脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對豬的毒理作用及其生物解毒機制的研究進展

楊勝蘭， 張瑞強， 范小燕， 劉金松， 曹廣添

（1.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江 湖州 313306；2.浙江農(nóng)林大學，浙江 杭州 311300；3.中國計量大學，浙江 杭州 310058）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱嘔吐毒素，在小麥、燕麥、大麥、玉米等谷物中含量較高，糧食制品、動物奶制品及蛋類也常有檢出，多由黃色鐮刀菌（F.culmorum）和禾谷鐮刀菌（F.graminearum）等真菌產(chǎn)生。 1970 年，日本科學家從發(fā)霉小麥和玉米中純化出DON，其正式化學名稱為3，7，15-三羥基-12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮（Yoshizawa 等，1973）。DON 熔點151 ～153 ℃，相對分子質(zhì)量296，分子式為C15H20O6，易溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等極性溶劑，具有較強的熱抵抗力和耐酸性（Piacentini 等，2019）。 谷物在適宜的氣溫和濕度等條件下， 導致真菌繁殖發(fā)生赤霉病和腐病，并產(chǎn)DON（Mishra 等，2020）。 在世界范圍內(nèi)，每年由DON 污染作物造成的經(jīng)濟損失超數(shù)十億美元。DON 被世界糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織確定為最危險的天然食物污染物之一，在我國DON 污染很普遍，在飼料原料、谷物加工副產(chǎn)品以及全價飼料中均存在較高的檢出率， 在小麥及其副產(chǎn)品中檢出率高達90%以上，2020 年甚至高達100%（丁燕玲等，2021）。DON 耐高溫且在極端pH 環(huán)境下仍是高度穩(wěn)定的化合物（Bretz 等，2006），其在儲存4 年的小麥中仍能檢測到（史建榮等，2014）。DON 進入腸道后可引起多種疾病， 包括免疫抑制、致畸和致癌等，嚴重危害動物健康。 為了保護人和動物的健康， 我國規(guī)定谷物和谷類產(chǎn)品中DON 的最大殘留量不得超過1000 μg/kg（食品安全國家標準,2017）。 據(jù)報道，多種物理和化學脫毒方式可以在一定程度上減少或消除DON，但無論是單獨使用還是聯(lián)合使用，都難以達到成本低、營養(yǎng)成分損失少、安全和高效的效果。

1 DON 對豬健康的影響

1.1 生長性能 DON 中毒的主要癥狀是拒食、嘔吐、腹瀉，免疫和生殖功能也會受到影響（Ren 等，2017）。 不同物種對DON 的敏感性不同， 豬最敏感，其次是家禽和反芻動物（Jiang 等，2018）。豬只長期低劑量飼喂DON 會引起采食量下降、 拒食、飼料利用率降低和體重下降等問題。 仔豬日糧中添加3.0 mg/kg DON 可降低仔豬體重 （Yu 等,2019），可能是由于DON 暴露導致DNA 甲基化降低了促生長因子NNMT 和GALP 的表達，從而降低了采食量和體重 （Zhang 等，2020）。 Reddy 等（2018） 研究表明，8 mg/kg DON 可使GALP 基因啟動子區(qū)CpG 位點去甲基化，導致GALP 表達急劇增加，GALP 參與調(diào)節(jié)食欲、 炎癥和能量代謝，GALP 急劇增加引起仔豬體重迅速下降、 營養(yǎng)不良和瘦素的分泌增加。 DON 除了導致攝食量減少， 生長和體重增加緩慢， 還會引起其他不良影響，如“僵死豬”、母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)和后代虛弱等（郭等，2018）。

1.2 腸道危害 腸道是食物污染物的第一道屏障，也是抵抗諸多感染的第一道防線（Ahern 等，2020）。 腸道已被確定為DON 作用的首批靶向組織之一，DON 可引發(fā)顯著的腸道組織學變化，并在小腸被迅速吸收（Chen 等，2017））。仔豬飼喂含DON 的日糧4 周后，血清中二胺氧化酶（DAO）和內(nèi)毒素水平均有顯著增加， 表明腸黏膜損傷（Li等，2018）。 豬攝入高劑量DON，會引起過度炎癥，破壞黏膜上皮細胞屏障， 對腸道健康產(chǎn)生不利影響，主要表現(xiàn)為腸細胞形態(tài)缺失、絨毛長度減少、管腔和絨毛頂部死細胞增多、 絨毛水腫和融合（Tang 等，2021；Wang 等，2019）。 添加3.5 mg/kg DON 飼糧飼喂42 d， 仔豬回腸中CLDN-3、4 和OCLN mRNA 表達下調(diào)（Lessard 等，2015）。 此外，DON 可破壞豬腸道的微生物群落的多樣性和穩(wěn)定性（Li 等，2022）。 腸道菌失調(diào)降低了豬的消化能力，腸道中殘留大量未消化物質(zhì)，引起有害細菌和寄生蟲在腸道內(nèi)大量繁殖， 最終導致豬出現(xiàn)腹瀉癥狀。

1.3 肝臟毒性 肝臟是代謝和排毒的重要器官，肝臟也是DON 的主要靶點。 DON 中毒導致肝臟損傷是豬生長發(fā)育遲緩的主要原因之一。DON 通過誘導DNA 去甲基化，提高仔豬肝臟中CYP450酶的表達，CYP450 酶異常上調(diào)導致肝臟損傷進而抑制生長。 Liu 等（2022）在仔豬日糧中添加3 mg/kg DON，降低了CYP450 酶的啟動子區(qū)甲基化水平， 導致其mRNA 水平升高， 誘導肝臟損傷。Tiemann 等（2008）發(fā)現(xiàn)，DON 可誘導肝細胞中糖原減少和鐵血黃素顆粒增加， 并使肝細胞小葉間結(jié)締組織間隔厚度顯著增加， 平滑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體丟失。 Bracarense 等（2012）在育肥豬日糧中添加6 mg/kg DON 21 d 后，育肥豬血清中ALT 和AST 的比值提高。

1.4 免疫危害 DON 是一種免疫刺激劑，有免疫抑制作用， 可誘導淋巴細胞的局灶性壞死和增加機體對傳染性病毒的易感性等。 Liao 等（2020）觀察到長期飼喂低水平DON， 仔豬回腸中IL-1 β和IL-8 表達下調(diào)。Hlavov＇a 等（2020）在仔豬日糧中添加3.5 mg/kg DON 5 周后， 回腸和空腸炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6 和IL-10 的表達顯著上調(diào)。在腸道中，環(huán)氧化酶（COX-2）是炎癥最顯著的標志之一， 仔豬飼喂含DON 的日糧后， 觀察到COX-2 的mRNA 水平升高（Yao 等，2017）。DON 可降低仔豬抗體介導的免疫力，添加3.0 mg/kg DON 飼糧飼喂仔豬， 降低豬圓環(huán)病毒抗體效價， 添加2.5 mg/kg DON 飼糧飼喂豬圓環(huán)病毒2 型感染豬中， 病毒血癥和肺病毒載量往往較高（Zhang 等，2020）。

1.5 氧化應激 DON 可誘導氧化應激，氧化應激是細胞對毒性或炎癥性損傷的一種非特異性反應。血紅素加氧酶（HMOX1）是氧化應激最敏感的指標之一，在仔豬日糧中添加3 mg/kg DON，結(jié)腸中HMOX1 的mRNA 水平顯著上調(diào) （Peng 等，2019）。DON 可能通過破壞生物膜，誘導自由基導致脂質(zhì)過氧化而造成細胞損傷進而引起細胞凋亡。 仔豬日糧中添加3.5 mg/kg 的DON，可以觀察到谷胱甘肽過氧化物酶的表達增加， 而編碼抗氧化劑和超氧化物歧化酶的基因表達顯著下調(diào)（Deng 等，2020）。Kang 等（2019）發(fā)現(xiàn)，IPEC-J2 細胞暴露于DON（0.2 ～0.6 μg/mL），膜脂過氧化指標丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）的含量增加，同時超氧化物歧化酶（SOD）的活性降低。 在豬日糧中添加4.0 mg/kg 的DON 會抑制超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）和總抗氧化能力（T-AOC）的活性（Tang 等，2021）。 DON 對不同階段動物的影響見表1。

表1 DON 對不同階段動物的影響

2 降解方式

DON 可以通過物理、 化學和生物方法解毒。常用的物理解毒方法有吸附、高溫處理、水洗研磨及輻射處理。 物理方法在一定程度上能夠去除DON， 但存在去除不徹底造成二次污染和飼料原料中的營養(yǎng)物質(zhì)流失等問題 （Pronyk 等，2006）。DON 在堿性條件下不穩(wěn)定，但大多數(shù)國家禁止對真菌毒素進行化學處理， 臭氧處理是一種降解DON 有效的化學方法（Chao 等，2016），然而臭氧處理需要專用設備和額外資金，增加了生產(chǎn)成本。生物解毒包括真菌的細胞壁能夠特異吸附有毒物質(zhì)， 微生物產(chǎn)生酶降解有毒物質(zhì) （Feizollahi 等，2022）。 生物解毒方法反應條件溫和，解毒效果徹底，是綠色安全、低損失、高效的解毒方式。

2.1 物理法 DON 可溶于水等極性溶劑，通過漂洗可以降低DON 的含量（Hart 等，1983），但是這并不能破壞DON 的結(jié)構， 溶解在水中的DON 仍具有毒性作用。 DON 的結(jié)構性質(zhì)非常穩(wěn)定，溫度達到210 ℃并持續(xù)加熱30 ～40 min 其結(jié)構才會被破壞 （Samar 等，2007）， 通過熱處理效果不明顯，且能源消耗大。物理吸附常用到的吸附劑有活性炭、硅鋁酸鹽等，其吸附性與表面結(jié)構、孔徑大小有關，且沒有特異性，在吸附毒素的同時吸附飼料中的維生素和氨基酸， 鋁硅酸鹽可能釋放有毒物質(zhì)（Schell 等，1993）。 被DON 污染的小麥經(jīng)過被誘導氬等離子體系統(tǒng)處理后，DON 濃度顯著降低， 但紫外線和等離子體導致飼料中營養(yǎng)物質(zhì)被破壞， 輻射法所需設備儀器價格昂貴且容易脫毒不徹底（Park 等，2007）。

2.2 化學法 臭氧能降低DON 的含量，Wang 等（2016）發(fā)現(xiàn)，DON 在25 mg/m3的臭氧環(huán)境中能有效降解，臭氧解毒需要專用設備增加生產(chǎn)成本，甚至對環(huán)境造成影響，引起溫室效應。臭氧氧化反應與pH 密切相關，當pH 達到9 時，則DON 很難被氧化降解（AL-Emara 等，2022）。 Zhang 等（2018）發(fā)現(xiàn)，DON 在堿性條件下不穩(wěn)定， 隨著pH 升高，其化學結(jié)構越易發(fā)生變化，被DON 污染的玉米在堿液中處理18 h，DON 含量降低了85%（劉玉蘭等，2017），但堿液會影響飼料的適口性，殘留在飼料中的堿液也難以去除。

2.3 生物法 Boivin 等（1977）提出，在小麥中添加白地霉可以有效地降低啤酒中DON 的含量。后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌、白地霉等真菌可以吸附DON， 從而降低谷物的DON 污染水平（Chlebicz 等，2020）。El-Nezami 等（2002）發(fā)現(xiàn)，鼠李子桿菌菌株LGG 具有解毒DON 的能力。 活菌和滅活菌的解毒能力沒有顯著差異， 沒有新物質(zhì)產(chǎn)生。表明LGG 具有吸附DON 的能力。研究發(fā)現(xiàn)其他乳桿菌都具有吸附DON 的能力，它們的解毒機制相似，其中，植物乳桿菌、德氏乳桿菌和鼠李糖桿菌的吸附效率稍高。 除乳桿菌外， 其他細菌也能吸附DON（Maidana 等，2022）。 Niderkorn 等（2006）發(fā)現(xiàn)，鏈球菌、腸球菌和其他菌株有吸附DON 的能力，嗜熱鏈球菌的吸附率可達33%。

Bracarense 等（2020）從牛瘤胃中分離得到一株厭氧芽孢桿菌屬細菌,可將DON 的C12-C13 環(huán)氧基團水解成兩個相鄰的羥基, 產(chǎn)生代謝物脫環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DOM-1）。 Binder 等（1997） 從牛瘤胃中篩選出一種可以轉(zhuǎn)化DON 的未知細菌。 Holanda 等（2021）利用DON 進行定向篩選， 從豬糞便中獲得了10 株降解DON 能力較強的菌株，降解率超過70%。 芽孢桿菌廣泛存在于土壤、作物等領域，并對DON 具有良好的降解能力。例如，Jian 等（2018）從受污染的玉米材料中分離出枯草芽孢桿菌NHIBC006D， 降解率達到73.5%。

3 生物降解機理

3.1 生物吸附解毒 DON 的生物解毒主要有兩種機制：吸附和酶促降解（Tian 等，2022）。 吸附解毒主要是通過微生物細胞壁上的甘露聚糖來實現(xiàn)的。 因此，該方法的有效性取決于細胞對DON 的吸附能力，而不是酶的活性（Borràs 等，2022）。 吸附脫毒反應條件溫和， 且特異性原料中的營養(yǎng)成分不被吸附。 研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母可有效降低DON，孵育24 h 后，DON 濃度降低40%。 釀酒酵母除了降低DON 含量外， 還能減少乳酸脫氫酶（LDH） 的釋放， 緩解細胞壞死和凋亡 （Kim 等，2019）。 釀酒酵母可增加抗炎細胞因子的分泌，并緩解DON 誘導引起的IPEC-J2 細胞壞死（Liu等，2019）。

3.2 酶解作用于環(huán)氧環(huán) DON 分子結(jié)構中的C12-13 環(huán)氧環(huán)與毒性密切相關， 去環(huán)氧DON 的毒性比DON 低54 ～55 倍 （Eriksen 等，2004）。DON 去環(huán)氧化是還原反應包括去除一個氧原子和結(jié)合三個氫原子，形成DOM-1（Ueno 等，1983）。Guan 等（2009）發(fā)現(xiàn)，C133 是一種從棕色鯰魚腸道中分離出來的微生物混合物， 它能夠在完全介質(zhì)中破壞DON 的環(huán)氧結(jié)構， 從而將DON 降解為DOM-1。He 等（2020）發(fā)現(xiàn)，脫硫菌PGC-3-9 對小麥籽粒中的DON 進行完全的去環(huán)氧化處理，可有效地清除小麥籽粒中的DON。

3.3 酶解作用于C3-OH 基團 C3-OH 基團是DON 的致毒基團之一， 微生物通過氧化作用將DON 中的C3-OH 基團轉(zhuǎn)化為3-keto-DON，或通過異構化反應， 發(fā)生差向異構化， 形成3-epi-DON（Vanhoutte 等，2017）。Zhang 等（2021）從土壤中分離一株諾卡氏菌ZHH-013， 可將DON 降解為3-keto-DON 和3-epi-DON。 Zhai 等（2019）發(fā)現(xiàn)，從土壤中分離的假單胞菌Y1 和溶菌S1 能將DON 降解為3-epi-DON。 Carere 等（2018）在菌株中分離出催化DON 轉(zhuǎn)化為3-epi-DON 的酶，并根據(jù)所涉及的兩個步驟將其命名為DepA 和DepB。 DON 的主要降解機制總結(jié)見表2。

表2 DON 的降解機制

4 總結(jié)與展望

DON 毒性作用包括免疫調(diào)節(jié)、腸道屏障功能障礙和細胞毒性等，導致豬的生產(chǎn)性能下降。DON解毒方法主要涉及物理、 化學和生物方法。 但DON 結(jié)構穩(wěn)定， 傳統(tǒng)物理解毒方法效率低下，化學方法雖然能將其轉(zhuǎn)化為低毒化合物， 但容易與其他有毒物質(zhì)混合，破壞飼料營養(yǎng)成分。生物法在溫和條件下能減少或去除DON，對飼料感官性狀和適口性影響不大，是DON 解毒的首選。 但生物解毒中大多數(shù)解毒細菌的生物安全性和解毒途徑仍不清楚， 微生物在吸附和降解過程中所起的作用也未完全清晰，還需進一步研究。