飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育肥牦牛生產(chǎn)性能和瘤胃微生物多樣性的影響

來進成， 劉東花， 李潤樺， 劉 麗 ， 竇莉蓉， 羅 蘭

（1.甘肅省畜牧技術推廣總站，甘肅 蘭州 730000；2.山丹縣畜牧技術推廣站，甘肅 張掖 734000；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830000）

牦牛是生活在青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山高寒地區(qū)的大型反芻家畜，是當?shù)啬撩裰匾纳a(chǎn)、生活資料，具有不可替代的生態(tài)和經(jīng)濟學地位。對于牦牛養(yǎng)殖來說，精準的營養(yǎng)供給是提高生產(chǎn)性能、促進產(chǎn)業(yè)發(fā)展、增加牧民收入的重要策略。如何有效利用飼糧的營養(yǎng)水平調(diào)控牦牛瘤胃微生物區(qū)系，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，進而提高飼料利用率和營養(yǎng)吸收率，是牦牛營養(yǎng)研究的一個重要方向。

瘤胃是反芻動物飼料發(fā)酵、 營養(yǎng)消化的重要場所， 可消化飼料中70% ～85%的可消化物和50%的粗纖維（潘美娟等，2012）。瘤胃功能的發(fā)揮主要依靠結(jié)構(gòu)復雜和數(shù)量豐富的微生物群落，其中， 細菌在整個瘤胃微生物區(qū)系中約占95%；古細菌占比為2% ～4%；真核生物約占1%，主要由原生動物和真菌組成（Brulc 等，2009）。 瘤胃微生物之間相互協(xié)調(diào)、 相互制約共同維持著瘤胃內(nèi)環(huán)境的平衡與穩(wěn)定， 通過厭氧發(fā)酵幫助宿主將自身難以利用的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和非蛋白氮等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可消化的化合物（韓旭峰，2015），為宿主提供65% ～75%的能量（郭紅等，2022）。 此外，微生物本身隨后在胃中被消化，并作為反芻動物的主要蛋白質(zhì)來源。因此，建立穩(wěn)定良好的微生物區(qū)系對維持機體健康、提高動物生產(chǎn)性能、改善動物產(chǎn)品質(zhì)量、 減少環(huán)境污染等方面具有重要的意義（崔浩然等，2021），相反，瘤胃微生物區(qū)系的紊亂會導致宿主免疫力降低、生產(chǎn)性能下降等（馬健等，2020）。因此，瘤胃微生物區(qū)系的研究一直是反芻動物研究的熱點領域。

研究證實， 飼糧的改變可使瘤胃微生物群落打破原來的穩(wěn)定微生態(tài)，建立新平衡，實現(xiàn)對微生物宿主的代謝調(diào)控， 進而影響生產(chǎn)性能 （唐鵬，2018）。粗蛋白質(zhì)作為飼糧中僅次于能量的第二大營養(yǎng)源，是影響動物生長、發(fā)育、健康和環(huán)境的一個重要因素。 其含量變化會影響提供給反芻動物的氮源。 已有學者在肉牛、山羊、綿羊等反芻動物中進行了研究（李蔣偉等，2022；張春霞，2022；牛驍麟等，2020；唐鵬，2018；李秋鳳等，2015），分析不同粗蛋白質(zhì)水平對生產(chǎn)性能或瘤胃微生物區(qū)系的影響，但在牦牛上相關報道有限。 因此，本試驗旨在研究飼糧不同蛋白水平對育肥牦牛生長性能、屠宰性能以及瘤胃微生物區(qū)系的影響，為牦牛養(yǎng)殖中合理調(diào)配飼糧蛋白水平， 進一步挖掘瘤胃微生物功能和調(diào)控機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理 試驗用育肥牦牛均來自張掖市肅南裕固族自治縣天然放牧的2.5 周歲左右牦牛， 于2021 年12 月收購運輸至民樂縣德華畜牧有限公司進行后續(xù)試驗。 選取體重［（190.88±5.97）kg］ 相近、 體況良好的公牦牛12頭，完全隨機平均分成2 組，分別飼喂粗蛋白質(zhì)水平為13.53%（D 組）和16.20%（G 組）的全混合日糧。按照試驗設計，預飼期15 d，正飼期120 d。試驗用全混合日糧依據(jù)我國 《肉牛飼養(yǎng)標準》（NY/T815-2004） 的肉牛營養(yǎng)標準推薦值和飼養(yǎng)經(jīng)驗進行配制。正式試驗開始前對試驗牛進行編號，每組單圈飼養(yǎng)。在牦牛熟悉并適應試驗料，采食量達到正常狀態(tài)（即體重的2%以上）正式開始試驗記錄。 每天9：00 和18:00 進行飼喂，自由采食，自由飲水，牦牛的管理按牛場常規(guī)要求進行，各組飼養(yǎng)管理條件保持一致。 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 全混合飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎）

1.2 樣品采集與處理 飼養(yǎng)試驗最后一天晨飼前，利用胃管式采樣器采集瘤胃液150 mL/頭，經(jīng)4 層無菌紗布過濾，分裝至20 mL 離心管中，立即用液氮速凍后-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)分析（龐凱悅等，2022）。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長性能及屠宰性能測定 正式試驗第1天和第120 天對所有試驗牦牛進行空腹稱重，記錄初始體重和宰前活重， 計算總增重和平均日增重。 試驗結(jié)束當天，對所有牦牛進行屠宰，記錄胴體重并計算屠宰率。

1.3.2 瘤胃液微生物區(qū)系測定 將瘤胃液樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司， 根據(jù)E.Z.N.A.RsoilDNA Kit 試劑盒說明書提取12 個樣本的微生物群落基因組DNA。 使用引物338F （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 對細菌16S rRNA V3 ～V4 區(qū)進行PCR 擴增， 通過Illumina Miseq PE300 型高通量測序儀進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 生長性能、屠宰性能數(shù)據(jù)使用Excel 2010 軟件進行整理， 利用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析和T 檢驗，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

微生物數(shù)據(jù)分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺上進行，使用fastp 和FLASH 軟件根據(jù)overlap 關系對PE reads 進行拼接， 同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，得到優(yōu)化序列。 利用Uparse軟件，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類， 在聚類過程中去除嵌合體， 得到OTU 的代表序列， 并對序列進行抽平處理。 由Mother 軟件計算α 多樣性指數(shù)。 采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 代表序列進行分類學分析，通過與silva（Release138 http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫比對，獲得各水平上的不同生物分類信息及其相對豐度信息，并分別在各個分類學水平統(tǒng)計群落物種組成。運用Wilcox 秩和檢驗比較兩組在門、屬水平上的菌落組成差異。分析結(jié)果以“平均值±標準差” 表示，P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對育肥牦牛生產(chǎn)性能的影響 由表2 可知，飼糧不同粗蛋白質(zhì)水平對牦牛宰前活重、 胴體重和屠宰率的影響差異不顯著，但D 組測定值均高于G 組（P＞0.05）。 隨著飼糧蛋白水平的降低，D 組牦牛的總增重和平均日增重較G 組分別增加7.03%和6.94%（P＜0.05）。

表2 不同粗蛋白質(zhì)水平飼糧對育肥牦牛生產(chǎn)性能的影響

2.2 育肥牦牛瘤胃微生物菌群豐富度和多樣性分析 基于OTU 代表序列進行α 多樣性分析，計算細菌豐富度（Sobs、Chao 和Ace）指數(shù)、多樣性（Shannon 和Simpson）指數(shù)和覆蓋度（Coverage）指數(shù)。 由表3 可知，本次測序覆蓋率均達到98%以上，測序深度合理，測序范圍能涵蓋大部分區(qū)域。G 組和D 組牦牛微生物菌群在數(shù)量及結(jié)構(gòu)上非常相似，D 組微生物豐富度和多樣性略高于G組，但兩組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 育肥牦牛瘤胃微生物菌群組成差異分析

2.3.1 門水平 在門水平上，兩組共有19 個菌門（圖1A）。 兩組瘤胃微生物相對豐度＞1%的優(yōu)勢菌門有擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、 變形菌門 （Proteobacteria）、 螺旋體門（Spirochaetota）（圖1B）。 擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度之和在各組中占比均高達92%以上，處于絕對優(yōu)勢地位。 在G 組樣本中，相對豐度較高的菌門有擬桿菌門和螺旋體門， 分別為62.08%和1.62%，較D 組分別高出3.20%和0.54%；厚壁菌門和變形菌門在D 組中相對豐度較高，分別高于G 組2.21%和1.81%。 D 組和G 組在門水平上差異不顯著（P＞0.05）（圖1C）。

圖1 不同蛋白組的牦牛瘤胃微生物組成（門水平）

2.3.2 屬水平 在屬水平上， 共鑒定出261 個菌屬，兩組共有237 個菌屬，G 組特有13 個菌屬，D組特有11 個菌屬（圖2A）。 在12 個樣本中，微生物相對豐度＞1%的優(yōu)勢菌屬有16 個， 其中，Prevotella （19.18% ）、norank_f__F082 （16.56% ） 和Rikenellaceae_RC9_gut_group（13.41%）的相對豐度高于10%， 其余13 個菌屬相對豐度低于5%（圖2B）。 運用Wilcox 秩和檢驗比較兩組在屬水平上的菌落組成差異。 在優(yōu)勢菌屬中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 的相對豐度在D 組中顯著高于G 組（P＜0.05），UCG-002 的相對豐度在D組中極顯著高于G 組（P＜0.01），其他菌屬在兩組之間無顯著差異（圖2C）。

圖2 不同蛋白組的牦牛瘤胃微生物組成（屬水平）

3 討論

3.1 飼糧不同粗蛋白質(zhì)水平對育肥牦牛生產(chǎn)性能的影響 蛋白質(zhì)是配制日糧配方時的一項重要指標，不僅影響動物的生產(chǎn)性能，對機體健康、養(yǎng)殖效益以及生態(tài)環(huán)境都具有重要的作用。 飼喂過高的蛋白不僅會造成資源浪費，增加飼料成本，同時還會導致動物機體氮排泄增加，造成環(huán)境污染，此外， 還可能導致動物繁殖力下降 （韓旭峰，2015）。 而過低的蛋白質(zhì)供應則無法滿足動物營養(yǎng)需要，可能會造成增重減慢、飼料轉(zhuǎn)化效率降低以及胴體質(zhì)量下降等。因此，配制適宜蛋白水平的飼糧可最大限度地提高飼料利用效率， 促進牦牛的生長，改善胴體品質(zhì)。 李秋鳳等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，飼養(yǎng)肉牛適宜的蛋白水平為12.5% ～16.0%。張春霞（2022）使用不同蛋白水平日糧飼喂西門塔爾牛，結(jié)果顯示，隨著蛋白水平的提高，平均日增重呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢， 中蛋白組與低蛋白組差異顯著（P＜0.05），與高蛋白組差異不顯著。代正陽 （2018） 研究發(fā)現(xiàn)， 飼喂中蛋白水平（14.95%） 日糧的金華黃牛試驗組平均日增重高于飼喂高蛋白（16.6%）和低蛋白（13.45%）水平的兩個試驗組，但差異不顯著。李紅麗等（2022）利用3 個不同蛋白質(zhì)水平 ［12%（低）、14%（中）、16%（高）］ 的全混合日糧分別飼喂3 組牦牛， 結(jié)果顯示，中蛋白組的終末體重、總增重和平均日增重顯著高于低蛋白質(zhì)組（P＜0.05），同時也高于高蛋白組，但無顯著差異。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，13.53%蛋白組的總增重和平均日增重高于16.20%蛋白組，且差異達到顯著水平。 當飼糧能量水平基本一致的情況下， 牦牛的育肥營養(yǎng)水平主要取決于蛋白水平。 科學合理的能氮比可促進瘤胃重要微生物菌群的生長繁殖， 有利于瘤胃微生物蛋白的合成， 提高瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收。 本研究中，過高的蛋白水平（16.20%）可能造成了飼糧能氮水平失衡， 進而影響了牦牛的生長性能（付敏等，2022；陳偉健，2008）。

屠宰性能是判斷動物生產(chǎn)性能高低的重要指標，直接影響最終的經(jīng)濟效益。 王巍等（2020）認為，在相同能量水平下，蛋白水平的提高對屠宰性能無顯著作用。張春霞（2022）研究表明，中蛋白組西門塔爾牛胴體重和屠宰率高于高蛋白組， 但差異不顯著。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，胴體重和屠宰率會隨著日糧蛋白水平的提高而降低，但兩處理組之間差異不顯著， 說明蛋白水平對屠宰性能影響較小。根據(jù)本研究可得出，在不影響牦牛生長的情況下，適當?shù)亟档惋暭Z粗蛋白質(zhì)含量，可有效降低飼養(yǎng)成本，提高生產(chǎn)效益。

3.2 飼糧不同粗蛋白質(zhì)水平對育肥牦牛瘤胃微生物菌群豐富度與多樣性的影響 α 多樣性指數(shù)是衡量微生物菌群豐富度和多樣性的綜合指標。α 多樣性越高，菌群組成越復雜、穩(wěn)定，增強了對外界干擾的抵抗力和適應性， 有利于宿主健康（Jiang 等，2021）。 以往的研究認為不同蛋白水平對瘤胃微生物豐富度有顯著影響， 但對多樣性影響不大， 菌群豐度與蛋白水平呈負相關。 郭凱等（2019）研究表明，飼喂低蛋白日糧（19%）的90 日齡犢牛瘤胃微生物群落的Chao 指數(shù)顯著高于高蛋白組（22%）（P＜0.05），兩處理組間的Shannon指數(shù)沒有顯著差異。 Zhang 等（2021）以2 歲母牦牛為研究對象，飼喂4 種不同蛋白水平（9.64%、11.25%、12.48%、13.87%）飼糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白水平最高組（13.87%）的瘤胃微生物群的Ace 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），其他組之間差異不顯著，不同組Shannon 指數(shù)之間差異不顯著。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)牦牛瘤胃微生物菌群α 多樣性指數(shù)在不同蛋白組之間均差異不顯著， 但菌群多樣性和豐度會隨著飼糧蛋白水平的增高而降低， 與上述結(jié)果相似。說明在相同的食物成分下，改變粗蛋白質(zhì)濃度并不足以引起瘤胃微生物群的強烈波動， 低蛋白組更有利于微生物繁殖。

3.3 不同粗蛋白質(zhì)水平對牦牛瘤胃微生物菌群組成的影響 無論是品種、 飼養(yǎng)方式還是營養(yǎng)水平改變， 厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度都占據(jù)著反芻動物瘤胃微生物的主導地位， 其次還有少量的變形菌門、螺旋體菌門和軟壁菌門等（李蔣偉等，2022；姜君等，2021；譚子璇等，2020；馬力等，2019；Singh 等，2015）。 本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，在門水平下，兩組相對豐度高于1%的菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和螺旋體門，在不同蛋白處理組之間差異不顯著。 厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度在牦牛瘤胃中占據(jù)絕對優(yōu)勢地位，占比達到92%以上，對牦牛健康起著非常關鍵的作用。厚壁菌門促進食物中的纖維降解，將纖維素轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸， 促進食物消化和生長發(fā)育； 擬桿菌門主要促進食物中蛋白質(zhì)和碳水化合物的消化吸收， 從而促進胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育（Jiang 等，2021）。在本研究中，高蛋白組的擬桿菌門相對豐度高于低蛋白組， 以促進蛋白的消化利用。 變形菌門的相對豐度比擬桿菌門和厚壁菌門要低得多，但在瘤胃代謝中仍起著重要作用。變形菌門是細菌中最大的細菌門， 參與多種功能代謝，例如氮代謝等，此外，變形菌門還包括很多病原菌， 其數(shù)量的增加是生物失調(diào)和疾病風險的潛在診斷特征（Shin 等，2015）。 螺旋體門也同樣發(fā)揮著重要的作用，能有效降解纖維素、果膠和磷酸鹽，發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸，為反芻動物機體提供能量。以上研究說明，反芻動物都共享著一個核心瘤胃微生物菌群， 不會因飼糧中的一種營養(yǎng)成分的改變而引起厚壁菌門和擬桿菌門的優(yōu)勢地位發(fā)生改變。

許多微生物對飼料底物濃度比較敏感， 長時間飼喂不同營養(yǎng)水平的日糧，會使瘤胃菌群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 Henderson 等（2015）對水牛、野牛、綿羊、山羊、鹿、羊駝、大羊駝等32 個動物品種的瘤胃微生物進行研究，發(fā)現(xiàn)飼糧改變會引起瘤胃中微生物菌屬的改變。本研究利用高通量測序技術分析發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，優(yōu)勢菌屬共有16 個，其中7 個屬于擬桿菌門，8 個屬于厚壁菌門，1 個屬于變形菌門。 相對豐度大于10%的菌屬有Prevotella、norank_f__F082 和Rikenellaceae_RC9_gut_group。Prevotella 屬于擬桿菌門，在瘤胃中一直處于優(yōu)勢地位，是瘤胃中主要蛋白降解菌屬之一，參與淀粉和蛋白質(zhì)的分解， 蛋白濃度的增加會引發(fā)普雷沃氏菌屬數(shù)量增多（張潔等，2020）。 因此，本研究中高蛋白組的Prevotella 的相對豐度大幅度上升，成為瘤胃中占比最高的菌屬。 Rikenellaceae_RC9_gut_group 屬于擬桿菌門，可促進脂質(zhì)代謝，參與短鏈脂肪酸，特別是丙酸的產(chǎn)生（Conte 等，2022）。Rikenellaceae_RC9_gut_group 還與宿主動物生長性能呈正相關， 其豐度在生長性能最好的動物中更高（Daghio 等，2021）。 本研究中，Rikenellaceae_RC9_gut_group 在低蛋白組的相對豐度顯著高于高蛋白組（P＜0.05），同時低蛋白組的平均日增重顯著高于高蛋白組 （P＜0.05）， 說明Rikenellaceae_RC9_gut_group 的數(shù)量會受到飼糧蛋白濃度的影響，同時其與生產(chǎn)性能可能成正相關，其是否影響反芻動物的生產(chǎn)性能還需進一步驗證。UCG-002 屬于厚壁菌門，在低蛋白組中相對豐度極顯著升高（P＜0.01）。 UCG-002 的相關報道較少，功能可能與脂質(zhì)代謝相關。 綜上所述，飼糧蛋白水平的改變會對牦牛的瘤胃微生物組成產(chǎn)生一定影響。

4 結(jié)論

綜上所述， 與16.20%蛋白水平飼糧相比，13.53%蛋白水平的飼糧更有利于育肥牦牛的生長，總增重和日增重顯著增加。不同蛋白水平飼糧對瘤胃微生物α 多樣性無顯著影響，但對微生物優(yōu)勢菌屬組成產(chǎn)生一定影響，13.53%蛋白水平飼糧更有利于瘤胃微生物的繁殖。 本研究為提高牦牛育肥生產(chǎn)效率、 優(yōu)化瘤胃微生物區(qū)系提供重要參考。