舒筋活血膠囊通過JAK2/STAT3通路緩解大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的機制研究

李宏軍　錢亮　鄧新超　余庭　吳巖　吳紅麗

摘要：目的 探討舒筋活血膠囊調(diào)控酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）信號通路對大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）的影響及其機制。方法 采用Hulth法制備大鼠KOA模型，將60只大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、KOA組、舒筋活血膠囊組（SJHX組）（472.5 mg/kg 舒筋活血膠囊灌胃）、AG490組（5.0 mg/kg的JAK2抑制劑AG490腹腔注射），每組15只。HE染色與番紅O-固綠染色觀察滑膜組織與軟骨組織病理變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清白細胞介素（IL）-10、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，免疫熒光法檢測M1/M2型巨噬細胞極化，免疫組化染色檢測IL-1β、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13蛋白表達，Western blot檢測JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白。結(jié)果 與Sham組比較，KOA組大鼠關(guān)節(jié)面不平整，滑膜組織與軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞，病理評分增加，血清IL-1β、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平降低，滑膜組織IL-1β、iNOS、MMP-13、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達水平及M1、M2型巨噬細胞、M1/M2比值升高（P＜0.05）；與KOA組比較，SJHX組與AG490組大鼠滑膜組織與軟骨組織病理損傷減輕，病理評分降低，血清IL-1β、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，滑膜組織IL-1β、iNOS、MMP-13、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達水平及M1巨噬細胞、M1/M2比值降低（P＜0.05）。結(jié)論 舒筋活血膠囊可通過抑制JAK2/STAT3信號通路激活，調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細胞極化，改善KOA大鼠滑膜炎癥狀。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎，膝；活血舒筋；巨噬細胞；Janus激酶2；STAT3轉(zhuǎn)錄因子；舒筋活血膠囊

中圖分類號：R684.3文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221924

Mechanism of Shujin Huoxue Capsule in relieving knee osteoarthritis in

rats through JAK2/STAT3 pathway

LI HongjunQIAN LiangDENG Xinchao YU Ting WU Yan WU Hongli

1 Department of Wound Repair and Peripheral Vascular Disease， the First Hospital of Wuhan， Wuhan 430030， China;

2 Department of Orthopedics， the Eighth Hospital of Wuhan

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of Shujin Huoxue Capsule on knee osteoarthritis （KOA） in rats by regulating tyrosine protein kinase 2 （JAK2）/signal transduction and transcription-activating protein 3 （STAT3） signaling pathway. Methods The Hulth method was used to prepare rat KOA model. Sixty rats were divided into the Sham group， the KOA group， the Shujin Huoxue Capsule （SJHX） group （472.5 mg/kg Shujin Huoxue Capsule gavage） and the AG490 group （5.0 mg/kg JAK2 inhibitor AG490 intraperitoneally） with 15 rats in each group. The pathological changes of synovial tissue and cartilage tissue were observed by HE staining and Safranin O-fast green staining. Serum levels of interleukin-10 （IL-10）， IL-1b and tumor necrosis factor-a （TNF-a） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. M1/M2 macrophage polarization was detected by immunofluorescence assay. The expression levels of IL-1β， inducible nitric oxide synthase （iNOS） and matrix metalloproteinase 13 （MMP-13） were detected by immunohistochemical staining. JAK2/STAT3 pathway related proteins were detected by Western blot assay. Results Compared with the Sham group， the articular surface was uneven in? rats of the KOA group. The synovial tissue and cartilage tissue were destroyed，? pathological scores were increased. Serum levels of IL-1β and TNF-α were obviously increased， and the level of IL-10 was obviously reduced. Expression levels of IL-1β， iNOS， MMP-13， p-JAK2/JAK2 and p-STAT3/STAT3 in synovial tissue， and the proportions of M1， M2 macrophages and M1/M2 were obviously increased （P＜0.05）. Compared with the KOA group， the pathological damage of synovial tissue and cartilage tissue was reduced in the SJHX group and the AG490 group. Pathological scores were reduced. Serum levels of IL-1β and TNF-α were obviously reduced， and the level of IL-10 was obviously increased. Expression levels of IL-1β， iNOS， MMP-13， p-JAK2/JAK2， p-STAT3/STAT3 in synovial tissue， and the proportions of M1， M2 macrophages and M1/M2 were obviously reduced （P＜0.05）. Conclusion Shujin Huoxue Capsule can improve the symptoms of synovitis in KOA rats by inhibiting the activation of JAK2/STAT3 signaling pathway and regulating the polarization of M1/M2 macrophages.

Key words： osteoarthritis， knee; activating blood and relaxing muscle tendon; macrophages; Janus kinase 2; STAT3 transcription factor; Shujin Huoxue Capsule

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是常見的慢性關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨丟失、軟骨下骨改變等特征［1］。先天免疫在KOA的進展中發(fā)揮重要作用，巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在不同模式刺激下可極化為不同的表型，M1型巨噬細胞促進炎性因子分泌，加重炎癥反應，M2型巨噬細胞誘導生長因子，具有抗炎和促進組織修復作用，巨噬細胞極化與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）信號通路參與調(diào)控巨噬細胞極化［3］。JAK2/STAT3信號通路還參與軟骨破壞的過程，抑制JAK2/STAT3通路的激活可降低炎癥反應，改善佐劑性關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷［4］。舒筋活血膠囊由紅花、狗脊、槲寄生等中藥組成，具有舒筋活絡(luò)，活血散瘀的功效，在臨床上用于治療KOA、類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等［5-6］。舒筋活血膠囊對KOA巨噬細胞極化的影響及作用機制尚不清楚，本研究旨在探索舒筋活血膠囊對KOA巨噬細胞極化的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與藥物 SD雄性大鼠60只，SPF級，6～7周齡，200～230 g，購自廣東至遠生物醫(yī)藥科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2021-0057，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。舒筋活血膠囊（0.35 g，國藥準字Z20050630）購自湖南德康制藥股份有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 JAK2抑制劑AG490購自碧云天生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、番紅O-固綠軟骨染色液購自上海源葉生物科技有限公司；兔抗鼠CD68、CD206、F4/80一抗、Alexa Fluor? 488標記與Alexa Fluor? 647標記的羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗鼠IL-1β、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）一抗購自Santa Cruz公司；兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗及HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自索萊寶生物科技有限公司。垂直電泳系統(tǒng)購自Bio-rad公司，共聚焦顯微鏡及正置顯微鏡購自日本Olympus公司，Varioskan LUX多功能酶標儀購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗動物分組及模型制備 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、KOA組、舒筋活血膠囊組（SJHX組）、JAK2抑制劑組（AG490組），每組15只。采用Hulth法［7-8］制備KOA模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，選取右膝關(guān)節(jié)，打開關(guān)節(jié)腔，切斷內(nèi)側(cè)半月板前角以及前交叉和內(nèi)側(cè)副韌帶，再切除內(nèi)側(cè)半月板。Sham組打開關(guān)節(jié)腔后不做處理，再縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，術(shù)后給予大鼠40萬U青霉素臀大肌注射3 d，術(shù)后自由活動，6周后造模結(jié)束。

實驗藥物劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算來確定，造模結(jié)束后，SJHX組大鼠給予472.5 mg/（kg·d）舒筋活血膠囊，灌胃給藥，每日1次，AG490組使用5.0 mg/kg的JAK2抑制劑AG490腹腔注射，Sham組與KOA組大鼠給予等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥8周。

1.2.2 標本采集 末次給藥24 h，摘眼球取血后，3 000×g離心15 min，取血清，-80 ℃保存。每組隨機（抽簽法）抽取5只大鼠，剝離右側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。另外10只大鼠取滑膜組織，-80 ℃保存。

1.2.3 滑膜組織與軟骨組織病理學觀察 將石蠟膜包埋的組織與軟骨組織切片，經(jīng)脫蠟水化后，分別采用HE染色與番紅O-固綠染色，觀察滑膜組織與軟骨組織病理變化，并進行Krenn滑膜炎評分與Mankin評分。

1.2.4 血清IL-10、IL-1β、TNF-α水平檢測 根據(jù)試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清IL-10、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 滑膜組織免疫熒光染色 取大鼠滑膜組織冰凍切片，使用0.3%PBST透化后分別加入CD68（1∶100）、CD206（1∶500）、F4/80（1∶500）一抗孵育，再加入熒光標記的IgG二抗（1∶1 000），孵育，DAPI復染細胞核，共聚焦顯微鏡下拍照，計算CD68+（M1）、CD206+（M2）占F4/80+（M0）細胞比例數(shù)，并根據(jù)各組細胞比例數(shù)，計算M1/M2比值。

1.2.6 免疫組化染色檢測IL-1β、iNOS以及MMP-13蛋白表達 滑膜組織切片經(jīng)脫蠟及抗原修復后，分別加入IL-1β、iNOS、MMP-13抗體稀釋液（1∶1 000稀釋），再加入二抗（1∶1 500稀釋）室溫孵育1 h，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復染，IL-1β、iNOS、MMP-13蛋白陽性表達為棕黃色顆粒，采用Image J軟件分析，計算積分光密度，對IL-1β、iNOS、MMP-13蛋白表達定量分析。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 取大鼠滑膜組織，加入液氮研磨后，加入RIPA裂解液離心提取總蛋白。經(jīng)定量分析后，取30 μg蛋白煮沸變性，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3（均1∶1 000稀釋）及β-actin（1∶1 500稀釋）一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶2 000）37 ℃孵育1 h，ECL顯色后，以β-actin為內(nèi)參，采用Imge J軟件分析蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果 Sham組大鼠滑膜和軟骨組織結(jié)構(gòu)正常，滑膜細胞排列整齊，軟骨表面光滑，KOA組大鼠關(guān)節(jié)表面不平整，滑膜增生肥厚，細胞形態(tài)不規(guī)則，局部炎性浸潤明顯，Krenn評分較Sham組增加（P＜0.05）；SJHX組與AG490組大鼠滑膜厚度減少，炎性浸潤減輕，Krenn評分較KOA組降低（P＜0.05）；見圖1、表1。

2.2 各組大鼠軟骨組織番紅O-固綠染色結(jié)果比較 Sham組可見正常軟骨組織被染成紅色，結(jié)構(gòu)規(guī)則，關(guān)節(jié)面正常，軟骨下骨為綠色；KOA組關(guān)節(jié)面不平整，見明顯的結(jié)構(gòu)破壞和關(guān)節(jié)間隙狹窄，Mankin評分較Sham組升高（P＜0.05）；SJHX組與AG490組軟骨損傷明顯改善，Mankin評分較KOA組下降（P＜0.05）；見圖2、表1。

2.3 各組大鼠血清IL-10、IL-1β、TNF-α水平比較 與Sham組比較，KOA組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；與KOA組比較，SJHX組、AG490組血清IL-1β、TNF-α水平降低，IL-10水平升高（P＜0.05），見表2。

2.4 各組大鼠滑膜組織IL-1β、iNOS、MMP-13蛋白表達比較 與Sham組比較，KOA組大鼠滑膜組織中陽性顆粒增多，IL-1β、iNOS、MMP-13表達水平增加；與KOA組比較，SJHX組、AG490組大鼠滑膜組織陽性顆粒減少，IL-1β、iNOS、MMP-13表達水平降低；見圖3、表3。

2.5 各組大鼠滑膜組織免疫熒光染色結(jié)果 F4/80+為未分化巨噬細胞M0，CD68+、CD206+分別為M1、M2型巨噬細胞。與Sham組比較，KOA組M1、M2型巨噬細胞及M1/M2比值升高（P＜0.05）；與KOA組比較，SJHX組、AG490組的M1型巨噬細胞及M1/M2比值降低（P＜0.05），M2差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；見圖4、5，表4。

2.6 各組大鼠JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達比較 KOA組大鼠滑膜組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值高于Sham組（P＜0.05）；與KOA組比較，SJHX組、AG490組大鼠滑膜組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值降低（P＜0.05）；見圖6、表5。

3 討論

滑膜炎是KOA的病理表現(xiàn)之一，滑膜炎的炎癥反應與KOA的嚴重程度密切相關(guān)，高發(fā)病率、高致殘率是KOA的特點，目前尚缺乏有效的治療方法［9］。

中醫(yī)學認為KOA屬“痹證”、“骨痹”范疇，以肝腎虧虛、氣血不足為本，以風寒濕邪內(nèi)蘊、瘀血阻絡(luò)為標，中醫(yī)采用活血化瘀、清熱止痛等藥物進行治療［10-11］。本研究結(jié)果顯示，使用舒筋活血膠囊治療后，KOA模型大鼠滑膜與軟骨病理損傷減輕，炎癥減輕，表明舒筋活血膠囊具有改善KOA的作用。舒筋活血膠囊由紅花、槲寄生、狗脊、澤蘭葉、雞血藤等多味中藥組成，紅花可活血通經(jīng)，散瘀止痛，狗脊與槲寄生具有補肝腎、除風濕、強筋骨的作用，澤蘭葉與雞血藤具有活血通絡(luò)、舒筋活血的功效，絡(luò)石藤與伸筋草具有袪風通絡(luò)的功效，香附具有疏肝理氣、和中止痛的功效，諸藥合用具有舒筋活絡(luò)，活血散瘀之功效。

巨噬細胞是具有高度異質(zhì)性的免疫細胞，受組織微環(huán)境與病理條件的影響，可極化為M1型與M2型，M1/M2失衡在KOA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。M1型巨噬細胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，影響軟骨細胞合成、軟骨細胞分解代謝，抑制軟骨形成，促進關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)生或進展。M2型巨噬細胞可產(chǎn)生IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β等抗炎因子，參與抗炎反應，有利于組織修復、傷口愈合等，可抑制或延緩OA的進展［12］。因此，促進巨噬細胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化是治療OA的一個新方向。有研究報道，一些中藥可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化緩解OA［13］。在KOA的發(fā)生發(fā)展過程中，關(guān)節(jié)損傷可引發(fā)滑膜毛細血管通透性增加，引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥反應。在KOA大鼠中，外周血或關(guān)節(jié)液中炎性因子如TNF-α、IL-6等水平增加［14］。關(guān)節(jié)損傷的炎癥反應或老化應激激活滑膜巨噬細胞［15］。M1型巨噬細胞誘導活化后，可表達CD86、INOS等基因，分泌IL-1β、TNF-α等細胞因子，加重炎癥反應，IL-1β可誘導MMP-13合成，是OA軟骨蛻變的關(guān)鍵因子，M2活化后表達胰島素樣生長因子-1（IGF-1）和CD206，分泌IL-10等抗炎因子，加速炎癥消退，促進血管生成［16］。研究顯示，穿山龍總皂苷可通過調(diào)控M1/M2型巨噬細胞極化，抑制炎癥反應，改善痛風性關(guān)節(jié)炎［17］。本研究使用舒筋活血膠囊治療后，KOA模型大鼠血清IL-1β、TNF-α水平降低，IL-10水平升高，M1型巨噬細胞及M1/M2比值明顯降低，提示舒筋活血膠囊通過降低M1型巨噬細胞比例，改善M1/M2失衡，抑制炎癥反應，改善KOA滑膜炎癥狀。

JAK2/STAT3信號通路在參與炎癥反應、氧化應激、細胞生長與凋亡等多種生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［18-19］。OA中TNF-α、IL-1β等炎性因子可激活JAK2/STAT3信號通路，促進OA的發(fā)生發(fā)展，抑制JAK2/STAT3通路激活，可調(diào)節(jié)軟骨細胞代謝與凋亡［20］。張艷玲等［21］研究表明，溫針灸可通過抑制JAK2、STAT3磷酸化及MMP-9蛋白表達，抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，降低促炎因子分泌，減輕KOA兔軟骨損傷。本研究結(jié)果顯示，舒筋活血膠囊治療KOA大鼠后，滑膜組織p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達水平明顯降低，提示舒筋活血膠囊可抑制JAK2/STAT3信號通路激活。此外，使用JAK2抑制劑AG490可明顯改善KOA大鼠滑膜與軟骨病理損傷，舒筋活血膠囊與AG490的作用結(jié)果類似。以上結(jié)果表明，舒筋活血膠囊可抑制JAK2/STAT3信號通路激活，調(diào)節(jié)M1/M2型巨噬細胞極化，改善KOA大鼠滑膜炎癥狀。本研究還存在一定不足，未檢測滑膜液炎性因子水平，僅檢測滑膜組織相關(guān)蛋白表達，對于滑膜組織巨噬細胞檢測僅使用免疫熒光檢測，未進行流式細胞儀分析，故結(jié)果可能存在一定偏倚。舒筋活血膠囊對KOA的具體作用機制仍需做更深入的研究。

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（2022-11-22收稿 2022-12-20修回）

（本文編輯 李國琪）