2 HYP 及對照組的激光共聚焦圖Fig.2 CLSM micrographs of HYP and the control group

2.4 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）溶解度分析

蛋白質(zhì)的溶解性與其他功能性質(zhì)如乳化性、發(fā)泡性等密切相關，因此被認為是其最基本的理化性質(zhì)。 如圖3 所示，HYP 的溶解度與對照組相比顯著提高。 此外，在相對較低的加酶量條件下，樣品的溶解度提高趨勢明顯， 而隨著加酶量的進一步增大，溶解度上升速度趨緩， 直到達到一個相對恒定值，這與Gao 等電泳觀察到的結果一致[22]。 水解程度對蛋白質(zhì)的溶解性具有積極的作用，當水解程度較高時，形成的多肽相對分子質(zhì)量較小，溶解性更佳，這主要歸因于小分子多肽表面具有較多的極性氨基酸殘基，易與周圍溶劑環(huán)境的水分子形成更多的氫鍵[23]。 此外，有報道稱卵黃高磷蛋白質(zhì)和HDL 在自然條件下通過鈣磷橋形成的不溶性復合物在水解過程中被破壞也會促使蛋白質(zhì)溶解度提高[24]。

圖3 HYP 及對照組的溶解度Fig. 3 Powder solubility of HYP and the control group

2.5 酶解蛋黃顆粒干粉（HYP）乳化性分析

乳化性是蛋黃的一項重要的功能特性，可賦予產(chǎn)品所需要的口感和質(zhì)感。 通過測定ESI 和EAI 來觀察酶解處理對樣品乳化性的影響。 如圖4 所示，樣品的EAI 沒有顯著差異（P<0.05），而乳化液的穩(wěn)定性隨著加酶量的增加而顯著提高，這可能與HYP粒徑的減小和溶解度的增加密切相關。 據(jù)報道粒徑越小，越有利于形成更均勻、更穩(wěn)定的乳狀液[25]。此外， 較高的表面疏水性也有助于提高乳化性能，這可能由于酶解產(chǎn)生的多肽可通過與油滴相互作用從而形成更強的界面膜[26]。還有研究認為，酶解產(chǎn)生的同時具有親水和疏水基團的小肽段轉(zhuǎn)移到油水界面上，也可能通過降低界面張力而起到穩(wěn)定乳液的作用[24]。

圖4 HYP 及對照組的乳化性質(zhì)Fig. 4 Emulsifying properties of HYP and the control group

2.6 蛋黃粉殘油率對比分析

如圖5 所示，原蛋黃粉（OEYP）、亞臨界丙烷萃取后的蛋黃粉（EYP-P）及亞臨界丁烷萃取后蛋黃粉（EYP-B） 的脂肪質(zhì)量分數(shù)分別為58.75%、37.00%、45.25%。 由此可見，與丁烷相比，亞臨界丙烷顯示出了對蛋黃粉中油脂更強的提取能力。

圖5 亞臨界丙烷和丁烷萃取后蛋黃粉脂肪質(zhì)量分數(shù)分析Fig. 5 Analysis of the fat content of egg yolk powder after subcritical propane and butane extraction

2.7 亞臨界萃取工藝優(yōu)化

由亞臨界丙烷和丁烷萃取對低脂蛋黃粉殘油率指標的分析可知，亞臨界丙烷對蛋黃油的萃取效果優(yōu)于丁烷。 此外，前期的研究結果顯示，與亞臨界丙烷相比，采用亞臨界丁烷萃取時低脂蛋黃粉中磷脂的保留率更低，降低了產(chǎn)物低脂蛋黃粉的營養(yǎng)價值。 因而作者最終選擇亞臨界丙烷作為萃取溶劑，并進一步對亞臨界丙烷萃取技術的工藝參數(shù)包括萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、料液比等進行優(yōu)化。

2.7.1 萃取溫度由圖6（a）可知，當萃取溫度從25℃升高到35 ℃時，萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢，在35 ℃時殘油率達到最低值，若繼續(xù)提高萃取溫度，蛋黃粉殘油率反而呈上升趨勢。 這可能是由于溫度適當升高可有效增大丙烷溶劑的揮發(fā)性和擴散系數(shù)，從而更好溶解蛋黃脂質(zhì)，使得蛋黃油提取率提高；然而當溫度過高時，萃取溶劑在萃取釜中易氣化，萃取過程中傳質(zhì)推動力減小，油脂提取率反而降低[27]。 另外，萃取溫度過高會增加能耗， 并會導致脂質(zhì)中磷脂等活性物質(zhì)的變性與降解，故萃取溫度宜選擇35 ℃。

圖6 萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、料液體積質(zhì)量比對蛋黃粉殘油率的影響Fig. 6 Effect of temperature, pressure, time and solid-liquid ratio on the residual oil rate of egg yolk powder

2.7.2 萃取壓力由圖6（b）可知，當萃取壓力從0.5 MPa 升高到1.5 MPa 時， 萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢，繼續(xù)增大萃取壓力，殘油率未發(fā)生顯著改變。 原因可能是由于在溫度不變的條件下，當萃取壓力達到一定值時，丙烷對甘油三酯和膽固醇的溶解趨于飽和，而進一步提高萃取壓力反而使丙烷的傳質(zhì)效率降低，萃取效率隨之降低。 故萃取壓力宜選擇1.5 MPa。

2.7.3 萃取時間由圖6（c）可知，當萃取時間從30 min 增加到120 min 時， 萃取后蛋黃粉殘油率呈明顯下降的趨勢，繼續(xù)延長萃取時間，殘油率下降不顯著。 且隨著萃取時間的延長，能量消耗增大，萃取成本提高。 因此， 考慮實際需求， 萃取時間為120 min 最適宜。

2.7.4 料液質(zhì)量體積比由圖6（d）可知，隨著液化丙烷體積的增加， 萃取后蛋黃粉殘油率顯著下降，但是當料液質(zhì)量體積比超過1 g∶7mL 時， 殘油率下降不顯著，且丙烷溶劑的消耗增加也會提高萃取成本。 因此，綜合考慮殘油率與成本需求，選擇1 g∶7 mL 作為最合適的料液質(zhì)量體積比。

綜上，亞臨界丙烷萃取脫除HYP 中脂質(zhì)的最佳條件為：溫度35 ℃，壓力1.5 MPa，時間120 min，料液質(zhì)量體積比為1 g∶7 mL。此條件下，不同加酶量的HYP 經(jīng)過亞臨界丙烷萃取后，所得低脂酶解蛋黃粉的殘油率分別為26.00%、23.25%、19.25%、15.50%、20.23%。

2.8 低脂蛋黃粉理化與功能特性分析

2.8.1 粒度分析如圖7 所示， 與對照組相比，酶解后的蛋黃顆粒樣品整體呈現(xiàn)出更小的粒徑。 隨著加酶量的增加，樣品的粒徑逐漸變小。 表明隨著加酶量的增加， 蛋黃脂蛋白的結構被破壞愈發(fā)嚴重，更有助于脂質(zhì)溶出。 這也在一定程度上能夠解釋亞臨界萃取后蛋黃粉中殘油率會隨加酶量的增加而下降的現(xiàn)象。

圖7 蛋黃粉的粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of egg yolk powder

2.8.2 微觀結構分析掃描電鏡（SEM）結果表明經(jīng)過亞臨界萃取處理后蛋黃粉的微觀結構會發(fā)生顯著變化，如圖8 所示。 與對照組（只剪切，未酶解）相比，HYP 經(jīng)亞臨界丙烷萃取后結構被破壞愈發(fā)嚴重，這更有助于蛋黃油的提取。 隨著酶解程度的增大，HYP 的平均尺寸明顯減小，聚集減少。但當加酶量為2 000 U/g 時， 蛋黃顆粒干粉出現(xiàn)聚集結塊現(xiàn)象。 這可能是由于堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)生了大量的小分子， 而水解暴露的疏水基團與脂蛋白結合，導致微小顆粒的大量聚集結塊[28]。 此外當加酶量較高時樣品粒度過細，樣品在萃取罐中更易受萃取壓力擠壓而結塊，在一定程度上阻礙了亞臨界溶劑對樣品的滲透和油脂的提取，從而使得萃取后蛋黃粉的殘油率較高。 這一結果與低脂蛋黃粉殘油率測定結果一致。

圖8 蛋黃粉的掃描電鏡圖Fig. 8 SEM images of egg yolk powder

2.8.3 溶解特性分析如圖9 所示，由HYP 提油制得的低脂蛋黃粉的溶解度均顯著高于未酶解組。 與脫脂前HYP 的溶解度相比較，經(jīng)亞臨界萃取后低脂蛋黃粉的溶解度大多會進一步提高，但當加酶量達到2 000 U/g 時，HYP 經(jīng)亞臨界丙烷萃取后所得低脂蛋黃粉的溶解度反而下降。 這可能是由于水解度較高時產(chǎn)生蛋黃顆粒較小，在亞臨界萃取過程中顆粒易產(chǎn)生顆粒聚集結塊現(xiàn)象，從而導致蛋黃粉的溶解度變差。 由此可見，經(jīng)酶解和亞臨界萃取步驟得到的低脂蛋黃粉具備良好的溶解性能。

圖9 蛋黃粉的溶解性Fig. 9 Solubility of egg yolk powder

2.8.4 乳化特性分析如圖10（a）所示，與對照組（未酶解）相比，低脂蛋黃粉的乳化活性無顯著性差異， 而乳化穩(wěn)定性隨著加酶量的增加顯著提高，當加酶量達到1 000 U/g 時，乳化穩(wěn)定性達到最大值，這與HYP 的乳化穩(wěn)定性變化趨勢基本一致。 蛋黃粉的乳液宏觀結果（20 min 內(nèi)）如圖10（b）所示，低脂蛋黃粉的乳化性能明顯優(yōu)于對照組。 由此可見，經(jīng)酶解和亞臨界萃取步驟得到的低脂蛋黃粉具備良好的乳化性能。

圖10 蛋黃粉的乳化性質(zhì)Fig. 10 Emmlsion properties of egg yolk powder

3 結 語

以凍融-水稀釋法提取蛋黃免疫球蛋白后剩余變性嚴重的凍融蛋黃顆粒為原料，采用限制性酶解制備酶解蛋黃顆粒干粉（HYP），并進一步結合亞臨界萃取工藝制備低脂蛋黃粉產(chǎn)品。 結果顯示，酶解處理可以顯著影響HYP 的結構和功能性質(zhì)，破壞脂蛋白結構，有助于提高亞臨界萃取脫脂效率。 當酶添加量為1 000 U/g 時，在萃取溫度35 ℃，壓力1.5 MPa，時間120 min，料液質(zhì)量體積比為1 g∶7 mL 的最優(yōu)萃取條件下進行亞臨界丙烷萃取，得到低脂蛋黃粉的殘油率僅為15.50%。 作者制備的HYP 和低脂蛋黃粉均呈現(xiàn)良好的溶解和乳化性能，可根據(jù)不同應用場合作為食品加工原料加以利用，有效提高蛋黃資源的綜合利用效率。 同時采用亞臨界萃取技術還可制得副產(chǎn)物蛋黃油，具備進一步開展深入研制新產(chǎn)品的潛力。 因而本研究方法可有效解決凍融-水稀釋法提取免疫球蛋白后剩余蛋黃顆粒功能性差、利用率低的問題，提高蛋黃產(chǎn)品附加值，有望拓寬蛋制品深加工的產(chǎn)業(yè)鏈，推動蛋黃資源的綜合利用。