飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚消化酶、免疫酶以及抗氧化酶的影響

付 旭， 張 璐， 姜志強(qiáng)， 韓雨哲，張德洪， 王武剛， 尹 恒， 米海峰

（1.通威農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司水產(chǎn)研究所，四川 成都 610093；2.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)畜禽營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610093；4.水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610093）

葉黃素分子式為C40H56O2， 又稱植物黃體素， 是由8 個(gè)異戊二烯為單位所組成的含有2 個(gè)羥基的共軛烯烴，是一種無(wú)維生素A 活性的類胡蘿卜素（孟哲和劉紅云，2007）。

王軍波等（2004）在葉黃素與免疫功能的研究中提出， 葉黃素可以促進(jìn)抗原刺激后的淋巴細(xì)胞的增殖，并且影響細(xì)胞表面分子的功能性表達(dá)，來(lái)達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞免疫的效果； 葉黃素還可以通過(guò)增加B 細(xì)胞亞群數(shù)量、增強(qiáng)抗體反應(yīng)以及促進(jìn)血漿免疫球蛋白水平的形式來(lái)增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)；葉黃素可以增強(qiáng)氧化酶的活性和巨噬細(xì)胞細(xì)胞色素氧化酶，并對(duì)巨噬細(xì)胞活性也具有促進(jìn)作用，由此可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞突發(fā)性呼吸作用， 使巨噬細(xì)胞可以更有效的對(duì)微生物和外源性抗原物質(zhì)起到殺滅作用， 從而達(dá)到增強(qiáng)生物體非特異性免疫的作用；在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，葉黃素的存在可以防止免疫細(xì)胞被氧化損傷，以保證完好的細(xì)胞功能，使其更好的發(fā)揮免疫功能，此外，葉黃素還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊和細(xì)胞膜流動(dòng)性來(lái)影響免疫功能。 孫振等（2005）在收集充分的試驗(yàn)實(shí)例得出結(jié)論顯示葉黃素具有抗癌的作用。 Aman 等（2005）發(fā)現(xiàn)，葉黃素分布在視網(wǎng)膜黃斑部和晶狀體中，具有光保護(hù)性和抗氧化性，吸收大量藍(lán)光，通過(guò)物理或化學(xué)淬滅作用滅活單線態(tài)氧， 清除自由基來(lái)保護(hù)視神經(jīng)，對(duì)視網(wǎng)膜功能起到?jīng)Q定性作用。

淡黑鑷麗魚隸屬鱸形目，慈鯛科，鑷麗魚屬，又名非洲王子，體色為檸檬黃色，背鰭、胸鰭和臀鰭邊緣有一條黑色的條帶， 其野生屬身上會(huì)帶有部分黑色雜斑。 淡黑鑷麗魚最大體長(zhǎng)為8 ～10 cm，最長(zhǎng)壽命7 ～10 年，最適水溫為23 ～28 ℃，最適水體pH 為7.5 ～8（城市漁夫和諾言，2006）。淡黑鑷麗魚屬于觀賞價(jià)值較高的觀賞魚， 目前鮮有針對(duì)淡黑鑷麗魚的各方面研究，需要進(jìn)行拓充。本試驗(yàn)將以淡黑鑷麗魚作為研究對(duì)象， 探討飼料中葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚消化酶、 抗氧化酶及免疫酶活力造成的影響， 為開發(fā)淡黑鑷麗魚人工養(yǎng)殖使用的配合飼料提供相關(guān)理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所使用淡黑鑷麗魚為當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場(chǎng)自行繁育。 體長(zhǎng) （4.7±0.1）cm， 體質(zhì)量（1.70±0.09）g。

1.2 試驗(yàn)飼料的制備 試驗(yàn)飼料原料由大連龍?jiān)春Ｑ笊镉邢薰咎峁?經(jīng)過(guò)充分的粉碎、過(guò)篩、攪拌混合后，通過(guò)小型顆粒料制粒機(jī)制粒，置于60 ℃烘箱進(jìn)行烘干， 成品于-20 ℃冰箱避光、真空密封保存。糖源由淀粉等物質(zhì)提供，蛋白源由豆粕及魚粉提供，脂肪源由大豆油（益海嘉里食品營(yíng)銷有限公司，上海）提供。 DZ（對(duì)照組）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，6 組分別添加4%葉黃素（石家莊綠川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg， 并用纖維素進(jìn)行調(diào)平，纖維素添加量分別為175、145、115、83、5 g/kg，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)成分含量見表1，混合維生素和混合礦物質(zhì)配方參考王莉蘋等（2017）。

表1 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分含量（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 取狀態(tài)良好、體態(tài)差異小的淡黑鑷麗魚144 尾， 隨機(jī)平均分成6 個(gè)試驗(yàn)梯度，即DZ（對(duì)照組）、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，分別投喂添加4%葉黃素（石家莊綠川生物有限公司）0、1、2、5、10、40 g/kg 的飼料， 對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)葉黃素含量依次為20.57、58.68、86.04、167.72、310.60 mg/kg和1090.41 mg/kg，作為6 個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)計(jì)3 個(gè)平行組，各平行組放置8 尾試驗(yàn)魚，整個(gè)試驗(yàn)置于控溫循環(huán)水系統(tǒng)（大連匯新鈦有限責(zé)任公司，大連）中進(jìn)行，循環(huán)水流量3 L/min，養(yǎng)殖水體體積30 L。 各組隨機(jī)布置于此系統(tǒng)中，共18 個(gè)循環(huán)水槽。 水溫恒定于25.0 ℃，每日分別于8：00和16：00 進(jìn)行表觀飽食投喂， 投喂1 h 后清理糞便及雜質(zhì)，每日18：00 換水，換水量為20%，保持水質(zhì)良好穩(wěn)定，每日光照12 h。 氣泵充氣保持氧氣充足（DO≥7.0 mg/L）。 試驗(yàn)共進(jìn)行68 d。

1.4 試驗(yàn)取樣以及方法 試驗(yàn)取樣及方法參照付旭等（2017）操作方法。試驗(yàn)期間觀察魚的生長(zhǎng)、發(fā)育、攝食及死亡情況。 試驗(yàn)結(jié)束并停食24 h 后，隨機(jī)于各平行組中取6 尾試驗(yàn)魚， 至于冰袋上，紗布擦干體表水分后，使用無(wú)菌解剖工具解剖并取其完整的腸道及肝臟。將各平行組所取全部試驗(yàn)魚的腸道樣品進(jìn)行混樣處理用于檢測(cè)消化酶等相關(guān)指標(biāo)，肝臟樣品進(jìn)行混樣處理用于檢測(cè)抗氧化酶及免疫酶等相關(guān)指標(biāo)，放入對(duì)應(yīng)組別的離心管內(nèi)，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱短暫儲(chǔ)存，樣品加入預(yù)冷的生理鹽水并于0 ℃無(wú)菌操作環(huán)境下充分勻漿制成20%的勻漿液， 于4 ℃、2500 r/min 離心10 min 后取上清，再稀釋成所檢測(cè)的不同種酶的最適檢測(cè)濃度進(jìn)行測(cè)試。 勻漿液在8 h 內(nèi)完成測(cè)試。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算 采用試劑盒（南京建成生物有限公司），對(duì)過(guò)氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （GSHPX）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）、淀粉酶（AMS）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶（PRS）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、乳酸脫氫酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT/GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST/GOT）進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 所得數(shù)據(jù)均采用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，并采用SPSS 20.0 分析軟件進(jìn)行方差齊次檢驗(yàn)和單因素方差分析 （One-Way ANOVA），并進(jìn)行Duncan 氏多重比較， 顯著性水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料中葉黃素含量對(duì)淡黑鑷麗魚消化能力的影響 如表2 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入的葉黃素的增加，AMS 活力試驗(yàn)組均高于DZ 組，且除Y3 外其余各試驗(yàn)組均與DZ 組有顯著差異 （P＜0.05），Y5 出現(xiàn)最大值；PRS 活力Y5 組顯著高于其他各試驗(yàn)組和DZ 組（P＜0.05），除Y5 組外其他各組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；LPS 活力各組間均無(wú)顯著差異 （P＞0.05）， 其中Y2 組出現(xiàn)最低值，Y5 組出現(xiàn)最高值，且高于DZ 組兩倍。

表2 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚腸道消化酶活力的影響

2.2 飼料中葉黃素含量對(duì)淡黑鑷麗魚免疫能力的影響 如表3 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入葉黃素水平的提高，AKP 呈先升后降趨勢(shì)，除Y1 組和Y2 組外其余三組均低于DZ 組，且Y3 組和Y5 組顯著低于DZ 組、Y1 組和Y2 組 （P＜0.05）；ACP呈下降趨勢(shì)，ACP 各試驗(yàn)組均低于DZ 組， 并且Y4 組達(dá)到最低值，且顯著低于DZ 組（P＜0.05）；LZM 各組之間均無(wú)顯著差異，各組之間數(shù)值較平穩(wěn)（P＞0.05）； LDH 各組間無(wú)顯著差異，且數(shù)值之間無(wú)規(guī)律（P＞0.05）。

表3 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚肝臟免疫酶活力的影響

2.3 飼料中葉黃素含量對(duì)淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響 如表4 所示， 伴隨淡黑鑷麗魚攝入葉黃素水平的提高，CAT、GSH-PX、T-SOD 和TAOC 均呈先升后降趨勢(shì)。 其中對(duì)T-AOC 活力的影響表現(xiàn)為所有組之間均無(wú)顯著差異， 但于Y2組出現(xiàn)最大值（P＞0.05）；對(duì)T-SOD 活力的影響表現(xiàn)為Y1 組出現(xiàn)最大值，并與除Y5 組外的所有組有顯著差異性 （P＜0.05），Y4、Y5 組顯著高于DZ 組（P＜0.05），并且所有試驗(yàn)組均高于DZ 組；對(duì)CAT 活力的影響表現(xiàn)為Y3 組出現(xiàn)最高值并與Y4 組和Y5 組差異顯著（P＜0.05），Y5 組顯著低于Y2 組和Y3 組 （P＜0.05）， 各試驗(yàn)組均與DZ組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；對(duì)GSH-PX 活力的影響表現(xiàn)為Y1 組顯著高于其余各組（P＜0.05），除Y3 組與DZ 組無(wú)顯著差異外（P＞0.05），其余各組之間均存在顯著差異性（P＜0.05）；MDA 則呈先降后升并于Y3 組開始趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)， 并且所有試驗(yàn)組均低于DZ 組， 并于Y2 組出現(xiàn)最小值，且與Y3 組和DZ 組產(chǎn)生顯著差異（P＜0.05）。

表4 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚肝臟抗氧化酶活力的影響

3 討論

3.1 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚消化能力的影響 陳進(jìn)樹等（2009）對(duì)魚類消化酶的研究中提出， 消化酶作為對(duì)食物分解吸收必不可少的酶，對(duì)魚類生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用。不同食性、品種以及處于不同發(fā)育時(shí)期的魚類的消化酶活力均有差異，生存環(huán)境如溫度、pH 等也會(huì)影響消化酶活力。 攝入餌料等外源物質(zhì)同樣對(duì)消化酶有影響。消化酶活力反映了魚類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，從而決定了魚類生長(zhǎng)發(fā)育的性能。目前，類胡蘿卜素對(duì)魚類消化酶影響的研究相對(duì)較少，其中張芬等（2017）對(duì)小丑魚（Amphiprioninae）的研究發(fā)現(xiàn)，小丑魚的胃腸部的消化酶活性受蝦青素的影響較為明顯，且在一定范圍內(nèi)，隨著攝入蝦青素量的增加，其LPS、PRS 和AMS 的活力升高，且均高于對(duì)照組。本試驗(yàn)所得結(jié)果表示，高葉黃素?cái)z入對(duì)淡黑鑷麗魚的AMS 和PRS 起到了促進(jìn)的作用。在攝入低濃度葉黃素時(shí)試驗(yàn)組的PRS和LPS 與DZ 組均差異不顯著，但在最高葉黃素濃度組中，PRS、LPS 以及AMS 均與DZ 組相差較多，且PRS 與AMS 差異顯著，故試驗(yàn)證明淡黑鑷麗魚大量攝入葉黃素（1090.41 mg/kg）時(shí)會(huì)促進(jìn)PRS 與AMS 的活力。

3.2 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚免疫酶活力的影響 磷酸酶又稱為磷酸單酯水解酶， 是可催化各種含鱗化合物水解的酶類， 根據(jù)最適pH 分為AKP 和ACP。 唐林等（2006）提出，磷酸酶與動(dòng)物機(jī)體的骨化作用有關(guān)。 詹付鳳等（2007）報(bào)道，AKP 通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)磷鈣代謝從而影響魚類的生長(zhǎng)發(fā)育，ACP 作為溶酶體的標(biāo)志酶之一， 反映細(xì)胞消化過(guò)程。何海琪等（1992）提出，磷酸酶干預(yù)生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。本試驗(yàn)以肝臟做勻漿測(cè)得的高濃度葉黃素?cái)z入組的淡黑鑷麗魚，AKP 和ACP 顯著低于DZ 組， 肝臟具有解毒作用， 故表現(xiàn)為葉黃素?cái)z入量過(guò)高會(huì)造成淡黑鑷麗魚肝臟受到損傷，使其解毒功能減弱，或影響其免疫能力。陳艷等（2009）闡述LZM 為正常機(jī)體免疫防御機(jī)制的組成部分， 其在機(jī)體內(nèi)溶解體內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞壁，從而起到殺菌作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明淡黑鑷麗魚肝臟中的LZM 活力不受攝入葉黃素濃度的影響， 從而證明攝入葉黃素的量對(duì)抵抗體外入侵的細(xì)菌的能力沒有影響。 陳思翀等（2008）闡述LDH 是在細(xì)胞內(nèi)催化乳酸氧化成丙酮酸，其組織中的濃度高于血液中的活力，當(dāng)肝臟、腎臟以及肌肉組織中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生非正常大量破損時(shí)，其活力會(huì)受到影響。 本試驗(yàn)隨著淡黑鑷麗魚攝入葉黃素量的增加，LDH 沒有改變， 說(shuō)明體內(nèi)沒有發(fā)生其所述的組織細(xì)胞大量破損。

3.3 飼料葉黃素水平對(duì)淡黑鑷麗魚抗氧化能力的影響 Chew 等（2004）表示，葉黃素是一種良好的抗氧化劑，可以捕獲自由基、猝滅單線態(tài)氧，防止自由基破壞生物膜。 Beckman 等（1997）同樣表示， 葉黃素發(fā)揮其生物活性的作用機(jī)理是通過(guò)猝滅活性氧族達(dá)到對(duì)活性氧自由基的活性抑制的作用， 從而起到保護(hù)正常細(xì)胞不被活性氧自由基破壞的效果。 蘇卿等（2014）在對(duì)葉黃素的研究中發(fā)現(xiàn)， 葉黃素因其抗氧化性能而被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，但葉黃素具有抗氧化和促氧化的雙重作用，其通過(guò)體外的化學(xué)方法和脫細(xì)胞彗星試驗(yàn)表明葉黃素的含量過(guò)高或者過(guò)低時(shí)會(huì)表現(xiàn)出促氧化作用， 但在生物體內(nèi)的抗氧化和促氧化作用未作研究。 故本試驗(yàn)旨在探究葉黃素對(duì)淡黑鑷麗魚抗氧化能力的最適添加量。 水產(chǎn)動(dòng)物肉質(zhì)腐敗的主要原因是脂類物質(zhì)的氧化，MDA 是脂類物質(zhì)的氧化產(chǎn)物， 是衡量脂類氧化程度的重要指標(biāo)（Scaife等，2015）。 本試驗(yàn)的試驗(yàn)組MDA 均低于DZ 組，說(shuō)明葉黃素對(duì)淡黑鑷麗魚的脂類氧化起到了抑制作用， 故證明試驗(yàn)中添加葉黃素對(duì)淡黑鑷麗魚體內(nèi)產(chǎn)生了抗氧化作用。 在Zhang 等（2013）對(duì)虹鱒的研究中發(fā)現(xiàn)， 飼料中添加100 mg/kg 的蝦青素時(shí)，虹鱒血清中的CAT 和T-SOD 顯著降低，肌肉中的MDA 顯著降低，肝臟中的T-AOC 提高。 在趙鑫鑫等（2016）對(duì)虹鱒、金魚以及錦鯉受類胡蘿卜素影響的研究中得出，飼料中分別添加100 mg/kg的葉黃素、蝦青素、雨生紅球藻以及角黃素均使金魚肝臟中的T-AOC 升高，MDA 降低，得出這四種添加劑對(duì)金魚抗氧化酶活性有提升的作用。 在阿倫等（2009）于葉黃素對(duì)鵪鶉（Coturnix）的影響研究中發(fā)現(xiàn)， 飼料中添加葉黃素其子代鵪鶉血清的各個(gè)抗氧化酶活性于14 d 時(shí)均低于對(duì)照組，并差異顯著， 于21 d 測(cè)得則與對(duì)照組差異不顯著，其解釋為子代鵪鶉體內(nèi)的葉黃素發(fā)揮抗氧化作用與抗氧化酶共同清除活性氧自由基， 從而使抗氧化酶活性降低，隨著母源性葉黃素被逐漸消耗，葉黃素起到的抗氧化作用比例降低， 使得自身的抗氧化酶活力恢復(fù)。結(jié)合以上試驗(yàn)的結(jié)果，本試驗(yàn)中添加少量葉黃素時(shí)對(duì)淡黑鑷麗魚自身的抗氧化酶活力起到促進(jìn)作用，故各抗氧化酶活力高于DZ 組，MDA 低于DZ 組。 當(dāng)葉黃素添加量繼續(xù)升高時(shí)抗氧化酶活力被促進(jìn)的同時(shí)， 部分葉黃素開始協(xié)助抗氧化酶分解自由基，此時(shí)抗氧化酶活力高于DZ組， 但部分抗氧化酶活力較最高值降低，MDA 含量在此時(shí)含量達(dá)最低值。 當(dāng)葉黃素添加量繼續(xù)升高時(shí)，葉黃素開始承擔(dān)大部分分解自由基的功能，使抗氧化酶活力顯著降低，但MDA 低于DZ 組并保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明， 黑鑷麗魚大量攝入葉黃素（1090.41 mg/kg） 時(shí)會(huì)促進(jìn)PRS 與AMS 的活力。葉黃素?cái)z入量≥167.72 mg/kg 時(shí)， 會(huì)降低磷酸酶活力，或?yàn)榈阼圎愻~肝臟受損所致，使其解毒功能減弱， 或影響其免疫能力。 適當(dāng)攝入葉黃素（58.68 ～86.04）mg/kg 時(shí)，可以增加淡黑鑷麗魚的抗氧化能力。