伊犁河谷豬瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒污染情況調(diào)查

王傳鋒 米青婕 皮志媛

（伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000）

豬瘟的防控主要依靠疫苗免疫，但豬瘟疫苗在臨床使用過程中常常出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。研究表明，這與外源病毒的干擾有關(guān)，其中BVDV 的干擾是豬瘟疫苗免疫失敗的重要原因之一。BVDV 自然感染豬會出現(xiàn)類似豬瘟的臨床癥狀，主要包括仔豬生長發(fā)育不良、僵豬、貧血、結(jié)膜炎和腹瀉等。豬感染BVDV 后表現(xiàn)出的具體臨床癥狀和病理變化也不盡相同，如仔豬先天性感染BVDV 可產(chǎn)生抗體，也可發(fā)展為持續(xù)性感染，并在感染后數(shù)天內(nèi)死亡；母豬自然感染BVDV 后可出現(xiàn)受孕率降低、流產(chǎn)和產(chǎn)死胎等現(xiàn)象；肥豬感染BVDV 后主要以慢性胃腸炎和敗血癥為特征，類似于慢性豬瘟。BVDV 廣泛存在于胎牛血清中，豬瘟疫苗的研制不可或缺的要使用胎牛血清，若使用了被BVDV 污染的胎牛血清，則該病毒會大幅降低豬瘟疫苗的免疫質(zhì)量，導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗。因此，檢測胎牛血清和豬瘟疫苗中是否存在BVDV污染意義重大。本文采用實(shí)時熒光定量（RT-PCR）方法對伊犁河谷市售豬瘟疫苗和胎牛血清進(jìn)行BVDV 檢測，以期為養(yǎng)豬企業(yè)選擇豬瘟疫苗提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNA 提取試劑盒和熒光定量PCR 試劑均購自大連寶生物公司；CFX96 熒光定量PCR 儀購自美國BIO-RAD 公司。低溫高速冷凍離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。渦旋振蕩器購自深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋購自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 豬瘟疫苗和胎牛血清

新疆伊犁河谷地區(qū)市面所售的來自不同廠家的豬瘟疫苗和胎牛血清，具體信息見表1。

表1 待檢生物制劑樣品信息

1.3 引物合成

參照陳其兵等[1]合成引物及探針的方法，設(shè)計(jì)熒光定量所需引物及探針，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

上游引物PF 5’-GAGTACAGGGTAGTCGTCAGT GG-3’

下游引物PR 5’-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3’

熒光探針PB 5’FAM-AGATGCCACGTGGACGAG GGC-BHQ1 3’

1.4 RNA 的提取

取稀釋后的豬瘟疫苗250 μL 加入750 μL Trizol，振蕩混勻后室溫放置5 min，再加入氯仿溶液250 μL，充分振蕩混勻后室溫放置10 min，4℃12 000 rpm 離心15 min，取500 μL 上清液，加入等量的異丙醇溶液混勻，靜置30 min 后，4℃12 000 rpm 離心10 min，棄去上清，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀物，4℃12 000 rpm 離心5 min 棄去上清，將離心管在室溫下靜置干燥20 min，然后加入30 μL ddH20，充分溶解后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量RT-PCR

反應(yīng)體系為：2×One Step RT-PCR BufferⅢ10 μL，10 μM TaqMan 探針0.4 μL，10 μM 上游引物0.4 μL，10 μM 下游引物0.4 μL、TaKaRa ExTaq HS 0.4 μL、Prime-Script RT Enzyme MixⅡ0.4 μL、Rox Reference Dye 0.4 μL、DEPC H2O 5.6 μL、模板2 μL。

反應(yīng)條件為: 42℃5 min，95℃10 s；95℃5 s，60℃40 s（收集熒光FAM，40 個循環(huán)）。

2 結(jié)果與分析

對來自伊犁河谷地區(qū)市場上銷售的11 份豬瘟疫苗和12 份胎牛血清進(jìn)行BVDV 實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測。結(jié)果顯示，豬瘟疫苗中共檢出2 份BVDV 陽性樣品，陽性率為18.2%，陽性樣本均為細(xì)胞源豬瘟疫苗，分別來自于國內(nèi)疫苗生產(chǎn)廠家B 和E。胎牛血清檢出1份BVDV 陽性樣品，陽性率為8.3%，陽性樣本為H 生產(chǎn)廠家H-1 批號樣品，具體見表2。

表2 伊犁河谷地區(qū)市售生物制劑樣品中BVDV 感染情況檢測結(jié)果

3 討論

3.1 BVDV 感染對豬瘟疫苗的免疫干擾

在國內(nèi)豬瘟弱毒疫苗中，時常有豬瘟疫苗被外源病原污染的報(bào)道，且污染源常為牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和支原體[2]。牛病毒性腹瀉病毒自首次被報(bào)道以來，在全世界很多畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家中流行[3]，如澳大利亞、德國等國家的豬群中BVDV 抗體陽性率達(dá)3%～40%，荷蘭達(dá)15%～20%。各種年齡的牛都可感染牛病毒性腹瀉病毒，以幼齡牛易感性最高，在垂直傳播后，會產(chǎn)生病毒血癥[4]。

受BVDV 感染的豬瘟疫苗，往往會導(dǎo)致豬瘟免疫失敗。主要原因是BVDV 可以對豬瘟疫苗的免疫產(chǎn)生干擾，不僅能抑制豬瘟抗體的產(chǎn)生，而且還可以刺激豬體產(chǎn)生大量的BVDV 抗體。因此，在生產(chǎn)過程中豬場內(nèi)豬瘟抗體明明很高，但卻依然時有豬瘟的發(fā)生，究其原因是在檢測的抗體中，豬瘟保護(hù)抗體很少，大部分可能為BVDV 抗體[5]。

3.2 BVDV 存在于胎牛血清中造成豬瘟弱毒疫苗的污染

目前，我國規(guī)?；鲋信２《拘愿篂a病毒的感染率很高，很多地方對該病還未引起足夠重視。陶潔等[6]于2017—2020 年間對上海不同區(qū)豬場的血液樣品，利用多重RT-PCR 方法進(jìn)行BVDV 檢測與分析。結(jié)果表明，上海地區(qū)豬群BVDV 的總體檢出率為7.14%，且呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢。筆者曾調(diào)查過伊犁地區(qū)規(guī)?；鯞VDV 的感染率，個別牛場的感染率高達(dá)90%以上。胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)的重要原料，以含BVDV 的血清作為原料時，就會污染所制備的生物制品[7]，如豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)過程中會使用到牛睪丸細(xì)胞及胎牛血清，在豬繁殖與呼吸綜合癥（藍(lán)耳病）疫苗生產(chǎn)工藝的傳代細(xì)胞培養(yǎng)中也會使用到胎牛血清，如果胎牛血清中含有BVDV 病原或抗體，會使豬瘟細(xì)胞苗和豬藍(lán)耳病疫苗遭到污染[8]。溫樹波等[9]從進(jìn)口胎牛血清中成功分離到1 株非致細(xì)胞病變型BVDV 1b 亞型毒株。李艷萍等[10]從商品化的胎牛血清中分離到1 株致細(xì)胞病變（CP） 型BVDV（GS2018 株）。張超等[11]從進(jìn)口胎牛血清中分離出1 株BVDV-2 型非致細(xì)胞病變毒株，從脫脂奶粉中檢測到BVDV 抗體，表明進(jìn)口胎牛血清和脫脂奶粉中都存在BVDV 抗原和抗體污染。鞠厚斌[12]等對國內(nèi)市售的胎牛血清進(jìn)行熒光RT-PCR 檢測牛病毒性腹瀉病毒。結(jié)果顯示，胎牛血清BVDV 核酸陽性率為50%。劉陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)豬瘟脾淋苗與細(xì)胞苗都能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，無論是標(biāo)準(zhǔn)劑量還是加大劑量，細(xì)胞苗的免疫效果都優(yōu)于脾淋苗。

細(xì)胞苗的廣泛使用，一定程度上增加了豬瘟疫苗被BVDV 污染的風(fēng)險(xiǎn)。這給疫苗的使用和推廣帶來了很多潛在的風(fēng)險(xiǎn)，使用無BVDV 污染并且無BVDV 抗體的牛供應(yīng)細(xì)胞和血清是生產(chǎn)高安全性豬瘟疫苗的關(guān)鍵。加強(qiáng)對疫苗等生物制劑的制作工序及生產(chǎn)原料的監(jiān)管，是企業(yè)和政府職能部門當(dāng)務(wù)之急的重要工作，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

3.3 改善弱毒疫苗生產(chǎn)工藝，有效防范外源性感染

改進(jìn)弱毒疫苗等生物制劑的生產(chǎn)工藝，也是當(dāng)前破解疫苗中BVDV 污染現(xiàn)狀的一個有效途徑。目前，有疫苗生產(chǎn)企業(yè)在使用放射性鈷-60 對血清等進(jìn)行輻射操作，以期殺滅血清中的BVDV；也有一些生物制劑廠家在研究無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，避免因原料污染而導(dǎo)致疫苗出現(xiàn)問題；還有企業(yè)在研究胎牛血清替代品，如馬血清等。

3.4 分子生物學(xué)方法能有效檢測BVDV

建立特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高的檢測方法是篩查豬瘟疫苗及胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒污染的關(guān)鍵。于新友等[14]建立的雙重?zé)晒釶CR 方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、精密性好，可用于豬用疫苗中外源病毒的快速檢測及豬用疫苗等生物制品的質(zhì)量控制。本文利用已成熟的BVDV實(shí)時熒光定量RT-PCR 方法對樣品進(jìn)行檢測，對檢測出的陽性樣品送第三方檢測機(jī)構(gòu)復(fù)檢，結(jié)果相似度100%。檢測結(jié)果表明，伊犁河谷市售的豬瘟疫苗和胎牛血清存在BVDV 的污染，這為伊犁河谷市規(guī)模化豬場選擇安全性高的生物疫苗提供了依據(jù)。但同時疫苗中RT-PCR 檢測BVDV 也存在一定問題，若疫苗中存在滅活的少量BVDV 也能被檢測到，因此，檢測到的病毒有可能是滅活的BVDV。如何在有限的時間內(nèi)區(qū)分BVDV 的活性，是值得學(xué)者研究的方向。

4 小結(jié)

目前，新疆部分地區(qū)大型規(guī)模養(yǎng)豬場豬瘟抗體合格率普遍高于中、小型規(guī)模養(yǎng)豬場，說明大型規(guī)模養(yǎng)豬場在豬瘟的防控方面具有一定優(yōu)勢[15]，中小規(guī)模豬場還存在一定的豬瘟野毒感染風(fēng)險(xiǎn)。伊犁地區(qū)的生豬存欄量較大，且以中小型規(guī)模豬場為主，每年豬用疫苗的使用量相當(dāng)大，這也使很多疫苗生產(chǎn)廠家為了搶占伊犁生豬市場，打價(jià)格戰(zhàn)造成疫苗質(zhì)量得不到保障。伊犁河谷市所售的豬瘟疫苗種類繁多，豬場使用疫苗后，生豬時常出現(xiàn)類似豬瘟的臨床表現(xiàn)，這也提示養(yǎng)殖企業(yè)要加強(qiáng)對豬源BVDV 的檢測，為伊犁地區(qū)生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供保障。