NETO2介導(dǎo)的ERK通路表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系*

陸珣珣, 韋曙平, 韋富貴

廣西科技大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣西柳州 545006)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最具侵襲性和致死性的惡性腫瘤之一[1]。晚期患者的5年內(nèi)的存活率僅為30%,超過20%的患者已經(jīng)出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期局部疾病,這是OSCC相關(guān)死亡的主要原因[2-3]。最近,許多研究人員已經(jīng)確定了OSCC增殖和轉(zhuǎn)移的預(yù)后標(biāo)志物,如RACK1、NLRC3、HAX-1,并確定了一些驅(qū)動(dòng)事件[2-4]。然而,OSCC患者的預(yù)后仍然很差。因此,闡明OSCC的潛在分子機(jī)制將有助于開發(fā)更多創(chuàng)新和有效的方法來降低患有這種疾病的患者的死亡率。神經(jīng)纖毛及唾樣蛋白2(neuropilin and tolloid-like 2,NETO2)屬于CUB結(jié)構(gòu)域和含有LDLa的獨(dú)特亞家族的跨膜蛋白,它們通過減慢或加速脫敏恢復(fù)來調(diào)節(jié)神經(jīng)元紅藻氨酸受體[5-6]。雖然NETO2最初被認(rèn)為是一種神經(jīng)元特異性蛋白,但越來越多的證據(jù)表明NETO2的表達(dá)可在幾種癌癥中檢測(cè)到[7-9]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),NETO2在胰腺癌的腫瘤進(jìn)展中起重要作用[8]。此外,高水平的NETO2與結(jié)直腸癌的臨床病理學(xué)特征和較差的生存率相關(guān)[9]。然而,關(guān)于NETO2的表達(dá)模式及其在OSCC進(jìn)展中的臨床意義的報(bào)道很少。在本研究中,我們檢查了NETO2的臨床意義,并進(jìn)一步分析了NETO2高表達(dá)與預(yù)后不良與患者生存率之間的相關(guān)性。此外,研究在體外實(shí)驗(yàn)中考察NETO2敲低對(duì)OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中獲得519個(gè)OSCC組織和44個(gè)非OSCC組織的mRNA表達(dá)譜并進(jìn)行分析。利用基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)計(jì)算OSCC患者的總生存率。

1.2 臨床標(biāo)本 組織樣本取自2020年11月至2022年1月本院接受手術(shù)治療且術(shù)前未進(jìn)行化療或放療的OSCC患者124份癌標(biāo)本及配對(duì)正常組織(距腫瘤邊緣5 cm)。沒有患者術(shù)前接受局部或全身化療、放療或靶向治療,所有組織均由兩名病理學(xué)家進(jìn)行組織學(xué)鑒定。切除的標(biāo)本立即處理并儲(chǔ)存在-80 ℃。所有OSCC參與者都獲得了知情同意患者和樣本,研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(倫審2019-042)。

1.3 免疫組化 厚度為5 μm的石蠟切片在65 ℃下烘烤1 h。在免疫染色之前,石蠟切片在酒精系列中進(jìn)行脫蠟和再水合,然后在檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液中通過微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。切片用5%正常山羊血清封閉,并與NETO2的一抗在4 ℃下孵育過夜。然后用UltraSensitive S-P Ultrasensitive試劑盒(辣根過氧化物酶[HRP],抗兔)檢測(cè)免疫反應(yīng),并用3, 3′-二氨基聯(lián)苯胺底物觀察。在顯微鏡下觀察圖像。通過半定量免疫反應(yīng)性評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)水平。染色強(qiáng)度為0(無)、1(弱)、2(中)、3(強(qiáng)),陽性染色細(xì)胞比例為無、<10%、10%～50%和>50%分別計(jì)為1、2、3、4。將以上兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘得到最終分?jǐn)?shù)如下:0～2,(-);3～4,(+);5-8,(++);和9～12,(+++)。其中(-)和(++)定義為NETO2低表達(dá),(++)和(+++)定義為NETO2高表達(dá)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌細(xì)胞系HSC-4細(xì)胞(美國(guó)ATCC)接種在含有10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)和1%雙抗生素(青霉素/鏈霉素)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)1為了考察NETO2對(duì)HSC-4細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲影響。將HSC-4細(xì)胞分為NETO2敲低(sh1、sh2)組和相應(yīng)對(duì)照(NC)組;其中NC組和sh1、sh2組分別使用Lipofectamine2000將NC、sh1或sh2轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。實(shí)驗(yàn)2考察ERK信號(hào)通路是否是OSCC中NETO2的關(guān)鍵下游靶標(biāo),將HSC-4細(xì)胞分為NETO2敲低(sh1、sh1+EGF)組和相應(yīng)對(duì)照(NC)組;其中NC組和sh1組、sh1+EGF組分別使用Lipofectamine2000將NC或sh1轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h,sh1+EGF組在轉(zhuǎn)染后加入ERK激動(dòng)劑(表皮生長(zhǎng)因子[Epidermal growth factor,EGF,純度≥99%,美國(guó)Med Chem Express公司],用DMSO稀釋成40 ng/mL)處理24 h。NC組和sh1組加入DMSO處理24 h。

1.5 慢病毒制備 表達(dá)靶向NETO2的pLKO.1 shRNA的慢病毒載體獲自美國(guó)Open Biosystems公司。使用Lipofectamine 2000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)將慢病毒載體與包裝載體pCMVΔR8.9和包膜載體pCMV-VSVG共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中用于慢病毒生產(chǎn)。收集病毒以用8 μg/mL聚凝胺(北京Solarbio公司)感染HSC-4細(xì)胞。用嘌呤霉素(Solarbio)(3 μg/mL)選擇穩(wěn)定的感染細(xì)胞48 h。本研究中使用的shRNA序列如下:非特異性對(duì)照(NC),5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAG-AACGTTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3′;shRNA1 NETO2(sh1),5′-CCGGGCTGCACTTCAGA-CGAATTCTCAAGAGAAATTCGTCTGAAGTGCAGC-TTTTTTG-3′;shRNA2 NETO2(sh2),5′-CCGG-GCAAGAATICTGTGACTATCCTCAAGAGAATAGTC-ACAGAATTCTTGCTTTTTTG-3′。

1.6 Western blot分析 通過放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液制備OSCC組織或細(xì)胞蛋白質(zhì),并通過BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(上海Beyotime公司)進(jìn)行定量。對(duì)樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE分離,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(美國(guó)Millipore公司)。將膜用5%脫脂牛奶封閉,用一抗在4℃下孵育過夜,并與相應(yīng)的HRP偶聯(lián)二抗孵育1 h,通過ECL Plus(美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)印跡帶。使用的抗體包括針對(duì)NETO2(美國(guó)Abcam公司),ERK(ERK1/2,美國(guó)CST公司),Nrf2(美國(guó)CST公司)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶,作為陰性對(duì)照,美國(guó)Abcam公司)的一抗(均購自美國(guó)Proteintech公司)。

1.7 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 通過Cell Counting Kit-8(CCK-8,日本Dojindo公司)評(píng)估細(xì)胞活力。對(duì)于CCK-8測(cè)定,將總共1×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中并孵育過夜。然后,在指定時(shí)間點(diǎn)(2、4和6 d)向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液試劑,并將細(xì)胞在黑暗中孵育2 h。隨后,通過Bio-Tek Elx 800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek Instruments公司)測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.8 克隆形成測(cè)定 將500個(gè)細(xì)胞接種在含有2 mL新鮮培養(yǎng)基的6孔板中,并生長(zhǎng)2周?？梢娋溆?.1%結(jié)晶紫染色,計(jì)算集落數(shù)。

1.9 細(xì)胞遷移、侵襲測(cè)定 使用具有8 μm孔徑的24孔Transwell插入物(美國(guó)Corning公司)進(jìn)行遷移測(cè)定。將 200 μL不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中的1×104個(gè)細(xì)胞接種在上室中,并在每個(gè)下室中加入600 μL含有20% FBS的培養(yǎng)基。37 ℃孵育24 h后,遷移的細(xì)胞用100%甲醇固定20 min,室溫下用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min。在顯微鏡下對(duì)遷移的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和記錄。

Transwell Matrigel侵襲試驗(yàn)使用孔徑為8 μm的24孔Transwell插入物(美國(guó)Corning公司)進(jìn)行。用200 μg/mL Corning Matrigel基質(zhì)(美國(guó)Corning公司)包被24孔可滲透支撐板,然后在37 ℃下孵育5 h以固化基質(zhì)凝膠基質(zhì)。從接種細(xì)胞開始的以下步驟同細(xì)胞遷移測(cè)定。

1.10 RNA免疫沉淀(RIP-seq)分析 總RNA使用ZnCl2進(jìn)行片段化,并與抗NETO2多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)在4℃下孵育2 h,然后處理與蛋白 A/G 磁珠在4℃下再作用 2 h。純化結(jié)合的RNA,然后用于測(cè)序文庫構(gòu)建和qRT-PCR。使用Illumina Next-Seq 500測(cè)序儀對(duì)該文庫進(jìn)行測(cè)序,參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行基因本體論(GO)的基因集富集分析(GSEA)分析[10]。使用ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp)的ToppFun模塊對(duì)HSC-4細(xì)胞中降低的基因進(jìn)行GO-GSEA分析。Benjamini-Hochberg調(diào)整后的P值(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[FDR])<0.05的本體術(shù)語被認(rèn)為是顯著豐富。使用pidpathway的GSEA工具包進(jìn)行通路分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)均以至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。兩組獨(dú)立樣本的比較采用雙樣本t檢驗(yàn)。使用重復(fù)測(cè)量方差分析分析細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用2檢驗(yàn)分析臨床組織切片的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NETO2在OSCC組織中異常表達(dá),與OSCC患者預(yù)后不良呈正相關(guān) 為了探索NETO2在OSCC進(jìn)展中的表型表達(dá)和臨床意義,我們首先分析了GEPIA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)NETO2在OSCC組織中的表達(dá)顯著增加(圖1-A)。隨后檢測(cè)了癌標(biāo)本中NETO2的蛋白水平,并與配對(duì)的正常組織進(jìn)行了比較。Western blot結(jié)果顯示NETO2蛋白(1.00±0.03vs. 3.88±0.42,t=5.903,P<0.001,圖1-B)表達(dá)在OSCC標(biāo)本升高。此外,通過IHC分析評(píng)估了OSCC患者中NETO2高表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性(圖1-C、D),并在124份癌標(biāo)本中確定98例NETO2高表達(dá)和26例NETO2低表達(dá)。如表1所示,NETO2高表達(dá)與OSCC的TNM分期(P=0.045)、分化中等和差(P=0.021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)和復(fù)發(fā)(P=0.016)有關(guān)。使用GEPIA中Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫分析了NETO2的表達(dá)水平與OSCC患者的總生存期(OS)之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)NETO2低表達(dá)患者具有更好的生存預(yù)期(圖1-E)。

表1 臨床病理特征和NETO2表達(dá)的單因素分析 例

注:A:通過GEPIA數(shù)據(jù)庫評(píng)估OSCC組織和正常對(duì)照組織中的NETO2表達(dá);*P<0.05;B:通過蛋白質(zhì)印跡檢查OSCC和非OSCC組織中的相對(duì)NETO2表達(dá)水平(N=非OSCC組織,T=OSCC組織);C、D:通過IHC分析評(píng)估了OSCC組織中NETO2低表達(dá)(C)和高表達(dá)(D)代表圖(比例尺=50 μm);E:使用GEPIA中Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫分析了NETO2的表達(dá)水平與OSCC患者的總生存期(OS)之間的相關(guān)性

2.2 靶向NETO2表達(dá)對(duì)OSCC進(jìn)展的影響 為了研究NETO2調(diào)控OSCC的潛在分子機(jī)制,我們使用兩種不同的短發(fā)夾RNA(shRNA1和shRNA2;以下統(tǒng)稱為sh1和sh2)敲低了HSC-4細(xì)胞中NETO2的表達(dá)。與非特異性對(duì)照(NC)相比,sh1組和sh2組均顯著降低了NETO2蛋白的表達(dá)(圖2-A)。NETO2敲低抑制了OSCC細(xì)胞的增殖(圖2-B)和集落形成(圖2-C和2-D),表明NETO2對(duì)OSCC生長(zhǎng)至關(guān)重要。我們進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞遷移試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)NETO2敲低顯著降低了OSCC細(xì)胞的遷移(圖2-E和2-F)。此外,細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示,NETO2敲低會(huì)降低HSC-4細(xì)胞的侵襲能力(圖2-G和2-H)。總的來說,我們的體外結(jié)果揭示了NETO2在調(diào)節(jié)OSCC進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。

注:A:蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)HSC-4細(xì)胞中NETO2敲低;B:CCK8評(píng)估的NC或sh-NETO2細(xì)胞的生長(zhǎng);C、D:HSC-4細(xì)胞的集落形成測(cè)定(C)和量化數(shù)據(jù)(D);E、F:HSC-4細(xì)胞的遷移試驗(yàn)(E)和定量數(shù)據(jù)(F);G、H:HSC-4細(xì)胞的侵襲測(cè)定(G)和定量數(shù)據(jù)(H)。*與NC組比較P<0.001

2.3 NETO2調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路 我們接下來進(jìn)行了RNA免疫沉淀測(cè)序以確定NETO2在調(diào)節(jié)OSCC中的下游靶標(biāo)和潛在分子機(jī)制?；虮倔w論(GO)的基因集富集分析(GSEA)揭示了OSCC細(xì)胞中NETO2的敲低導(dǎo)致ERK信號(hào)通路基因表達(dá)的顯著變化(圖3-A),表明NETO2在調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的潛在功能。ERK信號(hào)通路是癌癥中重要的致癌通路,因此,我們進(jìn)一步研究了NETO2在OSCC中ERK通路調(diào)控中的作用。蛋白質(zhì)印分析顯示,NETO2敲低導(dǎo)致NETO2、ERK及其下游Nrf2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)(圖3-B、C)。

注: A:GO-GSEA確定了與731個(gè)基因相關(guān)的富集基因本體過程,并確定ERK信號(hào)通路基因表達(dá)的顯著變化。B、C:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)HSC-4細(xì)胞中NETO2和ERK信號(hào)通路蛋白水平。與NC組比較,*P<0.05, **P<0.01

2.4 ERK通路激活可挽救NETO2敲低OSCC細(xì)胞中的OSCC進(jìn)展 為了確定ERK信號(hào)通路是否是OSCC中NETO2的關(guān)鍵下游靶標(biāo),我們通過在NETO2敲低的細(xì)胞中加入ERK激動(dòng)劑(EGF)激活ERK進(jìn)一步進(jìn)行了拯救測(cè)定。如圖4-A和4-B所示,與sh1組相比,sh1+EGF組增加了NETO2敲低細(xì)胞中ERK的表達(dá)(P<0.05),表明ERK信號(hào)通路激活。此外,sh1+EGF組的NETO2敲低OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、集落形成能力、遷移和侵襲均顯著高于sh1組(P<0.05),見圖4-C、D、E、F、G。這些數(shù)據(jù)支持ERK信號(hào)通路是NETO2的重要下游靶點(diǎn),對(duì)其促進(jìn)OSCC進(jìn)展的功能至關(guān)重要。

注:A、B: NETO2敲低的OSCC細(xì)胞中ERK表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡圖和定量分析。C:CCK8測(cè)定ERK通路激活對(duì)NETO2敲低OSCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。D、E:ERK通路激活對(duì)NETO2敲低OSCC細(xì)胞集落形成測(cè)定(D)和量化數(shù)據(jù)(E)。F、G:ERK通路激活對(duì)NETO2敲低OSCC細(xì)胞侵襲、遷移分析(F)和量化數(shù)據(jù)(G)。與NC組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

盡管目前已在闡明OSCC分子機(jī)制方面取得了進(jìn)展,但OSCC仍然具有高死亡率、高轉(zhuǎn)移率和較差的預(yù)后。由于腫瘤發(fā)生進(jìn)展復(fù)雜且缺乏靶向治療,手術(shù)已成為OSCC的主要治療方法。以前對(duì)NETO2的研究表明該基因與神經(jīng)元特異性過程有關(guān),例如腦興奮性突觸傳導(dǎo)[11]。最近的研究將NETO2與各種癌癥中的致癌基因聯(lián)系起來,并證實(shí)NETO2表達(dá)可作為腎癌和結(jié)直腸癌早期診斷和預(yù)測(cè)晚期腫瘤進(jìn)展的工具[9, 12]。還有研究發(fā)現(xiàn),NETO2與胃癌的臨床病理學(xué)特征密切相關(guān),并促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移[13]。然而,NETO2在OSCC中的作用和臨床相關(guān)性知之甚少。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)NETO2在OSCC中顯著上調(diào),并與OSCC的TNM分期(P=0.045)、分化中等和差(P=0.021)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)和復(fù)發(fā)(P=0.016)有關(guān)。此外,生存分析顯示,NETO2高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。多項(xiàng)研究報(bào)道,NETO2可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),并且NETO2蛋白升高與肺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌的預(yù)后不良有關(guān)[9, 13]。這些結(jié)果表明,NETO2上調(diào)在OSCC進(jìn)展中起重要作用。

在體外研究中,我們發(fā)現(xiàn)NETO2敲低降低了OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。先前的研究發(fā)現(xiàn),NETO2刺激食管癌細(xì)胞增殖,同時(shí)在體外抑制細(xì)胞凋亡并在體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)。此外,NETO2的敲低與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的調(diào)節(jié)相結(jié)合,顯著抑制了食管癌細(xì)胞遷移和侵襲[7]。Liu等[13]研究證實(shí),NETO2是一種重要的癌蛋白,可能激活TNFRSF12A/PI3K/AKT/NF-κB/Snail軸以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)合這些研究,我們的工作提供了強(qiáng)有力的體外證據(jù),支持NETO2在調(diào)節(jié)OSCC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的重要功能。

從機(jī)制上講,我們發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路是一個(gè)關(guān)鍵的NETO2靶標(biāo),它介導(dǎo)NETO2促進(jìn)OSCC進(jìn)展的功能。ERK信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的通路,它調(diào)節(jié)癌癥生物學(xué)的許多方面[14]。ERK在OSCC中顯著上調(diào),ERK通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)促進(jìn)了OSCC的起始和進(jìn)展[15]。因此,靶向ERK通路是治療OSCC的一種很有前景的治療策略。先前的研究發(fā)現(xiàn),NETO2介導(dǎo)的m6A修飾可以調(diào)節(jié)下游mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性和翻譯[7]。我們的數(shù)據(jù)顯示,NETO2敲低降低了ERK的表達(dá)水平,表明NETO2可能參與調(diào)節(jié)ERK的穩(wěn)定性。然而,NETO2是否通過介導(dǎo)m6A修飾調(diào)節(jié)ERK mRNA的穩(wěn)定性值得進(jìn)一步研究。此外,我們發(fā)現(xiàn)使用EGF激活ERK通路可以挽救NETO2敲低細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力,表明NETO2通過調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路促進(jìn)OSCC進(jìn)展。

總之,目前的研究表明,OSCC組織中高水平的 NETO2表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。 NETO2是一種重要的癌蛋白,可能激活ERK信號(hào)通路以促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,NETO2可能作為OSCC新的預(yù)后指標(biāo)和潛在治療靶點(diǎn)。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:陸珣珣負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)論文撰寫和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),韋曙平負(fù)責(zé)論文研究, 韋富貴負(fù)責(zé)論文修改。