蒙古黃芪皂苷對鉛暴露致發(fā)育期大鼠神經(jīng)炎癥與腸道菌群紊亂的影響

胡明月　李鑫　高磊　關(guān)明杰

摘要：目的 探討蒙古黃芪皂苷對鉛暴露致發(fā)育期SD大鼠神經(jīng)炎癥及腸道菌群紊亂的干預效果。方法 40只4周齡SD大鼠隨機分為對照（CG）組，鉛染毒（LE）組，皂苷低、中、高劑量干預（SL、SM、SH）組，相應干預4周后，氫化物原子熒光光譜法檢測大鼠血鉛水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠海馬中腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、IL-1β水平，16S rDNA高通量測序檢測盲腸內(nèi)容物中腸道菌群的組成。結(jié)果 與CG組比較，其余各組血鉛水平均升高，LE組海馬中TNF-α、IL-6和IL-1β水平升高，腸道菌群α、β多樣性顯著改變，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)降低，羅姆布茨菌屬、布勞特氏菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬相對豐度減少，而瘤胃球菌屬、普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度增加（P＜0.05）。與LE組比較，SL、SM組血鉛水平降低（P＜0.05），SL組海馬IL-6水平、SM組IL-1β及SM、SH組海馬TNF-α、IL-6水平降低（P＜0.05），SL、SM組β多樣性及SM組α多樣性顯著改善，SM組Simpson指數(shù)升高（P＜0.05），SH組、SM組瘤胃球菌屬、普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度減少（P＜0.05），SM組羅姆布茨菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬、布勞特氏菌屬及SL組布勞特氏菌屬相對豐度均增加（P＜0.05）。SM組比SH組增加羅姆布茨菌豐度作用更明顯（P＜0.05）。結(jié)論 蒙古黃芪皂苷可有效抑制鉛致發(fā)育期大鼠海馬中的神經(jīng)炎癥反應和腸道菌群的紊亂，且中劑量干預效果明顯。

關(guān)鍵詞：鉛中毒，神經(jīng)系統(tǒng)，兒童；胃腸道微生物組；黃芪皂苷；蒙古黃芪；炎性因子

中圖分類號：R598.11文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221821

Effects of Mongolian astragalus saponin on neuroinflammation and intestinal microflora disorder induced by lead exposure in developing rats

HU Mingyue， LI Xin， GAO Lei， GUAN Mingjie

School of Public Health， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou 014060， China

Corresponding Author E-mail： guanmj1202@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect of Mongolian astragalus saponin on neuroinflammation and intestinal microbiota disorder caused by lead exposure in developing SD rats. Methods Forty 4-week-old Sprague Dawley rats were randomly divided into the control group （CG）， the? lead exposure group （LE） and the saponin intervention groups [high-dose （SH）， medium-dose （SM） and low-dose （SL）]. After 4 weeks of corresponding intervention， blood lead content of rats was detected by hydride generation atomic fluorescence spectrometry. Levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-1β （IL-1β） in hippocampal tissue were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Changes of intestinal microbiota composition in cecal contents were detected by 16S rDNA sequencing. Results Compared with the CG group， blood lead levels were increased in other groups（P＜0.05）， levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in hippocampus were increased in the LE group， and the α and β diversity of intestinal flora were significantly changed in the LE group. Shannon index and Simpson index were decreased， and relative abundance of Romboutsia， Blautia and Lachnospiraceae_UCG-001 was decreased. The relative abundance of Ruminococcus and Prevotellaceae_UCG-001 was increased （P＜0.05）. Compared with the LE group， blood lead levels were decreased in the SL group and the SM group （P＜0.05）. Hippocampal IL-6 level in the SL group， the level of IL-1β in the SM group， levels of TNF-α and IL-6 in the SM group and the SH group were decreased （P＜0.05）. β diversity in the SL group and the SM group， and α diversity in the SM group were significantly improved， and Simpson index was increased in the SM group （P＜0.05）. The relative abundance of Ruminococcus and Prevotellaceae_UCG-001 decreased in the SM group and the SH group （P＜0.05）. The relative abundance of Romboutsia， Lachnospiraceae_UCG-001 and Blautia were significantly increased in the SM group and the SL group （P＜0.05）. The abundance of Romboutsia increased more significantly in the SM group than that in the SH group （P＜0.05）. Conclusion Mongolian astragalus saponins can effectively inhibit neuroinflammatory response and intestinal flora disorder in hippocampus of lead-induced developing rats， and the effect of medium dose intervention is obvious.

Key words： lead poisoning， nervous system， childhood; gastrointestinal microbiome; astragaloside; astragalus membranaceus bungevar.mongholicus（bunge） P.K.Hsiao; inflammatory factor

鉛是一種可以通過呼吸道、胃腸道和皮膚接觸等途徑進入人體并蓄積產(chǎn)生毒性的重金屬元素［1］。兒童是對鉛暴露最敏感和最脆弱的群體，即使低劑量鉛暴露也會影響兒童大腦發(fā)育和神經(jīng)行為［2-3］。鉛透過血腦屏障后主要在腦灰質(zhì)特別是海馬體中累積，可誘發(fā)神經(jīng)炎癥，進而導致神經(jīng)及認知功能障礙［4-5］。近來有研究顯示，鉛暴露與兒童腸道菌群及其代謝組的改變關(guān)系密切［6］，而腸道菌群的變化又與神經(jīng)精神類疾病有著緊密的聯(lián)系［7］。黃芪（astragali radix）為蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一種天然藥物，具有廣泛的藥理作用。蒙古黃芪皂苷（saponin）為蒙古黃芪中主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化及調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌與代謝等作用，在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病上具有較大優(yōu)勢［8］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪皂苷具有抗氧化和神經(jīng)保護作用，可提高鉛暴露大鼠的學習記憶能力［9］。另有文獻報道，黃芪皂苷可通過影響腸道菌群來維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而腸道菌群又能增強其生物利用度，促進人體健康［10］。本研究利用蒙古黃芪皂苷對發(fā)育期鉛暴露大鼠進行干預，觀察大鼠炎性因子及腸道菌群的變化，探討蒙古黃芪皂苷對鉛致神經(jīng)損傷和腸道菌群紊亂的保護效果。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 采用醇提法從中藥蒙古黃芪粗粉（包頭醫(yī)學院藥學院蒙藥藥物資源保護與開發(fā)利用院士工作站）中提取蒙古黃芪皂苷（簡稱皂苷），純度98.22%；0.2%醋酸鉛（上海實驗試劑有限公司）；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6及IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司）；氫化物原子熒光光譜儀（杭州爾首科學儀器有限公司）；多功能酶標儀（美國BioTek有限公司）。

1.2 分組與處理 40只4周齡清潔級雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006；體質(zhì)量55?75 g。適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為對照（CG）組、鉛染毒（LE）組及皂苷低、中、高劑量干預（SL、SM、SH）組，每組8只。結(jié)合課題組前期研究，SL、SM、SH組干預劑量分別為75、150及300 mg/kg［9］。CG組自由飲用純凈水，LE組與皂苷干預組自由飲用0.2%醋酸鉛溶液進行染毒，并在染毒同時分別給予皂苷干預組相應劑量皂苷進行灌胃，CG組與LE組給予相同劑量（10 mL/kg）的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃4周。

1.3 生物樣本采集 大鼠連續(xù)灌胃4周后，禁食12 h，稱體質(zhì)量，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血3 mL，搖勻后置于冰箱-20 ℃保存，用于血鉛水平測定。大鼠取血后立即斷頭處死，剝離腦海馬組織，用預冷的生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干水分稱質(zhì)量，然后于滅菌的EP管內(nèi)加入緩沖液［每0.1 g海馬加入0.9 mL預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）］再放入預冷的勻漿機勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心20 min，收集上清液并分裝于滅菌的EP管，-80 ℃保存。在無菌環(huán)境下，將盲腸內(nèi)容物分離后置于滅菌的EP管內(nèi)，液氮速凍-80 ℃保存。

1.4 大鼠血鉛水平測定 全血樣品消解：取1 mL血液，放入經(jīng)酸缸浸泡、清洗晾干的三角燒瓶中，加入5 mL硝酸-高氯酸（4∶1）混合溶液消化，用2%的鹽酸溶液將消化后產(chǎn)物逐步轉(zhuǎn)入潔凈比色管中，加入5 mL草酸溶液和5 mL鐵氰化鉀溶液，再用2%鹽酸溶液定容至50 mL，搖勻后室溫靜置30 min，4 000 r/min離心10 min取上清液，移入滅菌的EP管中，同時準備好空白管作為對照。鉛標準系列溶液配制后，氫化物原子熒光光譜儀檢測樣品，根據(jù)自動生成的標準曲線，計算全血樣品的血鉛水平。

1.5 ELISA法檢測大鼠海馬組織中炎性因子水平 參照ELISA試劑盒說明書，用多功能酶標儀檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.6 16 S rDNA高通量測序方法檢測大鼠盲腸內(nèi)容物

1.6.1 測序 盲腸內(nèi)容物收集后由上海百趣生物醫(yī)學科技有限公司進行測序。采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對樣本的基因組DNA進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。取適量樣本DNA于離心管中，無菌水稀釋樣本至1 μg/L。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進行聚合酶鏈式反應（PCR）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進行磁珠純化，采用酶標定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒構(gòu)建DNA文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用NovaSeq6000上機測序。

1.6.2 測序數(shù)據(jù)處理 測序得到的原始數(shù)據(jù)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)（dirty data），參照文獻［11］對原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)（effective tags）。

1.6.3 OTU聚類和物種注釋 基于有效數(shù)據(jù)進行聚類和物種分類分析（operational taxonomic units，OTUs）。參照文獻［12］，根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.6.4 樣本復雜度分析（alpha diversity） 使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Alpha多樣性指數(shù)和Shannon、Simpson指數(shù)（物種分布多樣性和均勻度指標）及Chao1指數(shù)（物種豐富度指標）。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線（曲線平坦程度代表測序深度和數(shù)據(jù)量合理性，高度反映物種的豐富度），等級聚類曲線（水平寬度反映物種的豐富度，平滑程度反映物種的均勻程度），從中得到樣本內(nèi)物種豐富度和多樣性信息等。

1.6.5 多樣本比較分析（beta diversity） 基于Bray-Curtis距離，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制無度量多維標定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）分析圖（點與點間的距離反映組間和組內(nèi)差異）及基于weighted_unifrac_wilcox分析組間物種Beta多樣性指數(shù)差異以發(fā)現(xiàn)不同組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。

1.6.6 組間差異物種分析 根據(jù)不同分類水平上物種注釋結(jié)果，選取門水平［厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、擬桿菌門（Bacteroidota）及放線菌門（Actinobacteriota）］及屬水平［羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、毛羅菌科_UCG-001菌屬（Lachnospiraceae_UCG-001）、布勞特氏菌屬（Blautia）、普雷沃菌科_UCG_001菌屬（Prevotellaceae_UCG-001）］優(yōu)勢菌進行統(tǒng)計分析，得到分組間相對豐度變化差異顯著的物種及差異物種在各組的富集情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊者組間多重比較采用LSD-t檢驗；方差不齊者采用Welch's ANOVA分析，組間多重比較采用Games-Howell檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間多重比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠灌胃4周后體質(zhì)量及血鉛水平比較 各組大鼠連續(xù)灌胃4周后，各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義。與CG組比較，LE組及皂苷各劑量干預組大鼠血鉛水平升高（P＜0.05）；與LE組比較，SL組、SM組血鉛水平降低（P＜0.05），但皂苷各劑量干預組間血鉛水平差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織中炎性因子水平比較 與CG組比較，LE組大鼠海馬中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均升高（P＜0.05）；與LE組比較，SL組大鼠海馬中IL-6水平降低（P＜0.05），SM組大鼠海馬中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均降低（P＜0.05），SH組大鼠海馬中TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；皂苷各劑量干預組間差異均無統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 大鼠盲腸內(nèi)容物16 S rDNA測序結(jié)果分析

2.3.1 菌群Alpha多樣性 稀釋曲線趨向平坦，測序深度基本達到飽和，測序數(shù)據(jù)量合理，其中與CG組、SL組、SM組和SH組比較，LE組曲線最低，提示測到的物種種類較少，物種多樣性較低，見圖1A。等級聚類曲線顯示，與CG組比較，LE組曲線在橫軸上的跨度小，物種豐富度低，曲線較陡峭，物種分布參差；與LE組比較，SL組、SM組、SH組曲線在橫軸上的跨度大，物種豐富度高，曲線平緩，物種分布均勻，見圖1B。與CG組比較，LE組Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均降低（P＜0.05）；與LE組比較，SM組Simpson指數(shù)升高（P＜0.05）；SL組、SM組和SH組間3個指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.3.2 組間群落結(jié)構(gòu)差異分析 NMDS結(jié)果示各組間聚類具有一定的區(qū)別，見圖2A。Beta多樣性指數(shù)分析顯示，LE組與CG組、SL組、SM組間群落差異明顯（F=2.259，P＜0.05），見圖2B。

2.3.3 組間差異物種分析 （1）在門水平上，厚壁菌門、疣微菌門、擬桿菌門及放線菌門均是各組大鼠腸道菌群中的絕對優(yōu)勢菌種，占總序列的95%以上，見圖3。但以上4種菌門在各組大鼠腸道菌群中相對豐度差異均無統(tǒng)計學意義（H=5.976、4.601、2.180、8.188，P＞0.05），見圖4。（2）在屬水平上，與CG組比較，LE組羅姆布茨菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬、布勞特氏菌屬相對豐度減少，瘤胃球菌屬、普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度增加（P＜0.05），SL組毛羅菌科_UCG-001菌屬相對豐度減少（P＜0.05）。與LE組比較，SL組布勞特氏菌屬相對豐度增加（P＜0.05）；SM組瘤胃球菌屬及普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度均減少，而羅姆布茨菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬及布勞特氏菌屬相對豐度增加（P＜0.05）；SH組瘤胃球菌屬和普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度減少（P＜0.05）。與SM組比較，SH組羅姆布茨菌屬相對豐度降低（P＜0.05）。見表4。

3 討論

研究認為，4周齡SD大鼠相當于兒童6～7歲階段［13］。研究顯示，通過自由飲用不同濃度醋酸鉛對小鼠進行染毒，小鼠體質(zhì)量沒有顯著變化［14］。本研究結(jié)果亦顯示，鉛暴露沒有引起發(fā)育期大鼠體質(zhì)量降低，可能此濃度鉛暴露不足以引起體質(zhì)量的減輕。但鉛會在發(fā)育期大鼠體內(nèi)蓄積，血液中的鉛水平是常用的鉛暴露評價指標［15］。本研究結(jié)果顯示，相較于CG組，其余組的血鉛水平均升高，表明醋酸鉛暴露能增加發(fā)育期大鼠體內(nèi)鉛的蓄積；而與LE組相比，SH組可能由于皂苷劑量過高，血鉛水平降低并不顯著，但SL、SM組的血鉛水平均降低，表明蒙古黃芪皂苷可以有效抑制鉛在發(fā)育期大鼠體內(nèi)的累積。

鉛暴露可在多個組織中誘導炎癥反應，從而威脅人體健康［16］。研究顯示，鉛暴露引起的神經(jīng)炎癥是導致鉛神經(jīng)毒性的主要原因，而海馬中星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞過度活化可促進TNF-α、IL-6、IL-1β和抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等因子的釋放［17］。本研究結(jié)果亦顯示，相較于CG組，LE組海馬中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平上升，表明醋酸鉛暴露可以引起發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)炎癥；而與LE組相比，SL組海馬IL-6水平，SM組海馬TNF-α、IL-6及IL-1β水平，SH組海馬TNF-α、IL-6水平降低，表明蒙古黃芪皂苷具有抗炎活性，可以有效抑制因鉛暴露引起的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但各劑量組間各炎性指標差異無統(tǒng)計學意義，表明其神經(jīng)保護與藥物劑量關(guān)系不大。

近年來有研究顯示，鉛暴露可以引起兒童或動物腸道菌群的紊亂，主要是菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)的改變［6，18］。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于CG組，LE組大鼠腸道菌群α、β多樣性顯著改變，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)減小，雖然2組在門水平上菌群相對豐度差異無統(tǒng)計學意義，但在屬水平上，LE組羅姆布茨菌屬、布勞特氏菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬相對豐度顯著減少，瘤胃球菌屬、普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度顯著增加，表明鉛暴露可以導致發(fā)育期大鼠腸道菌群多樣性降低及群落結(jié)構(gòu)紊亂，這可能與鉛對腸道屏障的損害或腸道代謝產(chǎn)物的改變有關(guān)。另外，與LE組相比，SM組大鼠腸道菌群α多樣性Simpson指數(shù)增加，SM、SH組瘤胃球菌屬、普雷沃菌科_UCG-001菌屬相對豐度減少，SM組羅姆布茨菌屬、毛羅菌科_UCG-001菌屬、布勞特氏菌屬及SL組布勞特氏菌屬相對豐度均顯著增加，表明蒙古黃芪皂苷可以有效調(diào)節(jié)鉛致發(fā)育期大鼠腸道菌群紊亂的功能，且中劑量干預組效果顯著，考慮其機制可能是黃芪皂苷通過影響腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)、代謝以及腸道細胞功能等方式維持腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而實現(xiàn)鉛對發(fā)育期大鼠腸道健康的損傷的預防。

研究認為，腸道菌群的紊亂影響依賴短鏈脂肪酸、神經(jīng)遞質(zhì)等其產(chǎn)生的副產(chǎn)物，進而通過腸-腦軸對大腦產(chǎn)生影響，最終引發(fā)抑郁癥、焦慮癥、精神分裂癥、自閉癥、阿爾茨海默病和帕金森病等精神類疾?。?］。增加腸道嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌 、發(fā)酵乳桿菌及長雙歧桿菌等益生菌水平可改善鉛暴露所致神經(jīng)行為改變或神經(jīng)損傷［19］。在克羅恩病患者癥狀發(fā)作期間，瘤胃球菌屬大量繁殖并產(chǎn)生炎癥多糖，誘導樹突狀細胞產(chǎn)生炎性因子，TNF-α是克羅恩病的炎癥標志物［20］。有研究顯示，降低普雷沃菌科_UCG-001數(shù)量可改善大鼠抑郁樣行為，其機制可能與增加短鏈脂肪酸水平并抑制腸道炎癥有關(guān)［21］。羅姆布茨菌屬和毛螺菌屬能促進丁酸生成，而丁酸對人體腸道及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用［22-23］。布勞特氏菌屬毛羅菌科，可緩解炎癥性疾病和代謝性疾病，所以筆者推測，鉛致發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)炎癥可能與腸道菌群紊亂有關(guān)，蒙古黃芪皂苷可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的紊亂來干預鉛對發(fā)育期大鼠的神經(jīng)毒性作用，但其相關(guān)機制還需進一步研究。

綜上所述，鉛暴露可以引起發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)炎癥及腸道菌群的紊亂，蒙古黃芪皂苷可有效調(diào)節(jié)鉛暴露所致發(fā)育期大鼠海馬中炎性因子的改變以及腸道菌群紊亂，發(fā)揮神經(jīng)及腸道保護作用。腸道菌群的改變可能是鉛致神經(jīng)炎癥甚至神經(jīng)損傷機制之一，蒙古黃芪皂苷可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，從而改善鉛暴露所致的神經(jīng)毒性作用。

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（2022-11-07收稿 2023-02-14修回）

（本文編輯 陸榮展）