不同產(chǎn)地赤芝藥材的質(zhì)量分析

曾 秒，謝孟君，祝子喻，俞月婷，張 梅

不同產(chǎn)地赤芝藥材的質(zhì)量分析

曾 秒，謝孟君，祝子喻，俞月婷，張 梅*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

對(duì)不同產(chǎn)地批次赤芝進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為靈芝藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及優(yōu)質(zhì)赤芝原料藥的篩選提供依據(jù)。收集15批次各GAP基地的靈芝藥材，參照《中國(guó)藥典》2020年版方法及行業(yè)通用方法，考察其水分、灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物，分別采用比色法、柱前衍生高效液相色譜法（PMP-HPLC）、高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定多糖含量并進(jìn)行比較；采用比色法測(cè)定三萜甾醇含量，HPLC法進(jìn)行靈芝酸A一測(cè)多評(píng)；同時(shí)對(duì)15批赤芝的HPLC指紋圖譜進(jìn)行差異比較。15批赤芝藥材均符合《中國(guó)藥典》2020年版的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，指紋圖譜聚類分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果表明山東聊城產(chǎn)赤芝能明顯區(qū)別于其他批次樣品。15批赤芝藥材均符合《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明國(guó)內(nèi)赤芝GAP基地種植質(zhì)量良好；同時(shí)山東聊城產(chǎn)赤芝能顯著區(qū)別于其他產(chǎn)地批次赤芝樣品，主要體現(xiàn)在三萜甾醇等有效成分的含量更高。

靈芝；質(zhì)量評(píng)價(jià)；主成分分析；多糖；三萜；指紋圖譜

靈芝是多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體，由于極高的藥用價(jià)值而被大規(guī)模商業(yè)化種植，其中赤芝(Leyss. ex Fr.) Karst.和紫芝Zhao Xu et Zhang被納入《中國(guó)藥典》2020年版[1]。古代認(rèn)為靈芝具有死而復(fù)生、延年益壽的功效，中醫(yī)用于心神不定、不茶不飯、失眠夢(mèng)多、肺氣虛證咳喘等?，F(xiàn)代研究表明，靈芝在肝損傷[2]、癌癥[3-4]、心血管疾病[5]、大腦損傷[6]、氧化損傷[7-8]、高血糖[9-10]、炎癥[8,11]、免疫[12]、衰老[13]等疾病上面發(fā)揮了巨大作用，有非常重要的研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)前景。目前靈芝在食品藥品方面已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[14]，我國(guó)的靈芝GAP基地有必要按照更嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，逐步規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化，不斷推動(dòng)靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

靈芝的主要化學(xué)成分為多糖類、三萜類化合物、甾醇、氨基酸類、生物堿、核苷類、脂肪酸類以及微量元素等[15-16]，其中多糖和三萜是其主要活性成分，也是研究最多的成分。經(jīng)過(guò)多年的培育，靈芝形成了諸多品種，形態(tài)、質(zhì)地各異，成分含量也有所區(qū)別，有效成分質(zhì)量控制的方法也多種多樣[17-18]，其中赤芝在我國(guó)應(yīng)用廣泛，在各個(gè)省市都有擴(kuò)大栽培的趨勢(shì)，但赤芝培育的品種繁多，同時(shí)GAP基地的種植水平不一。

本實(shí)驗(yàn)選用15批不同GAP種植基地的赤芝藥材，對(duì)其進(jìn)行全面的質(zhì)量分析，為不同GAP基地赤芝的種植現(xiàn)狀提供質(zhì)量依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材來(lái)源

分別從5個(gè)省份的11個(gè)靈芝GAP種植基地收集15批赤芝藥材，由廣東省微生物研究所食用菌中心謝意珍研究員鑒定為多孔菌科真菌赤芝(Leyss. ex Fr.) Karst.的干燥子實(shí)體。藥材樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 靈芝供試樣品編號(hào)、各培育品種及GAP種植基地

1.2 試劑

對(duì)照品齊墩果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)MUST-16070406，）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所；葡萄糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號(hào)11083-201609）、巖藻糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，批號(hào)112014-201601）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；來(lái)蘇糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)L115557）、甘露糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)D121716）、葡萄糖醛酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號(hào)C10584817）、半乳糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%，批號(hào)G100368）購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；右旋糖酐相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（套）對(duì)照品（批號(hào)140637～646-201203）購(gòu)于Sigma公司；靈芝酸A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0842）、靈芝酸F（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.3%，批號(hào)A0917）、靈芝酸H（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.2%，批號(hào)A0931）、靈芝酸B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0916）、靈芝烯酸B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0923）、靈芝酸C2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0911）、靈芝烯酸C（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0924）、靈芝烯酸D（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%，批號(hào)A0907）、靈芝酸D（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0906），靈芝酸G（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)A0909）均購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)公司；乙腈為色譜級(jí)；三氟乙酸、甲醇、乙醇、濃硫酸、蒽酮、冰醋酸、高氯酸、醋酸乙酯、香草醛、疊氮化鈉、硫酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、醋酸銨等均為分析級(jí)。

1.3 儀器

GZX-9070MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SX-2-5-12型箱式電阻爐（北京科偉永興儀器有限公司）；UV3200S型紫外分光光度計(jì)儀（上海美普達(dá)儀器有限公司）；安捷倫1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、示差折光檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 一般性檢查及浸出物

按照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0832項(xiàng)下的烘干法和2302項(xiàng)下的灰分測(cè)定[19]，檢測(cè)15批樣品的水分及灰分，結(jié)果見(jiàn)表2。15批樣品均滿足《中國(guó)藥典》的要求，水分為1.47%～7.28%，灰分在0.69%～2.79%。

因靈芝水溶性浸出物得率太低，同時(shí)為方便同步進(jìn)行多糖相對(duì)分子質(zhì)量分布、多糖含量、單糖組成測(cè)定，水溶性浸出物參考《中國(guó)藥典》2020年版設(shè)計(jì)方案[1]。取赤芝粉末（過(guò)2號(hào)篩）8 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，精密加水240 mL，靜置1 h，加沸石2～4顆，置電熱套中，連接回流裝置，加熱至沸騰，并保持微沸4 h，趁熱抽濾，用25 mL熱水潤(rùn)洗3次，往濾渣及濾紙中再精密加水240 mL，加熱回流3 h，操作同上，合并濾液。加水至640 mL，搖勻，量取320 mL（約為4 g樣品），置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定干燥物質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表2。15批樣品的水溶性浸出物含量符合《中國(guó)藥典》2020年版的要求，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.50%～16.43%。

表2 赤芝質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

靈芝醇溶性浸出物參照《中國(guó)藥典》2020年版通則2201[19]，以水溶性浸出物的方法，將溶劑替換為乙醇，設(shè)計(jì)步驟如下：靈芝子實(shí)體打粉，過(guò)篩，取2～5號(hào)篩之間的粉末約4 g ，精密稱定，置250mL平底燒瓶中，精密加入無(wú)水乙醇100 mL，加沸石2～4顆，密塞，靜置1 h，連接回流裝置，90 ℃水浴回流1 h（沸騰后開(kāi)始計(jì)時(shí)），關(guān)閉水浴鍋電源并加入冷水降溫后，迅速取下平底燒瓶，及時(shí)密塞，流水冷卻至室溫后，在真空度?0.01～?0.03 MPa下抽濾，抽干后每次用25 mL無(wú)水乙醇洗滌平底燒瓶、濾器和濾渣，共3次，濾液轉(zhuǎn)移至已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在90 ℃水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥物來(lái)計(jì)算醇溶性浸出物含量。結(jié)果顯示15批樣品的醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.45%～6.39%，其中S13（山東聊城）含量最高。

2.2 比色法測(cè)定多糖含量

取“2.1”項(xiàng)下的水溶性浸出物，參照《中國(guó)藥典》2020年版中靈芝多糖的含量測(cè)定方法（硫酸蒽酮法測(cè)定）[1]，以葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），制定標(biāo)準(zhǔn)曲線為＝7.095 4＋0.037 8，2=0.999 9，計(jì)算供試品溶液中葡萄糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。15批樣品均符合《中國(guó)藥典》2020年版要求，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為1.04%～3.19%，其中樣品S11（陜西漢中瀘農(nóng)1號(hào)）的多糖含量最高。

2.3 柱前衍生高效液相色譜法（PMP-HPLC）測(cè)定多糖含量[20]

2.3.1 對(duì)照品衍生化溶液的制備 取甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、巖藻糖各約10 mg，葡萄糖約100 mg，精密稱定，用純凈水溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液備用；取對(duì)照品來(lái)蘇糖約10 mg，精密稱定，用純凈水溶解并定容到25 mL，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液備用；精密移取0.125 mL混合對(duì)照品溶液和0.125 mL內(nèi)標(biāo)，混勻。加入0.15 mol/L的NaOH溶液0.3 mL和0.1 mol/L的PMP溶液0.5 mL，充分混勻后，70 ℃水浴30 min，冰浴終止反應(yīng)，加入0.15 mol/L的鹽酸0.32 mL和純凈水0.65 mL，充分混勻后，12 000 r/min室溫離心10 min，吸取上清液適量即得。

2.3.2 供試品衍生化溶液的制備 將“2.1”項(xiàng)下8 g靈芝子實(shí)體的水提物，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取0.25 mL，加入0.250 mL三氟乙酸溶液，充氮?dú)猓凭珖姛舴夤?，?10 ℃烘箱中水解4 h，取出，放至室溫；加入0.5mL甲醇，60 ℃以下真空減壓干燥，反復(fù)處理3次，至水解液干燥完全；殘?jiān)芗尤?.125 mL熱水和0.125 mL內(nèi)標(biāo)（來(lái)蘇糖），超聲30 s，使殘?jiān)耆芙獠⑴c內(nèi)標(biāo)充分混勻，加入NaOH 0.3 mL和PMP 0.5 mL，充分混勻后，70 ℃水浴保溫30min，迅速取出，冰浴30 s終止反應(yīng)，加入0.32 mL的HCL和0.65 mL 純凈水，充分混勻后，12 000 r/min室溫離心10 min，小心吸取上清液適量，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱Waters Symmetry Shield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，以18%乙腈-82% 0.1 mol/L醋酸銨水溶液為流動(dòng)相等度洗脫，體積流量為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量20 μL，混合對(duì)照品色譜圖和供試品衍生化溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3.4 方法學(xué)考察 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)率、加樣回收率試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)方法[20]操作，RSD均小于3%，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.3.5 樣品的測(cè)定將所測(cè)供試品單糖按以下公式計(jì)算含量（計(jì)算時(shí)需扣除子實(shí)體的水分），單糖含量見(jiàn)表3。合計(jì)后得到多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表2。多糖含量在0.33%～0.95%，均符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，其中S13（山東聊城）含量最高。

單糖量＝(u/s)×s×(/)×100

u為樣品溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰值響應(yīng)比，s為標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰值響應(yīng)比，s為經(jīng)衍生化的標(biāo)準(zhǔn)溶液等分試樣中相關(guān)分析物的量，為相對(duì)于樣品溶液體積的稀釋系數(shù)，為制備樣品溶液所用靈芝子實(shí)體的質(zhì)量

圖1 混合對(duì)照品(A)和供試品(B) 衍生化溶液色譜圖

2.4 高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測(cè)定多糖含量[21]

不同來(lái)源或種類的靈芝，其多糖成分的相對(duì)分子質(zhì)量有較大差異，HPGPC法作為測(cè)定多糖相對(duì)分子質(zhì)量及含量的常見(jiàn)分析手段，已經(jīng)成為靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)的行業(yè)共性方法，本實(shí)驗(yàn)也將其納入不同產(chǎn)地赤芝質(zhì)量考察的標(biāo)準(zhǔn)之一。

2.4.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取右旋糖酐及葡萄糖對(duì)照品約50 mg，精密稱定，分別加超純水溶解，定容至5 mL量瓶中，制成10 mg/mL的右旋糖酐對(duì)照品儲(chǔ)備液和葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液?；旌蠈?duì)照品參數(shù)見(jiàn)表4。

表3 15批赤芝中單糖含量

表4 右旋糖酐對(duì)照品參數(shù)

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下的水溶性浸出物濾液160 mL（約2 g樣品），沸水浴蒸干，用5 mL熱水超聲溶解，緩慢加入無(wú)水乙醇至總體積約40 mL，超聲，4 ℃下靜置12 h，4000 r/min，4 ℃離心30 min，棄上清液后真空干燥，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，密塞封口，50 ℃超聲10 min，放至室溫，定容至刻度線，搖勻，取溶液約5 mL，室溫下4000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取3 mL左右續(xù)濾液備用。

2.4.3 色譜條件 采用串聯(lián)凝膠色譜柱TSK-GEL（300 mm×7.8 mm，10 μm），柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.71% Na2SO4硫酸鈉水溶液，體積流量0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以各對(duì)照品峰位相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)（），峰頂時(shí)間作為橫坐標(biāo)（），凝膠滲透色譜專用軟件校正標(biāo)準(zhǔn)曲線得＝10.491 4?0.162 4，2=0.998 2。

2.4.5 方法學(xué)考察 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)按照參考文獻(xiàn)方法[21]操作，RSD均小于3%，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.4.6 樣品測(cè)定 將值設(shè)為5000和400 000代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，求得對(duì)應(yīng)峰位相對(duì)分子質(zhì)量下的峰頂時(shí)間1和2，對(duì)各供試品圖譜1到2之間的響應(yīng)面積進(jìn)行積分，獲得峰位相對(duì)分子質(zhì)量5000～400 000的響應(yīng)面積S1；積分標(biāo)識(shí)相對(duì)分子質(zhì)量為5000～670 000的右旋糖酐對(duì)照品圖譜，獲得各進(jìn)樣對(duì)照品的對(duì)應(yīng)峰面積，并統(tǒng)一折算成10 mg/mL濃度的峰面積，然后求得平均峰面積S2。代入下式求得多糖含量，具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明15批赤芝藥材多糖含量在0.72%～2.51%，其中赤芝S11（陜西漢中瀘農(nóng)1號(hào)）的多糖含量最高。

多糖含量＝S1/S2×10×10/子實(shí)體質(zhì)量/1000

2.5 比色法測(cè)定總?cè)萍扮薮己縖1]

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 取干燥至恒定質(zhì)量的齊墩果酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，制成含齊墩果酸0.2 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.5.2 供試品溶液的制備 靈芝子實(shí)體打粉，過(guò)篩，取2～5號(hào)篩之間的粉末約2 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇100 mL，加沸石2～4顆，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h，水浴回流1 h，冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，取適量過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液約2 mL備用。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置15 mL具塞試管中，揮干，預(yù)冷2 min后精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，具塞，從冰浴取出，渦旋混勻，移入70 ℃水浴中加熱15 min，立即取出置冰浴中冷卻5 min，取出置室溫水中回溫5 min，精密加入醋酸乙酯4 mL，渦旋混勻，采用石英比色皿，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401）[19]，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（），濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線＝8.095 4＋0.038 8，2=0.999 9。

2.5.4 樣品的測(cè)定 精密量取供試品溶液0.2 mL，置15 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“揮干”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中齊墩果酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。15批赤芝都滿足《中國(guó)藥典》2020年版要求，范圍在0.70%～1.74%，其中赤芝S13（山東聊城產(chǎn)）三萜甾醇含量最高。

2.6 HPLC法測(cè)定靈芝酸含量[22]

2.6.1 色譜條件 色譜柱Waters Symmetry Shield RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm），體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫20 ℃。以0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）作為流動(dòng)相，洗脫程序?yàn)?～10 min，85%～75% A；10～58 min，75%～71% A；58～60 min，71%～69% A；60～68 min，69% A；68～78 min，69%～64% A；78～98 min，64% A；98～100 min，64%～0% A。

2.6.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取靈芝酸A約4 mg，靈芝酸B、靈芝烯酸B、靈芝酸C2、靈芝烯酸C、靈芝烯酸D、靈芝酸D、靈芝酸F、靈芝酸G、靈芝酸H各約2 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中，搖勻備用。制得各對(duì)照品溶液均為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.3 靈芝酸A對(duì)照品溶液的制備 取靈芝酸A對(duì)照品約10 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容到25 mL量瓶中，配制成0.442 mg/mL的靈芝酸A的對(duì)照品原液，再逐步稀釋為0.331 500、0.221 000、0.110 500、0.055 250、0.027 625 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.4 供試品溶液的制備 精密稱定赤芝粉末3 g，加入150 mL醋酸乙酯，水浴回流1 h，抽濾，用25 mL醋酸乙酯洗滌3次，合并濾液，85 ℃水浴揮干，用甲醇5 mL溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜? mL量瓶中，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.6.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將“2.6.3”項(xiàng)不同質(zhì)量濃度的靈芝酸A對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得＝11 290.231 6＋11.852 7，2＝0.999 9。

2.6.6 方法學(xué)考察 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)率、加樣回收率試驗(yàn)根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[22]，RSD均小于3%，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.6.7 樣品測(cè)定 將混合對(duì)照品和供試品溶液分別進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖2。以靈芝酸A標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，其他目標(biāo)峰按換算因子全部折算為靈芝酸A，求和即得靈芝酸總量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明15批赤芝藥材靈芝酸含量在0.05%～0.79%，其中山東聊城產(chǎn)赤芝S4、S9的靈芝酸含量較高。

靈芝酸量＝(u/s)×s×(/)×100

u為樣品溶液中目標(biāo)物的峰面積，s為標(biāo)準(zhǔn)溶液中靈芝酸A的峰面積，s為標(biāo)準(zhǔn)溶液中靈芝酸A的濃度，為制備樣品溶液的靈芝子實(shí)體質(zhì)量，為與靈芝酸A的相對(duì)響應(yīng)因子

1-靈芝烯酸C 2-靈芝酸C2 3-靈芝酸G 4-靈芝烯酸B 5-靈芝酸B 6-靈芝酸A 7-靈芝酸H 8-靈芝烯酸D 9-靈芝酸D 10-靈芝酸F

2.7 指紋圖譜的建立

2.7.1 供試品溶液的制備 取靈芝細(xì)粉約3 g，精密稱定，加入250 mL潔凈干燥平底燒瓶，精密加入150 mL醋酸乙酯，加沸石2～3顆，具塞，靜置浸泡1 h，水浴回流1 h，抽濾，用25 mL醋酸乙酯洗滌平底燒瓶、濾紙和濾渣，重復(fù)3次，濾液入潔凈干燥蒸發(fā)皿，水浴揮干，用5 mL甲醇溶解殘?jiān)⑼耆D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.7.2 混合對(duì)照品溶液的制備 同“2.6.2”項(xiàng)

2.7.3 色譜條件 同“2.6.1”項(xiàng)。

2.7.4 方法學(xué)考察 同時(shí)取赤芝S15的供試品溶液進(jìn)行精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的驗(yàn)證，各項(xiàng)RSD均小于3%，方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.7.5 指紋圖譜的建立 將15批赤芝的指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），以赤芝S15指紋圖譜作為參考譜圖，進(jìn)行峰匹配，以中位數(shù)生成對(duì)照?qǐng)D譜，得到15批赤芝指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖3，共得到23個(gè)共有峰，同時(shí)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表5。

2-靈芝烯酸C 3-靈芝酸C2 5-靈芝酸G 6-靈芝烯酸B 8-靈芝酸B 12-靈芝酸A 15-靈芝酸H 17-靈芝烯酸D 19-靈芝酸D 23-靈芝酸F

表5 15批赤芝指紋圖譜相似度

以共有峰的峰面積為變量，將15批赤芝的峰面積經(jīng)歸一化處理后，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），自動(dòng)擬合得到4個(gè)主成分，2為0.969，2為0.57（＞0.5），模型擬合較好且有良好的預(yù)測(cè)性，結(jié)果見(jiàn)圖4。15批赤芝分成了3組，山東聊城的赤芝（S4、S9、S13）與其余批次的赤芝差異較大。

根據(jù)PCA的結(jié)果，將15批赤芝分成2組，一組為山東聊城組，一組為其他產(chǎn)地，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）（圖5），自動(dòng)擬合得到6個(gè)主成分，2為0.936，2為0.96。選擇VIP≥1的色譜峰作為區(qū)分山東聊城與其他產(chǎn)地赤芝的標(biāo)志差異物（色譜峰以保留時(shí)間計(jì)），VIP值見(jiàn)圖6，其中VIP≥1的色譜峰有8個(gè)，分別為峰19（靈芝酸D）、18、4、9、15（靈芝酸H）、23（靈芝酸F）、21、5（靈芝酸G）。

圖4 15批赤芝PCA圖

圖5 15批赤芝OPLS-DA圖

圖6 15批赤芝的VIP圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)15批不同產(chǎn)地和批次的赤芝，進(jìn)行了全面質(zhì)量控制方法考察，15批赤芝全部符合《中國(guó)藥典》2020年版的要求。靈芝產(chǎn)業(yè)龐大，市面上存在跟風(fēng)種植的情況，針對(duì)未來(lái)中藥材產(chǎn)業(yè)升級(jí)以及綠色農(nóng)業(yè)的趨勢(shì)，國(guó)內(nèi)需要加快GAP的建設(shè)，中國(guó)作為靈芝藥材大國(guó)和市場(chǎng)需求大國(guó)，靈芝GAP基地更應(yīng)該以嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，逐步規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，不斷推動(dòng)靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

對(duì)比3種多糖質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的結(jié)果可知，測(cè)定方法不同，測(cè)定結(jié)果有顯著差異。靈芝多糖種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由3股單糖鏈構(gòu)成的具有螺旋狀立體構(gòu)型（三維結(jié)構(gòu)）的葡聚糖[23]，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖和阿拉伯糖通過(guò)不同比例和不同糖苷鍵類型連接構(gòu)成，活性多糖有效成分附著在細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)，大部分直接與蛋白質(zhì)形成分子絡(luò)合物[24]，而3種多糖檢測(cè)方法都是基于醇沉除雜工藝，因此非糖類物質(zhì)容易與目標(biāo)多糖同步沉淀成為代測(cè)物。硫酸蒽酮法測(cè)定總多糖，原理是氧化出醛基與蒽酮結(jié)合并顯色，在固定波長(zhǎng)下檢測(cè)，這些非糖類化合物會(huì)參與顯色反應(yīng)，或本身在測(cè)定波長(zhǎng)下以強(qiáng)吸收的方式形成干擾誤差。HPGPC法的原理是基于不同分子量在凝膠色譜柱中的分離情況，因此待測(cè)定物的計(jì)算也會(huì)受到雜質(zhì)干擾。總之，可以綜合3種多糖的考察方式，視實(shí)際情況選擇評(píng)價(jià)手段。

對(duì)靈芝藥材中三萜類成分進(jìn)行含量測(cè)定結(jié)果表明，甾醇作為靈芝最重要的活性成分之一，是靈芝質(zhì)量的重要指標(biāo)，《中國(guó)藥典》測(cè)定靈芝三萜和甾醇，但由于靈芝三萜提取率低、雜質(zhì)多，紫外分光光度法的測(cè)定容易受到提取物中皂苷、油酸等物質(zhì)干擾，導(dǎo)致特異性不強(qiáng)，三萜甾醇含量與實(shí)際有較大的差異；目前從靈芝中已分離出300多種三萜類成分[25]，其中靈芝酸是最主要的成分，針對(duì)三萜中的靈芝酸，以靈芝酸A來(lái)計(jì)算10種靈芝酸含量，該測(cè)定物質(zhì)較明確，但未將甾醇部位納入靈芝活性成分的考察。

指紋圖譜的PCA分析和OPLS-DA分析結(jié)果中山東聊城的S13、S4、S9與其他批次的差異較大，其中S13中三萜甾醇含量最高，靈芝酸含量最低，可能是S13中中性三萜和甾醇等脂溶性成分的含量更高；S4、S9中靈芝酸含量較高，三萜甾醇含量居中。

山東聊城GAP基地赤芝在三萜或甾醇等脂溶性成分上區(qū)別于其他產(chǎn)地批次的赤芝，經(jīng)VIP分析得到8個(gè)與其他批次不同的主要色譜峰，可見(jiàn)靈芝酸類成分在區(qū)分山東聊城和其他產(chǎn)地的靈芝上具有重要意義，同時(shí)挖掘指紋圖譜的標(biāo)志差異峰也可以為不同產(chǎn)地靈芝的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation offrom different areas

ZENG Miao, XIE Meng-jun, ZHU Zi-yu, YU Yue-ting, ZHANG Mei

State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

A comprehensive quality evaluation analysis of Chizhi [(Leyss. exFr.) Karst.]samples from different batches or origins was conducted to provide a basis for the improvement of the quality standard of Lingzhi () and to screening of high-qualitymaterials.Referring to the method of2020 edition and common approaches in this field, fifteen batches ofherbs from each GAP base were collected and examined for moisture, ash, water-soluble leachate, alcohol soluble leachate, the polysaccharide content was compared by determining colorimetric method, precolumn derivatization high performance liquid chromatography (PMP-HPLC), and high performance gel permeation chromatography (HPGPC). The triterpene sterol content was determined by colorimetric method, and the QAMS of ganoderic acid A was evaluated by HPLC method.. The fingerprint profiles of 15 batches ofwere also compared for differences.All 15 batches ofmet the quality standard requirements of the2020 edition, the results of fingerprint cluster analysis and principal component analysis (PCA) show thatof Liaocheng, Shandong Province can be clearly distinguished from other batches of.All 15 batches ofmet the quality standards of the, indicating that the quality of the domesticGAP base cultivation is good; at the same time,of Liaocheng, Shandong Province can be significantly different from other origin batches ofsamples, mainly in the higher content of active ingredients such as triterpene sterols.

(Leyss.exFr.) Karst.; quality evaluation; principal component analysis; polysaccharides; triterpenes; fingerprint

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21 - 7193 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.028

2023-02-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774202）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計(jì)劃（CXTD2018010）

曾 秒，女，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治?。E-mail: 1220799848@qq.com

通信作者：張 梅，女，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究。E-mail: zhangmei63@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]