六種商品化血促性素的活性成分含量檢測和生物學(xué)活性分析

張 洪 宋星星 韓一嘯 汪 澎 潘華柱 張佳妮 李 珣*

（1 吉力生物科技有限公司，浙江寧波 315000；2 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004）

隨著我國畜牧業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和飼養(yǎng)技術(shù)的日益提升，血促性素的需求量也逐步遞增。血促性素是動物繁殖激素的重點產(chǎn)品，比較不同的商品化血促性素的活性，有利于推進行業(yè)激素產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展，提高母畜受胎率，促進養(yǎng)殖場集約化經(jīng)營，提升畜牧業(yè)養(yǎng)殖的生產(chǎn)效益。血促性素的主要成分是孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG），也稱為馬屬動物絨毛膜促性腺激素[1]。PMSG 是一種在懷孕母馬血清中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，主要由雌性馬屬動物的子宮內(nèi)膜杯狀細胞分泌[2]。從健康孕馬的血清或血漿中提取的血促性素具有調(diào)控動物繁殖力的作用，主要應(yīng)用于奶牛、綿羊、豬等動物[3,4]。神英超等[4]、羅昊澍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，PMSG 具有促卵泡素和促黃體素活性。此外，PMSG 已被證明可以用于誘導(dǎo)發(fā)情[6]、治療不孕、增強動物生育能力[7-9]、促進卵泡發(fā)育或胚胎移植時的超數(shù)排卵[10,11]、誘導(dǎo)多胎[12]、治療母畜卵巢機能疾病和提高公畜繁殖性能等[1,13]方面。通過使用血促性素可以使養(yǎng)殖場中動物的發(fā)情率有效提高，從而盡可能地實現(xiàn)母畜同期發(fā)情，便于集約化養(yǎng)殖場的生產(chǎn)管理和衛(wèi)生防疫[14]。目前市場上注射用血促性素的產(chǎn)品有很多種，不同廠家生產(chǎn)的血促性素的效果也有所不同。本試驗選取了市場上常見的6 種注射用血促性素產(chǎn)品進行活性成分含量檢測和分析，并依據(jù)前人報道[15-18]，測定它們對大鼠發(fā)情、卵巢增重和卵泡發(fā)育的影響，以評價不同注射用血促性素產(chǎn)品的效果，篩選出高效的血促性素產(chǎn)品，為今后養(yǎng)殖場主的選擇用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BCA 蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、HE 染色試劑均購自中國索萊寶公司；PMSG ELISA試劑盒購自德國DRG 公司；考馬斯亮藍染液購自中國碧云天生物科技有限公司。注射用血促性素產(chǎn)品均為粉劑針，1 000 單位，批號分別是A 組（B2205271）、B組（B220703）、C 組（20210101）、D 組（20220728）、E 組（210504）和F 組（20221027）。

1.2 試驗動物

84 只6 周齡雌性SD 大鼠（202±5）g 購自廣西醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。雌性SD 大鼠適應(yīng)性飼喂1 周后，隨機分為對照組和6 組試驗組，即對照組（生理鹽水）、A 組 （B2205271）、B 組 （B220703）、C 組（20210101）、D 組（20220728）、E 組（210504）和F組（20221027），每組12 只，試驗組分別單次皮下注射0.1 mL 對應(yīng)的血促性素10 IU，對照組相同時間皮下注射0.1 mL 生理鹽水，隨后進行試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 血促性素蛋白濃度的測定

本試驗依據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒說明書進行。將標準品和血促性素分別用PBS 梯度稀釋，記為待檢樣品，將BCA 試劑和Cu 試劑按50∶1 的比例配制成BCA 工作液，將待檢樣品和工作液依次加入96 孔板，37℃孵育后，在562 nm 處測定各孔吸光值，繪制標準曲線，計算樣品中的蛋白濃度。

1.3.2 血促性素PMSG 含量測定

將蛋白上樣緩沖液與PBS 溶解后的血促性素按照1∶4 的比例配制為待檢樣品，取20 μL 待檢樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳，待Marker 到達膠塊底部，電泳完成。將SDS-PAGE 凝膠放入考馬斯亮藍染液進行染色，過夜脫色后，拍照分析，初步判斷PMSG 含量。

根據(jù)PMSG ELISA 試劑盒說明書，將樣品用蒸餾水溶解后用零標準品按1∶100 的比例稀釋，加入微孔中，室溫下孵育1 h。隨后依次進行酶聯(lián)物、底物液和終止液的孵育，終止反應(yīng)后在450±10 nm 處讀取OD 值，繪制標準曲線，計算樣品中的PMSG 含量。

1.3.3 血促性素的生物活性檢測

（1）誘導(dǎo)發(fā)情。注射血促性素后每天2 次制作大鼠陰道涂片，每組6 只，連續(xù)2 周，對涂片進行HE 染色，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及含量，記錄并分析各組大鼠發(fā)情情況。

（2）卵巢增重和卵泡發(fā)育。注射血促性素后第72 h對大鼠進行剖檢，每組6 只，摘除卵巢，稱重，計算卵巢指數(shù)，卵巢指數(shù)＝卵巢重量÷體重。將卵巢用福爾馬林固定，自動脫水機脫水、透明和浸蠟，石蠟包埋后，制成4 μm 連續(xù)切片。HE 染色后，隨機觀察不連續(xù)的3張切片，選取5 個不相鄰的視野，記錄單側(cè)卵巢中的成熟卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)（即初級卵泡和次級卵泡的數(shù)目），計算成熟卵泡率。成熟卵泡率＝成熟卵泡數(shù)÷（成熟卵泡數(shù)+生長卵泡數(shù)）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗相關(guān)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 血促性素的濃度檢測

根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒檢測結(jié)果繪制標準曲線（圖1A），在0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)，得到線性回歸方程y=0.7918x+0.0816，R2為0.9962，大于0.98，表明BCA 法的線性相關(guān)性符合標準。

圖1 BCA 法檢測不同血促性素的蛋白濃度

根據(jù)線性回歸方程計算得出不同血促性素的蛋白濃度，繪制柱狀圖（圖1B）。蛋白濃度由高到低依次為F組、C 組、E 組、A 組、B 組、D 組，其中A 組和B 組沒有顯著差異（P＞0.05），B 組和D 組沒有顯著差異（P＞0.05），其他組間均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.2 不同廠家血促性素的活性成分含量檢測

血促性素的主要成分為PMSG，分子量為53 KDa。SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示，C 組、E 組和F 組的血促性素均呈現(xiàn)出明顯的蛋白泳道（圖2A）。在43 KDa范圍處，C 組、E 組、F 組的血促性素均有蛋白條帶，其中F 組的血促性素的蛋白含量最高。上述結(jié)果提示F組中PMSG 的含量最高。

圖2 SDS-PAGE 凝膠電泳和PMSG ELISA 試劑盒測定不同廠家血促性素的含量

根據(jù)PMSG ELISA 試劑盒檢測結(jié)果，以每個標準品的平均OD 值為Y 軸，其濃度為X 軸做標準曲線（半對數(shù)，見圖2B），在0～800 IU/mL 范圍內(nèi)，得到線性回歸方程y＝0.2376ln(x)-0.6403，R2=0.9981，大于0.98，表明ELISA 的線性相關(guān)性符合標準。

根據(jù)線性回歸方程計算得出不同廠家的血促性素的PMSG 含量，繪制柱狀圖（圖2C）。由圖可知，PMSG的含量從高到低依次為F 組、D 組、B 組、E 組、C 組、A 組，各組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 血促性素生物活性檢測

2.3.1 誘導(dǎo)發(fā)情

大鼠一個發(fā)情周期為4～5 d，根據(jù)陰道涂片中3 種細胞不同比例區(qū)分為發(fā)情前期（圖3A）、發(fā)情期（圖3B）、發(fā)情后期（圖3C）和間情期（圖3D）。結(jié)果表明，注射藥物后第72 h，對照組的SD 大鼠發(fā)情率為33.33%，A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的SD大鼠的發(fā)情率均為100%（圖4）。表明不同血促性素均能達到同期發(fā)情效果。

圖3 大鼠發(fā)情周期各階段陰道細胞變化圖（100×）

圖4 不同廠家血促性素對SD 大鼠同情發(fā)情的影響

14 d 的陰道涂片統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖5），與對照組相比，A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的SD 大鼠均表現(xiàn)出發(fā)情前期和發(fā)情后期時長顯著性減少（P＜0.05），發(fā)情期時長顯著增多（P＜0.05），其中，D 組發(fā)情前期時長最短；E 組發(fā)情期時長最短（P＜0.05），發(fā)情后期時長最長（P＜0.05）。與對照組的間情期時長相比，E 組顯著增多（P＜0.05），A 組和F 組顯著減少（P＜0.05）。上述結(jié)果提示不同血促性素均能延長SD 大鼠發(fā)情期的時間，其中，E 組的延長效果不佳。

圖5 不同血促性素對SD 大鼠發(fā)情周期的影響

2.3.2 卵巢增重及卵泡發(fā)育

SD 大鼠卵巢增重試驗結(jié)果（圖6）顯示，F(xiàn) 組大鼠的卵巢指數(shù)顯著高于對照組、A 組、B 組、C 組和E 組（P＜0.05），與D 組無顯著差異（P＞0.05）。除F 組外，其他各組均無顯著性差異，表明F 組具有較好地促進卵巢增重的效果。

圖6 不同廠家血促性素對SD 大鼠卵巢增重的影響

根據(jù)SD 大鼠各級卵泡的形態(tài)學(xué)特點（表2），對各組卵巢切片（圖7）中的成熟卵泡和生長卵泡進行計數(shù)，結(jié)果顯示，注射血促性素后大鼠卵巢中成熟卵泡增多。與對照組相比，C 組、D 組和F 組的成熟卵泡率顯著升高（P＜0.05）。其中，C 組和F 組的成熟卵泡率還顯著高于A 組和B 組（P＜0.05）。但是，其他各組的成熟卵泡率無顯著性差異（圖8）。結(jié)果表明，C 組和F組產(chǎn)品均可以促進SD 大鼠卵泡成熟。

表2 大鼠各級卵泡的形態(tài)學(xué)特征

圖7 不同血促性素對SD 大鼠的卵泡發(fā)育的影響（40×）

圖8 不同血促性素對SD 大鼠的成熟卵泡率的影響

3 討論

注射用血促性素是母畜繁育中廣泛使用的激素產(chǎn)品，主要用于調(diào)控母畜同期發(fā)情和超數(shù)排卵。我國獸藥典標準中規(guī)定，注射用血促性素效價應(yīng)為標示量的67%～148%。由試驗結(jié)果可知，市場上商品化注射用血促性素的效價具有一定差異。馬增曉等[19]研究表明，PMSG 的劑量會影響動物的發(fā)情、排卵和受胎率。為了篩選出高效的血促性素，對6 種常見注射用血促性素進行了活性成分含量檢測和生物活性分析。

血促性素的活性成分含量是決定其生物活性的前提。蛋白濃度檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C 組、E 組、F 組的血促性素均具有較高的蛋白濃度，其中F 組濃度最高。SDS-PAGE 凝膠電泳和ELISA 檢測結(jié)果顯示，F(xiàn) 組的血促性素中PMSG 含量最高，D 組、B 組、E 組、C 組、A 組的PMSG 含量依次降低。表明F 組的血促性素含有最多的活性成分，PMSG 含量最高，其應(yīng)用效果最好。生物活性試驗結(jié)果顯示，6 種血促性素均能100%誘導(dǎo)SD 大鼠同期發(fā)情，這與高建明等[20]報道的PMSG 劑量對動物同期發(fā)情效果無顯著影響結(jié)果一致。發(fā)情期是動物排卵的主要時期[21]，PMSG 可以在大鼠發(fā)情周期的任何階段誘導(dǎo)超數(shù)排卵[22]。陰道涂片結(jié)果顯示，6 種血促性素均能顯著促進大鼠發(fā)情期時間的增長，但E 組效果較差，表明6 種血促性素均能誘導(dǎo)大鼠超數(shù)排卵，但排卵效果有差異。此外，卵巢增重和HE 染色結(jié)果表明，僅有F 組的大鼠卵巢指數(shù)顯著增加，卵泡成熟率最高，表明F 組的血促性素促進卵泡發(fā)育的效果最好，可以誘導(dǎo)大鼠超數(shù)排卵。曾昭成等[23]指出不同效價的PMSG 對動物發(fā)情率和排卵率影響不顯著，但高效價的PMSG 可以顯著提高動物的排卵數(shù)，提升動物受胎率，這與本研究結(jié)果類似。生殖激素是調(diào)控動物卵巢發(fā)育及其排卵過程的主要內(nèi)分泌因子[24]，PMSG 作為生殖激素的一種，在血液中半衰期較長，可達2～5 d，外源注射后體內(nèi)殘留的激素會影響母畜的發(fā)情效果。低效價的PMSG 雖然誘導(dǎo)動物發(fā)情，但對卵巢影響較小，無法改善動物卵泡發(fā)育和排卵情況[25]。此外，低效價PMSG 比高效價PMSG 更易引發(fā)大鼠子宮和卵巢水腫，影響動物卵子發(fā)育，導(dǎo)致動物后期受胎率大幅降低，降低母畜繁殖性能，影響家畜養(yǎng)殖效益。

4 結(jié)論

通過對6 家廠家的注射用血促性素進行活性成分含量檢測和生物學(xué)活性分析，發(fā)現(xiàn)F 組產(chǎn)品效果最好。低效價的血促性素只具備誘導(dǎo)大鼠發(fā)情的效果，不能誘導(dǎo)其排卵，容易導(dǎo)致動物配種失敗。而高效價的血促性素兼?zhèn)湔T導(dǎo)發(fā)情、促進卵巢發(fā)育和促進卵泡成熟的效果，有利于動物配種成功和超數(shù)排卵，提升動物受胎率和產(chǎn)仔率。因此，使用高效價的血促性素能使養(yǎng)殖場的效益更大化。