豬源多殺性巴氏桿菌莢膜血清PCR分型鑒定

喬曉光

（河南省長垣市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南新鄉(xiāng) 453400）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬成員，革蘭氏染色陰性，球桿菌或短桿狀菌，需氧或兼性厭氧，無鞭毛、無芽胞、無運動性，能夠引起多種畜禽出血性敗血癥或傳染性肺炎[1]。多殺性巴氏桿菌的血清型較多，根據(jù)其莢膜抗原差異，多殺性巴氏桿菌可分為A、B、D、E、F 等5 種血清型[2]。不同血清型對宿主有不同的易感性，如多殺性巴氏桿菌血清型A 和D 型通常與豬的肺炎和胸膜炎有關(guān)，血清型B 和E 型菌株與牛出血性敗血病有關(guān)[3,4]，此外多殺性巴氏桿菌血清型不同，其交叉免疫保護(hù)力較差，因此，對病原鑒定時有必要鑒定其血清型。

本研究對河南省長垣市部分養(yǎng)豬場發(fā)病豬采集鼻咽拭子進(jìn)行多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定，并進(jìn)行PCR 莢膜血清型檢測和分離株對抗菌藥物耐藥性的檢測，以期為豬多殺性巴氏桿菌病防治和疫苗研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

采集長垣市部分養(yǎng)豬場疑似豬肺疫、豬萎縮性鼻炎病豬的鼻拭子127 份，裝入含有TSB 液體的培養(yǎng)基收集管中，送實驗室4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗材料和試驗動物

胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA，含有5%犢牛血清和5%脫纖維綿羊血）、酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）均購自天津一方科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京） 有限公司；2×Taq PCR Master Mix 由Solarbio 公司生產(chǎn)；抗生素藥敏紙片，細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。5 周齡SPF 級小鼠55 只，購自河南科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將127 份病料分別接種于含有5%犢牛血清和5%脫纖維綿羊血TSA 培養(yǎng)基中，37℃純化培養(yǎng)24 h，然后挑取單個菌落制作涂片，對菌落分別進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，油鏡觀察細(xì)菌染色和形態(tài)特性。

1.4 生化鑒定試驗

挑取純化的分離菌落，按照細(xì)菌生化鑒定說明書分別接種于蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、硝酸鹽、枸櫞酸鹽、麥芽糖、V-P、M-R、硫化氫、蛋白胨水、甘露醇、H2S 等細(xì)菌生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.5 分離菌株16S rRNA 鑒定

取純化的分離菌株，接種于含有5%犢牛血清的TSB 培養(yǎng)基中，搖床震蕩，37℃培養(yǎng)24 h，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA。參考朱飛舟等[5]合成細(xì)菌16S rRNA 通用引物，引物序列為：27F：5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。預(yù)期擴(kuò)增目的片段1 450 bp。PCR 反應(yīng)體系20 μL：分離菌株DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH2O 補足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃5 min，94℃30 s，53℃30 s，72℃60 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲取的目的片段，經(jīng)回收后送中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行分離菌株16S rRNA 測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫收錄的多殺性巴氏桿菌基因組序列進(jìn)行BLAST 同源性比對分析，以鑒別分離菌株種類。

1.6 莢膜血清型PCR 鑒定

參照李紅婕等[6]設(shè)計的莢膜血清型特異性引物capA、capB、capD、capE、capF 序列，分別合成引物，由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。除所有鑒定引物退火溫度均為55℃外，其他PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與上述1.5 內(nèi)容相同。引物生物信息見表1。

表1 多殺性巴氏桿菌莢膜血清型鑒定引物生物信息

1.7 對小鼠的致病性試驗

用無菌生理鹽水稀釋純培養(yǎng)菌落，分光光度計測定菌液濃度，使其終濃度為1×108CFU/mL。將5 周齡SPF 昆明小鼠分成1 個對照組和10 個試驗組，每組5只。試驗組腹腔注射菌液0.2 mL/只，對照組注射等體積的生理鹽水。觀察小鼠精神狀態(tài)，記錄死亡時間和數(shù)量。采集死亡小鼠肝臟、肺臟、脾臟等組織器官，分離培養(yǎng)和革蘭氏染色、瑞氏染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌染色鏡檢與分離鑒定

本研究共有10 株分離菌在含有綿羊血和犢牛血清的TSA 培養(yǎng)基上形成稍微隆起、表面光滑濕潤、呈露珠狀的灰白色圓形菌落（圖1A）；鏡檢觀察到分離菌革蘭染色為陰性，菌體呈兩極濃染的短桿狀、圓形或卵圓形（圖1B）。瑞氏染色鏡檢可見藍(lán)色兩極濃染、大小不一的短球桿菌（圖1C）。

圖1 A：分離菌在TSA 培養(yǎng)基上的菌落特性；B：革蘭氏染色鏡檢（10×100）；C：瑞氏染色鏡檢（10×100）

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

分離菌在接種于細(xì)菌生化鑒定管培養(yǎng)后，生化試驗結(jié)果顯示上述10 株分離菌均發(fā)酵果糖、蔗糖、麥芽糖，硝酸鹽、甘露醇、過氧化氫和蛋白胨水試驗結(jié)果為陽性；M-R、V-P 試驗結(jié)果為陰性；基本符合多殺性巴氏桿菌的生化特征。對10 株分離菌命名分別編號為CY01～CY10。

2.3 分離菌的16S rRNA 鑒定

利用PCR 擴(kuò)增分離菌16S rRNA 基因獲得1 條長度為1 450 bp 的特異性條帶（圖2），符合預(yù)期目的基因片段大小。測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫的豬多殺性巴氏桿菌參考菌株序列進(jìn)行BLAST 同源性比對，結(jié)果顯示分離菌的16S rRNA 基因序列與豬多殺性巴氏桿菌的序列相似性均為100%。結(jié)合分離菌培養(yǎng)特性和生化試驗結(jié)果，表明這10 株分離菌為豬多殺性巴氏桿菌，其檢出率為7.87%（10/127）。

圖2 分離菌株莢膜血清PCR 分型鑒定電泳結(jié)果

2.4 分離菌莢膜血清PCR 分型鑒定

利用多殺性巴氏桿菌莢膜血清特異性基因引物進(jìn)行PCR 鑒定（圖3），結(jié)果顯示有3 株分離菌株提取的基因片段中，擴(kuò)增的目的條帶長度約為648 bp，符合capD，占30.00%；1 株分離菌目的條帶約為760 bp，符合capB，占10.00%；6 株分離菌長度約為1 050 bp，符合capA，占60.00%。

圖3 10 株分離菌株莢膜血清型PCR 分型電泳結(jié)果

2.5 小鼠致病性試驗結(jié)果

試驗組小鼠于注射菌株后3 h 開始精神不振，呆立顫抖，8 h 后陸續(xù)出現(xiàn)死亡，36 h 內(nèi)死亡34 只。剖檢可見小鼠肝臟、肺臟等器官出血腫脹。無菌采集死亡小鼠肝臟、肺臟病料接種于TSA 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)出的菌落形態(tài)特性以及革蘭氏染色和瑞氏染色鏡檢結(jié)果均與上述分離菌一致。

3 討論

豬多殺性巴氏桿菌廣泛存在于養(yǎng)豬環(huán)境和豬體正常菌群內(nèi)，是一種條件致病菌，通常在豬體免疫下降或外界環(huán)境應(yīng)激作用下發(fā)病，并且與其他病原體混合協(xié)同感染豬體，增加診斷和防治的難度。目前多殺性巴氏桿菌的檢測技術(shù)主要是分離鑒定、PCR、ELISA、限制性酶切分析和DNA 雜交等，其中應(yīng)用較普遍、靈敏快速的是PCR 檢測，而PCR 檢測擴(kuò)增用引物大多根據(jù)多殺性巴氏桿菌16S rDNA 確定[7,8]，16S rDNA 基因序列越來越多地用于細(xì)菌的鑒定和分類，PCR 技術(shù)是在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，以母鏈DNA 為模板，經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸等反應(yīng)程序，體外擴(kuò)增復(fù)制出與母鏈模板DNA 互補的子鏈DNA[9]。

多殺性巴氏桿菌莢膜決定其致病力，不同莢膜血清型致病力存在差異，且它們之間交叉免疫保護(hù)力較弱，因此，莢膜血清分型鑒定對提高診治效率和有效性具有重要意義。彭忠等[10]報道，當(dāng)前在我國豬群中流行的多殺性巴氏桿菌主要為A 型和D 型菌株。張哲瑋等[11]對來自廣西、湖北、內(nèi)蒙古3 個地區(qū)規(guī)?；i場中有呼吸道癥狀豬的口鼻拭子及組織病料進(jìn)行病原菌分離鑒定。結(jié)果顯示，分離得到6 株豬多殺性巴氏桿菌，其中血清A型1 株、血清D 型5 株。林星宇等[12]從四川、重慶、云南等地8 個規(guī)?；B(yǎng)殖場的125 份病死豬肺炎樣品中，分離出11 株多殺性巴氏桿菌，其中有7 株為A 血清型（63.6%）、3 株為D 血清型（27.3%）。本研究結(jié)果顯示，從河南長垣市豬群采集的127 份病料中，分離鑒定出10株多殺性巴氏桿菌，檢出率為7.87%，優(yōu)勢莢膜血清流行株為A 型（60.00%）和D 型（30.00%），與上述學(xué)者報道結(jié)果相一致，且符合我國動物源多殺性巴氏桿菌血清型多為莢膜A 型的流行情況[13-15]。本次動物致病力試驗小鼠死亡率較高，為68.00%（34/50），表明多殺性巴氏桿菌致病性較強(qiáng)。本研究雖然采樣數(shù)量偏少，但也可以說明多殺性巴氏桿菌病在該地有一定的流行性，應(yīng)引起重視。

4 小結(jié)

本研究對河南省長垣市部分豬場多殺性巴氏桿菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、生化鑒定、PCR 分子鑒定和莢膜血清分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從127 份鼻拭子樣品中檢測出10 株多殺性巴氏桿菌，檢出率為7.87%，血清A 和D 型為當(dāng)?shù)刂饕獌?yōu)勢血清型，動物試驗證明分離菌株致病菌毒力較強(qiáng)。應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，開展綜合防治。