橘皮提取物對瘤胃微生物體外發(fā)酵的影響

孔 靜， 鄭 楠， 趙圣國

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100193）

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告，自2020 年7 月1 日起，禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含抗生素類的飼料添加劑（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2019）。我國養(yǎng)殖業(yè)開始向“禁抗、限抗、無抗”發(fā)展方向，這可能會產(chǎn)生畜禽養(yǎng)殖發(fā)病率、死亡率上升，生產(chǎn)效率降低等問題，從而造成養(yǎng)殖成本大大提高。因此，急需尋找其他安全、有效的飼料添加劑來頂替抗生素的作用（Stevanoviúc等，2018）。植物提取物是植物經(jīng)過物理化學(xué)超聲等作用，將其中的活性成分分離提取出來，是具有多種成分的混合物。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物生產(chǎn)中添加植物提取物能夠提高飼料利用率，降低有害氣體產(chǎn)生，降低瘤胃蛋白的降解率，提高動物生產(chǎn)性能（張芮銘等，2020；Alejandro 等，2016）。

柑橘為蕓香科屬植物，是世界第一大水果，我國是其重要產(chǎn)地之一，擁有豐富的資源。柑橘加工后的柑橘皮渣，含量很高，約占其重量的50%。 柑橘不僅含有豐富的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素和粗脂肪等（張石蕊等，2004），還含有果膠、多酚類、黃酮類等活性成分（劉仙俊等，2021；余歆等，2021； 高萌等，2019）， 尤其是橙皮苷含量達(dá)6%（邊清泉等，2008），具有提高動物生產(chǎn)性能、增強(qiáng)動物免疫能力、 抗癌及抗菌作用 （任文博，2020）。 有研究顯示，在育肥豬的飼糧中添加適量的橘皮可以促進(jìn)豬的生長， 降低豬腸道有害微生物的繁殖 （Moset 等，2015；Cerisuelo 等，2010；趙蕾，2008）。 橘皮粉可以提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化效率和雞肉品質(zhì)，提高成活率（胡忠澤等，2011）。 還有研究顯示， 橘皮提取物不僅可以提高蛋雞產(chǎn)蛋率及采食量，還可以提高蛋殼顏色、蛋殼厚度、蛋黃指數(shù)，從而改善雞蛋品質(zhì)（王立志和姜寧，2006）。 本試驗旨在通過瘤胃體外發(fā)酵試驗， 探究橘皮提取物對奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響， 為橘皮提取物作為飼料添加劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原材料 本試驗所用的橘皮提取物選購自安徽亳州千翁堂。

1.1.2 橘皮提取液制備 （1）取100 g 橘皮原料，放于鋪有錫箔紙的托盤上，置于恒溫干燥箱內(nèi)65 ℃烘過夜；（2）用粉碎機(jī)粉碎橘皮至粉末狀；（3）稱取10 g 橘皮粉末于300 mL 玻璃瓶中， 加入240 mL 80%甲醇，搖勻；（4）將玻璃瓶放入恒溫水浴鍋中，在70 ℃下處理1 h，然后放入超聲清洗儀中超聲處理1 h；（5）處理后的橘皮提取液樣品先用四層紗布粗過濾，后用濾紙過濾，保留濾液；（6）用50 mL離心管取40 mL 濾液，用氮吹儀濃縮干燥至5 mL，得到橘皮提取液。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理 試驗動物為3 頭裝有永久性瘤胃瘺管、體重相近[（600±10）kg]的健康荷斯坦奶牛。飼喂同一全混合日糧（TMR），飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。 每日喂料2 次。

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）%

1.3 瘤胃體外發(fā)酵試驗設(shè)計及方法

1.3.1 人工瘤胃緩沖液配制 按照McDougall 等方法配制，用電子天平準(zhǔn)確稱量9.8 g/L NaHCO3、9.3 g/L Na2HPO4·12H2O、0.47 g/L NaCl、0.57 g/L KCl、0.04 g/L 無水CaCl2、0.06 g/L 無水MgCl2和10 g/L 尿素。 除無水CaCl2外，其余的物質(zhì)用1 L超純水溶解，之后加入無水CaCl2，產(chǎn)生白色沉淀，持續(xù)通入CO2至溶液無色。 用純鹽酸將溶液pH調(diào)到6.8。 使用前需先將其放入恒溫水浴搖床里，在39 ℃下預(yù)熱。

1.3.2 體外發(fā)酵液配制 晨飼前抽取3 頭奶牛的瘤胃液混合均勻， 混合后用4 層紗布擠壓過濾，迅速移入預(yù)熱達(dá)39 ℃保溫瓶內(nèi)， 收集完畢后迅速帶回實驗室。

1.3.3 試驗設(shè)計 試驗采取單因素隨機(jī)設(shè)計，共分為2 個處理組，即對照組、橘皮處理組，每個試驗組3 個重復(fù)，試驗期48 h，共準(zhǔn)備6 個100 mL血清瓶。對照組添加0.6 mL 80%甲醇。試驗前1 h，分別稱取0.3 g TMR 日糧， 使用長紙槽直接送入血清瓶底部。取0.6 mL 橘皮提取液加入相應(yīng)的血清瓶中，每個血清瓶中加入10 mL 瘤胃濾液。 通入CO2將血清瓶中的空氣置換出來，為瘤胃微生物創(chuàng)造厭氧的環(huán)境，馬上蓋上藍(lán)色幾丁質(zhì)瓶塞，防止外界空氣進(jìn)入。 立即放入39 ℃恒溫水浴搖床（GFL-1083，Gesell Schafe）培養(yǎng)。

1.3.4 發(fā)酵液樣本采集 發(fā)酵至6、12 、24 h 和48 h 時， 用氣壓計測定壓力。 發(fā)酵至48 h 時，用pH 計測定pH。 每個處理用無紡布過濾，得濾液。取3 個1 mL 發(fā)酵液裝到1.5 mL 離心管中， 添加0.1 mL 25%的偏磷酸溶液， 混勻后于-20 ℃冷凍保存，用于揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮及尿素氮測定。取2 個1 mL 發(fā)酵液裝到1.5 mL 離心管中凍存。

1.4 指標(biāo)測定 將記錄的氣體壓力使用以下等式轉(zhuǎn)換為氣體體積值來計算產(chǎn)氣量：GP = P×V/101.3，其中GP 為產(chǎn)氣量（mL），P 為壓力（kPa），V為血清瓶中氣體的體積 （mL），101.3 為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（kPa）。 使用苯酚－次氯酸鈉比色法測定氨態(tài)氮（NH3－N）濃度；采用南京建成廠家提供的尿素氮（BUN）測試盒（二乙酰肟比色法）測定尿素氮濃度；參照曹慶云等（2006）采用氣相色譜法的方法來測定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度； 采用碧云天廠家的BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定微生物蛋白濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 將本試驗數(shù)據(jù)通過Excel整理后，利用SAS GLM 程序進(jìn)行方差分析。當(dāng)P＜0.05 時，表現(xiàn)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 橘皮提取物對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、發(fā)酵液pH、尿素氮、 氨態(tài)氮及微生物蛋白濃度的影響 由表2 可知， 試驗組產(chǎn)氣量較對照組提高55.99%（P＜0.05）， 試驗組發(fā)酵液尿素氮濃度較對照組提高83.97%（P＜0.05），試驗組發(fā)酵液pH 較對照組降低1.51%（P＜0.05），但在正常生理范圍之內(nèi)。 橘皮提取物對發(fā)酵液氨態(tài)氮及微生物蛋白濃度無顯著影響（P＞0.05）。

表2 橘皮提取物對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量、發(fā)酵液pH、尿素氮、氨態(tài)氮及微生物蛋白濃度的影響

2.2 橘皮提取物對發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響 由表3 可知， 試驗組發(fā)酵液丙酸濃度較對照組提高21.44%（P＜0.05）， 試驗組發(fā)酵液戊酸濃度較對照組提高37.14%（P＜0.05）， 而橘皮提取物對發(fā)酵液中的總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、異丁酸、丁酸以及異戊酸沒有顯著影響（P＞0.05）。

表3 橘皮提取物對發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響mmol/L

3 討論

3.1 橘皮提取物對體外發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響 瘤胃微生物在消化日糧時，會產(chǎn)生CO2和CH4等氣體，可以作為評定瘤胃發(fā)酵能力的指標(biāo)（崔振亮等，2014）。 本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加橘皮組產(chǎn)氣量顯著高于對照組（P＜0.05），可能是由于橘皮提取物影響了瘤胃內(nèi)微生物的結(jié)構(gòu)與組成， 使一些瘤胃微生物的活性增強(qiáng)，從而增加了對底物利用效率。杜秦嬌等（2020）進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加橘皮可以顯著提高產(chǎn)氣量（P＜0.05）。橘皮提取物的主要活性成分是柚皮素，屬于黃酮類化合物。使用液-質(zhì)聯(lián)用方法檢測到沙蔥的脂提取物中含25.47%的黃酮類化合物， 含量最高 （杜紅喜，2020）。 包美麗等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，在西門塔爾公牛飼糧中添加沙蔥提取物組產(chǎn)氣量極顯著高于對照組（P＜0.05） 。 包玲玲（2015）在綿羊日糧中添加不同濃度沙蔥黃酮類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綿羊瘤胃產(chǎn)氣量顯著上升（P＜0.05）。槲皮素和柚皮苷是植物次級代謝產(chǎn)物，均屬于黃酮類。郭長征等（2017）在山羊飼糧中添加槲皮素， 研究發(fā)現(xiàn)，24 h 總產(chǎn)氣量顯著增加（P＜0.05）。

3.2 橘皮提取物對發(fā)酵液pH 的影響 反芻動物的瘤胃是一個復(fù)雜的環(huán)境，瘤胃能否正常發(fā)揮它的功能和瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定息息相關(guān)。反芻動物瘤胃液的pH 受多種因素影響， 在一定程度上可以反映瘤胃微生物生活環(huán)境的情況， 過高或過低的pH 會使瘤胃難以發(fā)揮它的功能（郭晨陽等，2020； 姜士凱，2013）。 本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加橘皮提取物顯著降低了瘤胃pH （P＜0.05）， 但都在正常生理范圍（6.0 ～7.5）內(nèi)波動。 杜秦嬌等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，添加橘皮處理組的pH 沒有差異顯著， 且各處理組培養(yǎng)液的pH 在6.53 ～6.62。由此可知，添加橘皮提取物不會對瘤胃微生物正常代謝產(chǎn)生不利的影響，而且瘤胃內(nèi)酸堿環(huán)境沒有被大幅度改變。 包美麗等（2021）以奶牛為試驗動物，研究發(fā)現(xiàn)，添加沙蔥組的瘤胃液pH 顯著低于對照組（P＜0.05），本試驗結(jié)果與其一致。趙亞星等（2021）以肉羊為試驗動物發(fā)現(xiàn)， 添加沙蔥精油會顯著降低瘤胃液的pH （P＜0.05）。 孫華等（2021）在山羊高精料中添加了柚皮苷，發(fā)酵24 h 時，低、中及高添加劑量組發(fā)酵液pH均顯著低于對照組（P＜0.05）。 郭長征等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在山羊飼糧中添加槲皮素，對發(fā)酵液pH 不會產(chǎn)生明顯的影響（P＞0.05）。 Balcells（2012）以育肥牛為試驗動物，研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼料中添加類黃酮可以極顯著提高瘤胃液pH（P＜0.01）。 以上結(jié)果與本試驗結(jié)果不一致，推測可能與動物種類及飼料精粗料比不同有關(guān)。

3.3 橘皮提取物對瘤胃尿素氮濃度的影響 反芻動物擁有獨(dú)特、復(fù)雜的瘤胃，里面棲息著大量瘤胃微生物，可以通過微生物脲酶催化尿素等非蛋白氮水解為氨，為其提供氮源。 當(dāng)尿素在瘤胃內(nèi)的分解速度遠(yuǎn)大于瘤胃微生物合成蛋白質(zhì)的速度，氨態(tài)氮濃度超過微生物能夠利用的量時，一部分的氨態(tài)氮會被瘤胃壁吸收，導(dǎo)致進(jìn)入到血液內(nèi)的氨態(tài)氮含量過高， 從而使機(jī)體對氮的代謝產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，容易使動物引起氨中毒 （曾澤等，2022； 張華等，2018）。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加橘皮顯著增加了尿素氮濃度（P＜0.05）。 可能是橘皮中的活性成分能夠起到了緩釋尿素的作用，使尿素在瘤胃內(nèi)緩慢的釋放，從而提高飼料中尿素的利用率，降低了動物氨中毒的機(jī)率（王夢芝等，2021）。 劉艷豐等（2014）在綿羊飼糧中添加沙棘葉黃酮的研究發(fā)現(xiàn)，尿素氮含量顯著低于對照組（P＜0.05），本試驗結(jié)果與其不一致。 推測結(jié)果不同的原因可能是黃酮來源、動物種類及不同提取物在反芻動物體內(nèi)作用機(jī)制不同所導(dǎo)致。

3.4 橘皮提取物對發(fā)酵液氨態(tài)氮及微生物蛋白濃度的影響 反芻動物為瘤胃內(nèi)微生物提供舒適的生存環(huán)境，非蛋白氮被瘤胃內(nèi)微生物利用來合成被宿主動物利用的產(chǎn)物，從而更好的促進(jìn)宿主的生長與發(fā)育（崔振亮等，2010）。 微生物蛋白能給反芻動物提供大部分的蛋白質(zhì)（劉瑞芳和蘇利紅，2021）。氨態(tài)氮是微生物合成微生物蛋白的前體物質(zhì)，其濃度高低與日糧中蛋白質(zhì)降解速率及瘤胃微生物對氮的利用率有關(guān)。氨態(tài)氮濃度可以反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的發(fā)酵情況，還能反映瘤胃中氮留存率高低（張華等，2018）。 在本試驗中，與對照組相比，添加橘皮提取物對氨態(tài)氮濃度及微生物蛋白氮產(chǎn)量均無顯著影響（P＞0.05）。 推測可能是反應(yīng)初期，瘤胃微生物利用了尿素快速分解釋放的氨，從而合成了微生物蛋白。 橘皮提取物中的活性成分，使尿素緩釋，但對微生物生長沒有影響。 Gouvêa 等（2016）和羅巧慧等（2019）分別以育肥牛和羔羊為試驗動物，研究在飼料中添加橘皮來代替玉米的作用， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗組發(fā)酵液氨態(tài)氮的濃度沒有顯著差異，本試驗結(jié)果與其一致。 然而，孫華等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，在山羊高精料中添加了柚皮苷的試驗組與高精料組相比，氨態(tài)氮濃度顯著升高（P＜0.05）。 包美麗等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加沙蔥提取物組的瘤胃液氨態(tài)氮濃度顯著提高 （P＜0.05）。不同的來源黃酮對瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮及微生物蛋白濃度具有不同的調(diào)控作用。

3.5 橘皮提取物對發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸的影響飼料中的碳水化合物流經(jīng)瘤胃后， 被瘤胃微生物降解轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸， 它能為反芻動物提供大部分的能量。 甲烷氣體的產(chǎn)量隨瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量的升高而增加，丙酸可通過消耗氫氣，來抑制甲烷形成（Whitelaw 等，1984）。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，添加橘皮組的總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、異丁酸、丁酸以及異戊酸濃度沒有明顯差異（P＞0.05），而丙酸和戊酸濃度顯著增加（P＜0.05），可能是添加橘皮影響了瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸的形成，從而改變了瘤胃發(fā)酵模式（田勤娟，2014）。杜秦嬌等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，添加橘皮可以顯著提高總揮發(fā)性脂肪酸及丙酸濃度 （P＜0.05）。Gouvêa 等（2016）和羅巧慧等（2019）分別以育肥牛和羔羊為試驗動物， 研究在飼料中添加橘皮來代替玉米的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯著提高了發(fā)酵液乙酸濃度， 增加了乙/丙比。 郭長征等（2017）在山羊飼糧中添加槲皮素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使總揮發(fā)性脂肪酸及乙酸的濃度顯著提高（P＜0.05），增加了乙丙比，改變了瘤胃發(fā)酵類型。

4 結(jié)論

橘皮提取物可顯著提高瘤胃微生物產(chǎn)氣量和戊酸濃度，減緩尿素的分解，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，是一種潛在的功能性飼料添加劑。