醫(yī)院感染患者凝固酶陰性葡萄球菌的藥敏試驗以及耐藥基因研究*

謝曉娟, 蘭天, 高晶

河北北方學院附屬第一醫(yī)院感染管理處(河北張家口 075000)

醫(yī)院感染是指患者住院期間發(fā)生的感染和院內(nèi)獲得后在院外發(fā)生的感染,雖然不斷的有新的抗菌藥物被開發(fā)出來,但細菌耐藥性也在增加[1],而且臨床篩檢手段落后難以及時針對性用藥,導致感染發(fā)生率居高不下,感染并發(fā)癥也提高了患者的死亡率[2-3]。由于高強度應用抗菌藥物以及廣泛開展介入操作導致凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)感染率逐年上升,CNS在革蘭陽性菌群中檢出率高達30%[4],且CNS中耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)占比90%[5],MRCNS具有多重耐藥性,在藥物應用和選擇方面受到諸多限制,提高了臨床治療難度與成本。葡萄球菌在自然界廣泛存在,多為非致病腐物寄生菌[6],金黃色葡萄球菌是常見的病原菌,在人鼻咽部及頭發(fā)上大量存在,報道稱普通人鼻咽部葡萄球菌帶菌率為30%左右[7],醫(yī)務人員金黃色葡萄球菌帶菌率在50%～70%[8]。CNS是指不含凝固酶的葡萄球菌,該菌由于缺乏凝固酶無法促使血漿凝固以及纖維蛋白沉積,使感染容易擴散[9]。CNS對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等抗菌藥物均有不同程度的耐藥,其耐藥機制復雜,當菌株本身的耐藥基因被激活或者引入外來耐藥基因均可以表現(xiàn)出耐藥[10]?；诖?本研究對2020年10月1日至2021年9月30日全院醫(yī)院感染患者CNS的藥敏情況及相關耐藥基因進行研究,現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年10月1日至2021年9月30日全院臨床分離的CNS株共267株,菌株分離自患者痰液微生物送檢標本,患者94例,男65例,女29例;年齡41～77歲,平均(65.34±4.82)歲。本次研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 按照第四版《全國檢驗技術操作規(guī)程》對菌株進行分離,之后使用采用PHOENIX 100全自動細菌鑒定系統(tǒng)(美國BD公司)對菌株進行鑒定,采用增菌培養(yǎng)法對菌株進行培養(yǎng)。通過Kirby-Bauer紙片擴散法(Oxoid公司)與E-test法(鄭州安圖生物工程股份有限公司)對分離的菌株進行藥敏試驗,分別檢測菌株對青霉素G、苯唑西林、慶大霉素、利福平、環(huán)丙沙星、復方新諾明、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素、四環(huán)素13種抗菌藥物的敏感度。藥敏試驗結果采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會判斷標準進行判斷,分為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。敏感率=敏感菌株數(shù)/總株數(shù)×100%,耐藥率=耐藥菌株數(shù)/總株數(shù)×100%。質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923(國家臨床檢驗中心)。

1.2.2 耐藥基因 首先制備菌株DNA,將凍存的菌株復溫后接種于MH營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)16 h,之后選取MH平板上的單個CNS菌落并將其全部溶于含有溶菌酶的核酸緩沖液中,37℃恒溫30 min,100℃恒溫15 min,之后12 000 r/min離心10 min并取上清液。檢測基因包括mecA(耐β-內(nèi)酰胺類)、aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ(耐氨基糖苷類)、tetM(耐四環(huán)素類)、ermA和ermC(耐大環(huán)內(nèi)酯類)、qacA/B/C(耐消毒劑類)、gyrA(耐喹諾酮類),基因引物設計、訂購于上海生工有限公司。擴增體系為25 μL(mix 2×12.5 μL、Taq 1 μL、正反引物各1 μL、DNA樣本1 μL,dd水8.5 μL),適度離心混勻放入擴增儀進行擴增,同時設置陰性對照與陽性對照。擴增條件為:95℃預變性10 min,95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)35次,72℃延伸10 min。

1.2.3 基因測序 采用RT-PCR對一個CNS菌株進行測序,首先制備菌株DNA,將凍存的菌株復溫后接種于MH營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)16 h,之后選取MH平板上的單個CNS菌落并將其全部溶于含有溶菌酶的核酸緩沖液中,37℃恒溫30 min,100℃恒溫15 min,之后12 000 r/min離心10 min并取上清液。

2 結果

2.1 CNS菌種分布 CNS共267株,其中占比最大的菌種為表皮葡萄球菌共140株,占比52.43%;其次為人葡萄球菌共39例,占比14.61%。見表1。

表1 CNS菌種分布

2.2 CNS藥敏試驗情況 CNS共267株,其中MRCNS 204株,占比76.40%,未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥株。見表2。

表2 CNS藥敏試驗情況 %

2.3 CNS耐藥基因分析 CNS共267株,其中94.75%的菌株攜帶mecA耐藥基因,74.15%攜帶ermA耐藥基因,69.66%攜帶tetM耐藥基因。見表3。

2.4 臨床結局單因素logistic回歸分析 臨床結局分為:治愈、好轉、無效與惡化;其中治愈與好轉為良好臨床結局。分析患者年齡、性別、耐藥基因對良好臨床結局的影響,由研究結果可知年齡、mecA基因耐藥基因、qacA/B/C耐藥基因為CNS良好臨床結局的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 良好臨床結局單因素logistic回歸分析

3 討論

由于高強度應用抗菌藥物以及開展中心靜脈置管等介入操作,醫(yī)院感染率近年呈現(xiàn)上升趨勢,臨床常常經(jīng)驗性給予患者青霉素及頭孢類抗菌藥物,非針對性用藥不僅難以達到理想的療效也會導致耐藥菌株增加,引發(fā)患者自身菌群失調(diào)使病情變得復雜[11]。革蘭陽性菌占所有致病菌的44%,金黃色葡萄球菌與CNS為革蘭陽性菌的主要致病菌,CNS在空氣、皮膚表面等廣泛存在,屬于正常菌群,臨床常規(guī)多作為污染菌株處理,但是介入操作等侵入性操作的增多使CNS成為醫(yī)院感染的重要病原菌[12],染色體胞間黏附基因能夠使CNS吸附在光滑材料表面,之后胞間凝集素能夠促進細胞黏附,細菌包埋于黏附物之中形成生物膜。生物膜能夠阻斷抗生素與細菌接觸[13],使抗菌藥物的實際有效濃度下降,同時生物膜能夠覆蓋細菌表面的抗原位點,表現(xiàn)出極強的耐藥性。CNS可以導致泌尿系統(tǒng)感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥等[14]。

本次研究分離CNS共267株,其中占比最大的菌種為表皮葡萄球菌共140株,占比52.43%;其次為人葡萄球菌共39例,占比14.61%。在267株CNS中,MRCNS 204株,占比76.40%,未發(fā)現(xiàn)萬古霉素、利奈唑胺耐藥株;臨床可以將萬古霉素及利奈唑胺作為抗菌首選藥物,MRCNS 呈現(xiàn)高度耐藥性和多重耐藥性,對青霉素G、苯唑西林、克林霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明等都具有60%以上的耐藥率,其中對青霉素、苯唑西林耐藥率極高,應該避免將其作為首選治療藥物。267株CNS中,94.75%的菌株攜帶mecA耐藥基因,74.15%攜帶ermA耐藥基因,69.66%攜帶tetM耐藥基因。分析患者年齡、性別、耐藥基因對臨床結局的影響,由研究結果可知年齡、mecA基因耐藥基因、qacA/B/C耐藥基因為CNS臨床結局的影響因素(P<0.05)。mecA 基因可以編碼產(chǎn)生青霉素結合蛋白,使細菌對β-內(nèi)酰胺酶親和力下降,引發(fā)耐藥,菌株質?？梢越閷Мa(chǎn)生大量 β-內(nèi)酰胺酶,其可以水解 β-內(nèi)酰胺使 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物失效[15-17]。 攜帶有mecA以外的耐藥基因,使菌株具有多重耐藥性。aac(6′)/aph(2′)和aph3′-Ⅲ能夠編碼氨基糖苷類修飾酶[16],能夠使菌株對慶大霉素等高度耐藥,兩種耐藥基因單獨或共同存在均可以產(chǎn)生耐藥作用,目前仍有不同的觀點認為兩者為氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的主要基因。ermA、ermC耐藥基因可以編碼產(chǎn)生紅霉素甲基化酶,能夠促進病原菌生物膜表型發(fā)生變化產(chǎn)生耐藥性[18-19],有研究發(fā)現(xiàn)ermC基因表達水平越高,菌株對紅霉素的抗性會隨之升高[20]。有研究顯示90%以上的紅霉素耐藥菌株會攜帶一種以上的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因,但是仍由部分紅霉素耐藥菌株無erm、msr等基因,提示存在其他耐藥機制[21-22]。有研究調(diào)查顯示50%以上的CNS菌株質粒中均存在qacA/B/C基因,其可以表達消毒劑外排蛋白,其表達會顯著提高菌株對消毒劑的耐力,提示臨床消毒并無法徹底除菌,應該注意自身防護[23-24]。

綜上所述,感染CNS可首選萬古霉素、利奈唑胺進行抗菌治療,CNS耐藥涉及多種耐藥機制,且單個菌株常合并表達多個耐藥基因,經(jīng)單因素logistic回歸分析結果顯示mecA與qacA/B/C耐藥基因為患者臨床結局的獨立影響因素。

利益相關聲明:所有作者無相關利益沖突。

作者貢獻說明:謝曉娟、蘭天負責課題設計與論文撰寫;高晶負責病例收集與統(tǒng)計分析。