一葉萩堿對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的影響

張金武　謝丁玲　陳莉

摘要：目的 基于Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路，探討一葉萩堿（SE）對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷（CIRI）后神經(jīng)功能的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 100只成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），模型組（CIRI組），SE低、中、高劑量組，每組20只。采用線栓法建立大鼠CIRI模型，建模成功后立即腹腔注射低、中、高劑量（20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg）的SE，連續(xù)3 d，Sham組與CIRI組給予等量生理鹽水。術(shù)后24、48、72 h，參照Longa法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；術(shù)后72 h，干濕重法測(cè)定大鼠腦組織含水量，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色評(píng)估大鼠腦梗死體積百分比，Western blot檢測(cè)大鼠腦組織離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba-1）、TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)大鼠腦組織白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6水平，免疫熒光染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元存活情況。結(jié)果 與Sham組相比，CIRI組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦組織含水量升高，腦梗死體積百分比增大，腦組織中TLR4、p-NF-κB p65、Iba-1、IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)水平升高（P＜0.05）。中、高劑量的SE可降低大鼠CIRI后神經(jīng)功能缺損評(píng)分和損傷后腦組織含水量，降低腦梗死體積百分比及損傷區(qū)域TLR4、p-NF-κB p65、Iba-1蛋白表達(dá)水平及IL-1β、TNF-α和IL-6水平（P＜0.05）。結(jié)論 SE可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路激活降低大鼠CIRI后神經(jīng)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：腦缺血；再灌注損傷；TLR4/NF-κB通路；一葉萩堿；炎性因子

中圖分類號(hào)：R743.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221801

The effect of securinine on neurological function recovery after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

ZHANG Jinwu， XIE Dingling， CHEN Li

Department of Neurology， Xianning Central Hospital， the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， China

Corresponding Author E-mail： easy1851@eyou.com

Abstract： Objective To explore the effect and mechanism of securinine （SE） on cerebral ischemia reperfusion injury （CIRI） in rats based on toll-like receptor 4 （TLR4）/nuclear transcription factor-kappa B （NF-κB） pathway. Methods A total of 100 male or female adult SD rats were randomly divided into the sham group， the CIRI group and the SE low-， medium- and high-dose （20 mg/kg， 40 mg/kg， 80 mg/kg） groups， with 20 rats in each group. The rat model of CIRI was established by thread occlusion. Rats were treated with SE （20 mg/kg， 40 mg/kg and 80 mg/kg） immediately after successful modeling for 3 consecutive days. Rats in the sham group and the CIRI group were given the same amount of normal saline. At 24 h， 48 h and 72 h after operation， the neurological deficits of rats were measured according to Longa score. At 72 h after operation， brain tissue water content was evaluated by wet-dry weight method， and the percentage of cerebral infarction volume was assessed by triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining. Protein expression levels of Iba-1，TLR4， NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in brain tissue were determined by Western blot assay. Expression levels of inflammatory factors such as interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Level of microglia activation and the number of surviving neurons were examined by immunofluorescence staining. Results Compared with the sham group， neurological function scores， brain tissue water content and the percentage of cerebral infarction volume were significantly increased in the CIRI group （all P＜0.05）. Expression levels of TLR4， p-NF-κB p65， Iba-1， IL-1β， TNF-α and IL-6 in brain tissue were significantly increased （all P＜0.05）. However， medium- and high-doses of SE could significantly alleviate the neurological deficits， reduce the water content of brain tissue and the size of cerebral infarction volume， decrease expression levels of TLR4， p-NF-κB p65， Iba-1， IL-1β， TNF-α and IL-6 in the injured area of brain tissue in rats. Conclusion SE can alleviate CIRI-induced neuroinflammatory response via inhibiting TLR4/NF-κB pathway activation， thereby conferring a protective role in brain of rats.

Key words： brain ischemia; reperfusion injury; TLR4/NF-κB pathway; securinine; inflammatory factors

缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重的急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率等特點(diǎn)［1］。早期恢復(fù)局部腦血流量是治療腦卒中的關(guān)鍵，然而腦血管再通后可能進(jìn)一步誘發(fā)腦組織損傷和加重神經(jīng)功能缺損，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）［2］。CIRI的損傷機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，主要涉及離子失衡、血腦屏障（BBB）損傷、能量代謝障礙、興奮性氨基酸細(xì)胞毒性、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等多個(gè)病理過(guò)程，其中炎癥反應(yīng)是CIRI發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制［3］。大量研究顯示，減輕大鼠炎癥反應(yīng)可以改善CIRI后的神經(jīng)功能［4-5］。因此，抑制CIRI后炎癥反應(yīng)的激活，減少促炎因子的釋放，對(duì)改善腦損傷具有顯著的意義。一葉萩堿（securinine，SE）又名一葉堿，是一種從植物根部提取的生物堿［6］，已經(jīng)證實(shí)SE可以特異性拮抗γ-氨基丁酸（GABA）A受體的活性，因此被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，如肌萎縮側(cè)索硬化癥［7］、小兒麻痹癥［8］和多發(fā)性硬化癥［9］。近年來(lái)，體內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SE在帕金森病（Parkinson's disease，PD）中發(fā)揮著顯著的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用［10-11］。然而有關(guān)SE在CIRI中應(yīng)用的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖耍狙芯恐荚谔接慡E對(duì)大鼠CIRI后神經(jīng)功能的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡清潔級(jí)成年SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃，濕度50%±20%，自由飲水和攝食，12 h晝夜規(guī)律交替的動(dòng)物房中。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循“國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用健康研究所指南”（NIH出版物No.80-23）進(jìn)行，并獲得湖北科技學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2020-01-900）。

1.1.2 主要試劑與儀器 線栓（北京西濃科技有限公司），SE（純度＞98％，中國(guó)源葉生物科技有限公司），離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba-1）、Toll樣受體4（TLR4，美國(guó)Santa Cruz公司），核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）p65/p-p65、β-actin、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG H&L（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司），Neuron（美國(guó)Millipore公司），熒光二抗兔/鼠（美國(guó)ThermoFisfer Scientific公司），大鼠白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），PVDF膜（0.45 ?m，美國(guó)Millipore公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western blot制膠試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），標(biāo)準(zhǔn)蛋白Maker（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司），超敏ECL發(fā)光試劑盒（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司）。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國(guó)Sigma公司），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京biosharp公司），蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建 100只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組），模型組（CIRI組），SE低、中、高劑量組，每組20只。參照改良的Zea-Longa［12］線栓法建立大鼠CIRI模型。過(guò)程如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，滿意后，頸部剃毛，皮膚碘伏消毒，沿正中偏右切口分離暴露右頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎右頸總和頸外動(dòng)脈近心端，頸總動(dòng)脈頭側(cè)端剪口，將線栓從頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔推至大鼠大腦前動(dòng)脈，進(jìn)線長(zhǎng)度約20 mm，固定后縫合。線栓阻斷2 h后抽出絲線，切口絲線結(jié)扎。Sham組僅分離血管，不進(jìn)行剪口和線栓操作。SE低、中、高劑量組于造模成功后立即腹腔分別注射20、40、80 mg/kg SE，持續(xù)3 d。造模成功標(biāo)志為麻醉清醒后，大鼠提尾時(shí)左側(cè)前肢不能前伸，爬行時(shí)向患側(cè)偏斜，不能走直線。造模不成功或未到相應(yīng)時(shí)間死亡者被剔除，并按照隨機(jī)原則及時(shí)補(bǔ)充。Sham組與CIRI組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后24、48、72 h，每組隨機(jī)抽取8只大鼠，由單盲觀察者參照Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分，輕度神經(jīng)功能缺損，梗死半球?qū)?cè)前爪不能完全伸展；2分，中度神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向梗死半球側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向梗死半球側(cè)傾倒；4分，無(wú)法自發(fā)行走，刺激無(wú)反應(yīng)，存在意識(shí)喪失。

1.2.3 TTC染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積百分比 術(shù)后72 h，每組隨機(jī)抽取5只大鼠，成功麻醉后，立即斷頭處死并迅速取出大腦組織，于腦切片機(jī)上連續(xù)切取5個(gè)冠狀腦片（厚2 mm），隨后置于2%的TTC染色液中，37 ℃避光孵育15～20 min，隨即浸于4%多聚甲醛溶液4 ℃固定24 h。將切片平鋪于純色版上掃描，經(jīng)TTC染色后，正常腦組織顯示紅色，梗死區(qū)域出現(xiàn)白色，梗死體積百分比=（梗死總體積/腦部總體積）×100%，采用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 腦含水量的檢測(cè) 采用干濕重法［13］檢測(cè)各組大鼠腦含水量變化，用于評(píng)估腦水腫的程度。術(shù)后72 h，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，成功麻醉后，斷頭處死，快速分離取出腦組織，放入電子天平稱濕質(zhì)量，隨后將腦組織放置105 ℃烘箱中烘烤24 h直至完全烘干，稱干質(zhì)量3次，取其平均值。最后統(tǒng)計(jì)各組腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠腦組織Iba-1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá) 術(shù)后72 h，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，成功麻醉后，斷頭處死。冰上快速取出大腦梗死組織，其中一半組織采用RIPA裂解并提取組織總蛋白，經(jīng)過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度后制備樣品。取25 μg蛋白樣品上樣，行10% SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉液快速封閉12 min后加入一抗Iba-1、TLR4（均1∶200）和NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin（均1∶1 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日回收相應(yīng)一抗，于0.1 mol/L TBST清洗（5 min×3次）后加入鼠二抗或兔二抗（1∶5 000）室溫?fù)u床孵育2 h，再次0.1 mol/L TBST 洗滌（5 min×3次）后ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)計(jì)算各組蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的灰度值比值，檢測(cè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織IL-1β、TNF-α和IL-6分子表達(dá) 快速收取1.2.5中另一半大鼠腦組織，充分研磨后收取上清液，按照相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

1.2.7 免疫熒光染色檢測(cè)大鼠腦組織Iba-1和Neuron蛋白表達(dá) 術(shù)后72 h，每組取3只大鼠，成功麻醉后，立即暴露胸腔，于左心室插管注入提前預(yù)冷的生理鹽水，剪刀剪破右心耳，待流出清澈液體后，換用4%多聚甲醛灌流直至大鼠頸部強(qiáng)直，肝腸發(fā)白，四肢、尾部僵硬后取出右側(cè)損傷腦組織。隨后依次將其浸泡于4%多聚甲醛固定及30%蔗糖溶液沉糖。OCT包埋后速凍，連續(xù)獲取厚度8 ?m冰凍切片，室溫放置30 min后，0.1 mol/L PBS清洗（5 min×3次），10%山羊血清室溫封閉1 h后加入Iba-1（1∶50）或Neuron（1∶50），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日，0.1 mol/L PBS清洗（5 min×3次）后滴加1∶400的鼠熒光二抗，室溫避光孵育2 h。0.1 mol/L PBS清洗（5 min×3次），DAPI染色8 min并用50%甘油封片，隨后熒光顯微鏡下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SE促進(jìn)大鼠CIRI后神經(jīng)功能恢復(fù) CIRI組術(shù)后24、48和72 h時(shí)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于Sham組（P＜0.05），SE低劑量組與CIRI組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。除術(shù)后24 h時(shí)SE中劑量組與CIRI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，SE中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均低于CIRI組（P＜0.05）。術(shù)后24、48 h時(shí)，SE低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后72 h時(shí)，SE低、中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分依次降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 SE降低大鼠CIRI后腦梗死體積百分比及緩解腦水腫 Sham組大鼠腦組織顏色正常，未見(jiàn)梗死。與Sham組比較，CIRI組大鼠腦梗死體積百分比增大，腦組織含水量增多（P＜0.05）。與CIRI組比較，SE低劑量組大鼠腦梗死體積百分比及腦組織含水量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、高劑量組大鼠腦梗死體積百分比減小，腦組織含水量降低（P＜0.05）。SE低、中、高劑量組腦梗死體積百分比依次降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 SE抑制大鼠CIRI后TLR4、p-NF-κB p65和Iba-1蛋白的表達(dá) 與Sham組相比，CIRI組大鼠腦組織TLR4、p-NF-κB p65和Iba-1蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），SE低劑量組與CIRI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SE中、高劑量組大鼠腦組織TLR4、p-NF-κB p65和Iba-1蛋白表達(dá)水平均低于CIRI組和SE低劑量組（P＜0.05）；SE高劑量組腦組織Iba-1蛋白表達(dá)水平低于SE中劑量組，TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與SE中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3、圖2。免疫熒光染色檢測(cè)Iba-1蛋白表達(dá)的結(jié)果與Western blot一致，見(jiàn)圖3。

2.4 SE緩解大鼠ICRI后炎性因子的釋放 與Sham組相比，CIRI組促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平均升高（P＜0.05），SE低劑量組與CIRI組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SE低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α和IL-6水平依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.5 SE促進(jìn)大鼠CIRI后神經(jīng)元的存活 Sham組大鼠神經(jīng)元數(shù)量較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，分布均勻。CIRI組大鼠神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核破壞明顯。低劑量組大鼠神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)較CIRI組輕微緩解。中、高劑量組大鼠神經(jīng)元數(shù)量較CIRI組明顯增多，細(xì)胞形態(tài)顯著緩解。見(jiàn)圖4。

3 討論

缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的腦卒中類型，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)且趨于年輕化，致殘率和死亡率均較高［1］。早期有效的溶栓、疏通血管是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。但當(dāng)溶栓治療后血管再通的同時(shí)極易引發(fā)CIRI［14］。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是CIRI發(fā)生的主要原因，在腦缺血再灌注進(jìn)展中具有顯著的負(fù)面影響，腦缺血再灌注后刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，后者釋放大量炎性因子，加重腦組織的損傷并導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡［5，15］。因此尋求有效的藥物治療、抑制炎性細(xì)胞的活化和炎性因子的釋放對(duì)緩解CIRI和改善神經(jīng)功能缺損具有重要的作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SE在阿爾茨海默?。ˋD）和PD中發(fā)揮顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用［16］；Lin等［10］在大鼠β-淀粉樣蛋白沉積誘導(dǎo)的AD模型中證實(shí)，口服SE（20 mg/kg和40 mg/kg）可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，緩解大鼠腦認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性病變。Leonoudakis等［11］通過(guò)體外復(fù)制PD模型亦證實(shí)SE可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外，有研究顯示，SE可以顯著促進(jìn)抑郁大鼠神經(jīng)元的分化和突觸形成，發(fā)揮抗抑郁功能［17］。以上研究均提示SE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護(hù)性作用，然而SE在大鼠CIRI后相關(guān)作用少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)線栓法建立大鼠右側(cè)CIRI模型，發(fā)現(xiàn)大鼠在經(jīng)歷局部腦組織的缺血和再灌注后表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能障礙，出現(xiàn)腦梗死和水腫，缺血側(cè)腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活及炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平升高；SE低劑量對(duì)大鼠CIRI無(wú)顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，SE中、高劑量可降低大鼠CIRI后神經(jīng)功能缺損評(píng)分，減少腦梗死體積，緩解腦組織水腫程度，并且抑制腦組織中Iba-1蛋白的表達(dá)及促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元的存活，發(fā)揮腦損傷保護(hù)作用，這與既往研究結(jié)果基本一致。另外，本研究結(jié)果顯示，SE中、高劑量組大鼠在術(shù)后72 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積百分比低于低劑量組，高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積百分比低于中劑量組，提示SE對(duì)CIRI大鼠的腦保護(hù)作用可能具有劑量依賴性。

TLR4是一種模式識(shí)別受體，廣泛分布于腦室周圍血管叢、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)控［18］。大鼠局部腦缺血損傷后，TLR4表達(dá)水平明顯上升，隨后活化下游的信號(hào)因子NF-κB，促進(jìn)IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放，進(jìn)一步加重局部缺血再灌注引起的細(xì)胞損傷［19］。大量研究已證實(shí)，抑制大鼠CIRI后TLR4/NF-κB通路可有效阻止細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的擴(kuò)大，抑制炎性因子的釋放，從而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［20-21］。本研究進(jìn)一步探討SE抑制CIRI誘導(dǎo)炎癥的可能機(jī)制，通過(guò)Western blot檢測(cè)大鼠CIRI后TLR4和p-NF-κB p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與Sham組相比，CIRI組TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高，提示CIRI后可誘導(dǎo)TLR4/NF-κB通路的激活；與CIRI組相比，中、高劑量SE可降低TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平；采用免疫熒光染色評(píng)估大鼠CIRI后損傷區(qū)域神經(jīng)元存活情況，發(fā)現(xiàn)大鼠CIRI后導(dǎo)致神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞及數(shù)量減少，給予中、高劑量SE后可顯著促進(jìn)神經(jīng)元的存活，緩解神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞。

綜上，SE可以有效緩解大鼠CIRI后腦梗死和水腫程度，改善大鼠損傷后神經(jīng)功能障礙，促進(jìn)神經(jīng)元存活，且其作用機(jī)制可能與TLR4/NF-κB通路相關(guān)，即SE可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，降低小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎性因子的釋放，發(fā)揮抗炎和腦保護(hù)作用。本研究亦發(fā)現(xiàn)SE在發(fā)揮CIRI保護(hù)作用時(shí)可能具有劑量依賴性，高劑量SE的腦保護(hù)效果更加明顯。

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（2022-11-14收稿 2023-01-12修回）

（本文編輯 陳麗潔）