超聲-微波聯(lián)合提取紫薯花色苷及其穩(wěn)定性研究

玉 瀾蔣雅茵，張 鵬

（1.廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓 546199；2.廣西科技師范學(xué)院 功能性食品配料工程技術(shù)研究中心，廣西來賓 546199）

0 引言

紫薯（Purple Potato）是甘薯的一種特殊品種類型，皮肉呈紫紅至深紫，主要產(chǎn)于廣西、廣東、福建等亞熱帶地區(qū)［1］。近年來，隨著人們對新型營養(yǎng)保健食物資源開發(fā)熱點的追求，紫薯相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用也層出不窮［2］。紫薯含有大量的花色苷（Anthocyanin），相較葡萄、草莓、紫甘藍(lán)和紫蘇等其他果蔬中的花色苷，穩(wěn)定性更強(qiáng)［3］，是花色苷色素的良好來源。

花色苷屬于多酚類化合物，由花青素與植物體內(nèi)各種單糖通過糖苷鍵縮合形成［4］。不僅可用于食品的著色，還具有抗衰老、抗變異及抗腫瘤等許多對人體有益的營養(yǎng)保健作用［5］，在食品及醫(yī)療領(lǐng)域有極大的開發(fā)價值和十分廣闊的應(yīng)用前景。但其結(jié)構(gòu)中含有活潑的酚羥基，穩(wěn)定性較差，易在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或高溫環(huán)境中喪失生物活性［6］。目前常用的花色苷提取方法中，超聲輔助提取法是利用超聲波輻射產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)加速花色苷溶解［7］；微波輔助提取法是利用高頻率微波令細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收大量微波能，利于有機(jī)溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)溶解釋放花色苷［8］。這2種輔助提取方法具有不破壞花色苷、提取時間短、效率高和雜質(zhì)少等優(yōu)點。

本文將2種輔助提取方法聯(lián)合，以廣西巴馬紫薯為研究對象，以乙醇為提取溶劑，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、超聲功率以及液料比對花色苷提取率的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，并考察光照時間、溫度變化及pH值對紫薯花色苷提取液穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯（品種為巴馬紫薯，購自廣西巴馬瑤族自治縣）；無水檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀抗壞血酸、結(jié)晶乙酸鈉、鹽酸、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型酸度計（上海智光儀器儀表有限公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XH-100B型微波催化合成儀（北京翔鵠科技發(fā)展有限公司）；H1850型臺式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-2700型紫外-可見分光光度計（島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

制備紫薯粉末：紫薯洗凈去皮切成0.5 cm薄片，用護(hù)色劑（0.6%氯化鈉、0.6%檸檬酸、0.6%抗壞血酸）浸泡10 min后，置于45 ℃烘箱內(nèi)60 min，烘干表面水分［9］，真空干燥12 h后粉碎過80目篩，將紫薯粉末置于密封袋中低溫避光保存。

1.3.2 提取工藝流程

稱取2.0 g紫薯粉末，以乙醇-水溶液為提取試劑，按試驗方案設(shè)計的液料比進(jìn)行混合后，設(shè)置一定的功率、時間條件，分別置于微波合成儀中進(jìn)行微波輔助提取，再置于超聲波清洗儀中超聲振動提取后離心作用（4 000 r/min，10 min），即得花色苷提取液。

1.3.3 確定紫薯花色苷最大吸收波長

以去離子水為對照，使用紫外-可見分光光度計，在可見波長400～700 nm范圍內(nèi)對稀釋的澄清花色苷提取液進(jìn)行吸收光譜掃描［10］，根據(jù)獲得的吸收光譜圖，確定提取液中花色苷的最大吸收波長為532 nm。

1.3.4 測定花色苷的提取量

采用pH示差法測定紫薯花色苷的提取量［11］。取1 mL紫薯花色苷提取液于10 mL納氏比色管中，分別用KCl-HCl溶液（pH=1.0）和CH3COONa-HCl溶液（pH=4.5）定容至10 mL，使用分光光度計分別在波長532，700 nm處測定其吸光度A532nm和A700nm，代入式（1）和式（2），利用pH示差法計算花色苷的提取量（Y）［12］：

式中 Mw——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；

DF——稀釋倍數(shù)；

V——提取液的總體積，mL；

ε——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；

L——光程，1 cm；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗

在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，微波功率500 W，微波溫度40 ℃，微波時間1.5 min，超聲溫度40 ℃，超聲功率150 W，超聲時間30 min，液料比為20：1 mL/g的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%，80%）、超聲功率（120，150，180，210，240 W）、超聲時間（10，20，30，40，50 min）、微波功率（300，400，500，600，700 W）、微波時間（0.5，1，1.5，2，2.5 min）、液料比（15：1，20：1，25：1，30：1，35：1 mL/g）對紫薯花色苷提取量的影響，每個試驗重復(fù)3次。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）及液料比（D）為自變量，花色苷提取量（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件中Box-Behnken設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定紫薯花色苷的最佳提取工藝參數(shù)。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計因素水平表Tab.1 Test design factor level

1.3.7 穩(wěn)定性試驗

（1）光照時間對花色苷穩(wěn)定性的影響

分別移取10 mL提取液于6支試管，置于日光下，每隔1 h測定試管溶液中花色苷含量，考察光照時間對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響。

（2）溫度對花色苷穩(wěn)定性的影響

分別移取10 mL提取液于7支試管，放置于設(shè)置溫度為30，40，50，60，70，80，90 ℃的恒溫水浴鍋中，1 h后測定試管溶液中的花色苷含量，考察溫度變化對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響。

（3）pH值對花色苷穩(wěn)定性的影響

分別移取10 mL提取液于9支試管，調(diào)節(jié)各試管內(nèi)溶液pH值為1，2，3，4，5，6，7，8，9，觀察提取液的顏色變化，考察pH值對紫薯花色苷穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%，花色苷提取量呈上升趨勢；在60%～80%，提取量緩慢降低。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，紫薯樣品與乙醇-水溶液已充分反應(yīng)，其中的花色苷充分溶出，提取量達(dá)到最大值，為0.820 8 mg/g。故將乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為60%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和超聲時間對紫薯花色苷提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction,ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction amount of anthocyanin from purple potato

在超聲功率120～210 W，花色苷提取量保持上升趨勢。在超聲功率達(dá)210 W時，提取液中的花色苷含量達(dá)到最大值，為0.808 9 mg/g，此后的提取量急劇下降，原因可能是超聲功率過大會造成花色苷結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致提取量減少。故將超聲功率確定為210 W。

花色苷提取量隨著超聲時間增加快速增大，超聲提取20 min時，提取液中的花色苷含量達(dá)到最大值，為0.840 1 mg/g；在20～50 min，花色苷的提取量持續(xù)下降。說明繼續(xù)增加超聲時間會使花色苷分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致其繼續(xù)分解，提取量減少。故將超聲時間確定為20 min。

微波功率、微波時間和液料比對紫薯花色苷提取量的影響如圖2所示。

圖2 液料比對紫薯花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction amount of anthocyanin from purple potato

微波功率在300～700 W，花色苷提取量呈先上升后下降趨勢。微波功率達(dá)500 W時，提取量最高，為0.753 1 mg/g。說明隨著微波功率升高，導(dǎo)致溶液體系溫度過高［13］，花色苷結(jié)構(gòu)受到破壞，提取量下降。故將微波功率確定為500 W。

花色苷提取量隨著微波時間增加先增大，至1 min時，達(dá)到最大值，為0.710 7 mg/g；此后的1～2.5 min，花色苷提取量持續(xù)下降。說明隨著微波輻射時間延長，提取液中的花色苷發(fā)生降解，導(dǎo)致提取量降低。故將微波時間確定為1 min。

花色苷提取量在液料比增至20：1 mL/g時，提取完全，含量達(dá)到最大值，為0.739 7 mg/g，此后隨著液料比增大，花色苷提取量持續(xù)下降。說明乙醇溶劑增加會導(dǎo)致雜質(zhì)成分的溶出，導(dǎo)致提取量下降。故將液料比確定為20：1 mL/g。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計的試驗方案，使用Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次多項式回歸方程：Y=1.140 5+0.140 2A+0.042 0B+0.114 2C+0.080 1D-0.047 7AB+0.036 4AC-0.075 3AD+0.01 1BC-0.001 5BD+0.074 6CD-0.1504A2-0.168 5B2-0.203 1C2-0.151 5 D2。

2.2.2 回歸模型的方差分析

方差分析與顯著性檢驗見表2。

表2 方差分析與顯著性檢驗Tab.2 Analysis of variance and significance test

模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著，失擬項P=0.294 9>0.05，表明模型失擬項不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.952 4，說明模型能夠解釋95.24%的變化；調(diào)RAdj2=0.904 9，表明模型與實測值擬合程度較好。綜上所述，可用模型分析預(yù)測紫薯花色苷的最優(yōu)超聲-微波聯(lián)合提取工藝。回歸方程一次項A，C，D及二次項A2，B2，C2，D2對花色苷提取量存在極顯著地影響，一次項B及交互項AD，CD影響顯著，其余因素不顯著?？疾斓?個因素對花色苷提取量的影響順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>超聲時間（C）>液料比（D）>超聲功率（B）。

2.2.3 各因素交互作用分析

進(jìn)一步對影響紫薯花色苷提取量的4個因素進(jìn)行交互作用分析，結(jié)合圖3各交互作用響應(yīng)曲面和等高線圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比、超聲時間與液料比交互作用對花色苷提取量影響顯著（P<0.05）；乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時間、超聲功率與超聲時間、超聲功率與液料比交互作用對紫薯花色苷的提取量影響不顯著（P>0.05），與方差分析結(jié)果一致。

圖3 各因素交互作用對花色苷提取量的影響Tab.3 Effect of interaction of various factors on the extraction amount of anthocyanin

2.2.4 確定最佳工藝條件和回歸模型驗證試驗

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件中Numerical分析預(yù)測出提取紫薯花色苷的最佳工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)65.10%、超聲時間24.29 min、液料比21.44：1 mL/g、超聲功率212.32 W，花色苷提取量的預(yù)測值達(dá)到1.161 0 mg/g。根據(jù)實際試驗條件及方案的可行性，調(diào)整參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、超聲時間24 min、液料比21：1 mL/g、超聲功率210 W，在此工藝條件下進(jìn)行提取試驗，3次試驗結(jié)果分別為1.133 8，1.079 9，1.100 9 mg/g，平均值為1.104 9 mg/g（RSD=2.46%），與理論預(yù)測值相近，說明模型可信度較高。

2.3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

如圖4所示，暴露在日光下1～4 h，試管溶液中的花色苷含量出現(xiàn)小幅度降低，后隨著光照時間延長，花色苷逐漸降解，含量持續(xù)降低。可看出花色苷的穩(wěn)定性隨光照時間增長而減弱，短時間內(nèi)的光照對花色苷穩(wěn)定性的影響程度不大。

圖4 光照時間、溫度和pH值對紫薯提取液中花色苷含量的影響Fig.4 Effects of light time,temperature and pH value on anthocyanin content in purple potato extract

試管溶液中花色苷含量隨溫度升高而降低，在30 ～40 ℃，溫度對花色苷穩(wěn)定性影響程度不大；至60 ℃以后，高溫環(huán)境使得試管溶液中的花色苷快速分解，導(dǎo)致花色苷含量下降明顯。

在酸性條件（pH值為1.0～5.0）下，試管溶液呈紅色，花色苷含量隨pH值變化較?。辉趐H值為5.0～8.0，試管溶液呈粉色至紫色，試管溶液中的花色苷含量隨pH值增大而大幅度降低，穩(wěn)定性較差；當(dāng)pH值達(dá)到9.0時，試管溶液呈藍(lán)綠色，花色苷含量隨pH值的變化幅度較小。

3 結(jié)語

本文采用超聲-微波聯(lián)合提取法提取紫薯中的花色苷，以響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、超聲功率210 W、超聲時間24 min、液料比21：1 mL/g、微波時間1 min、微波功率500 W，在此工藝下可得最大紫薯花色苷提取量1.104 9 mg/g，高于單獨使用超聲輔助提取法或微波輔助提取法。穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，試管溶液中紫薯花色苷的含量隨著光照時間延長、溫度升高及pH值的增大均逐漸降低?；ㄉ赵跍囟雀哂?0 ℃后分解速度加快、穩(wěn)定性較差，處酸性條件中穩(wěn)定性較好、堿性條件則易分解，繼續(xù)延長光照時間也將導(dǎo)致花色苷悉數(shù)分解。即表明在較短時間內(nèi)，光照對花色苷穩(wěn)定性影響不大，溫度和pH值的變化對花色苷穩(wěn)定性影響較大。