血滿草葉中綠原酸提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

郭 蒙 ， 姜春紅， 劉 韜， 王玉林， 勾 娜 ， 羅小虎，3

（1.黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000；2.方拓生物科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215100；3. 貴州省高等學(xué)校材料失效與防護(hù)工程研究中心，貴州 都勻 558000）

綠原酸是植物體內(nèi)有氧代謝的一種苯丙素類化合物。 具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、保肝利膽、 調(diào)節(jié)糖和脂代謝等多種生物學(xué)活性功能（Bagdas 等，2020；梁永鋒等，2018），在食品、化工、醫(yī)藥保健、飼料添加劑等方面都有應(yīng)用（卓春柳等，2019；Santana-Gálvez 等，2017）。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 在畜禽養(yǎng)殖和畜牧生產(chǎn)中添加綠原酸類化合物，可有效改善肉的品質(zhì)（丁浩軒等，2020），提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率及繁殖能力，降低腹瀉率，提高精液低溫保存效果， 增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能等 （王璐等，2022；萬(wàn)凡等，2021；謝凱桓等，2021；劉靜慧等，2020）。 如朱原等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，甜葉菊中綠原酸與布氏乳桿菌協(xié)同發(fā)酵可促進(jìn)雛雞腸道改善；不同日齡蛋雛雞添加甜葉菊綠原酸， 可改善盲腸菌群，并增強(qiáng)其機(jī)體免疫力（卓春柳等，2021）；劉靜慧等（2021）發(fā)現(xiàn)，在肉兔飼料中添加綠原酸可改善其空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)， 提高生長(zhǎng)性能； 張昊雪等（2022）發(fā)現(xiàn)，綠原酸還可抑制牛大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。 食品中加入綠原酸還可起到保鮮防腐護(hù)色效果，如南美白對(duì)蝦中加入綠原酸，可以保鮮（謝伊莎等，2021）； 飲料果汁中添加綠原酸具有防腐增色作用等（王云云等，2021）。

接骨木屬植物血滿草（Sambucus adnataWall.ex DC.），又稱接骨丹、血管草、紅山花、苛草等，其莖折斷明顯可見(jiàn)有紅色液體流出， 主要分布在西藏、寧夏、貴州、云南等地，在藏族、傣族、彝族、哈尼族等少數(shù)民族中作為藥用植物歷史悠久（楊增明等，2007）。 血滿草具有活血散瘀、祛風(fēng)濕、利尿等藥效，亦可用于跌打損傷、急慢性腎炎、風(fēng)疹瘙癢等（沈笑媛等，2006）。臨床應(yīng)用方面血滿草熱浴可局部治療新生兒硬腫癥（王鳳瓊等，2009）；血滿草為主要成分生產(chǎn)的制劑有傣藥關(guān)通舒膠囊和關(guān)通舒口服液（劉向榮等，2005）。

研究報(bào)道血滿草中含有萜類、黃酮類、醇類、木脂素類、 酚酸類、 脂肪酸類等化合物 （Li 等，2021；李巧月等，2019；劉冬麗等，2018）。 袁蕾等（2020）以純化水和雙水相K2HPO4、PEG6000 萃取體系為提取溶劑， 對(duì)血滿草中多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并明確純水提取溶劑中多糖的單糖組分。王文靜等（2010）發(fā)現(xiàn)，血滿草的水提物和醇提物對(duì)小白鼠灌服具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。Yuan 等（2020）從血滿草葉子中純化出的一種中性多糖可通過(guò)激活巨噬細(xì)胞和增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。但對(duì)于血滿草中綠原酸的提取鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)以單因素試驗(yàn)和Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 旨在確定血滿草葉子中綠原酸提取的最佳條件，同時(shí)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，為血滿草資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 T6 新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、AR224CN 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、KH2200DE 數(shù)控超聲波清洗器（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）。

血滿草葉，采自貴州都勻，自然晾干，粉碎過(guò)60 目篩封存保鮮袋內(nèi)，干燥器內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?綠原酸對(duì)照品、維生素C 對(duì)照品（Vc），純度≥98%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；2，2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），合肥巴斯夫生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸提取工藝流程 血滿草葉粉末→加提取溶劑→超聲→離心→綠原酸提取液→稀釋→紫外分光光法測(cè)定→計(jì)算。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 移取一系列不同體積的0.1 mg/mL 綠原酸對(duì)照溶液， 加無(wú)水乙醇稀釋定容，參考梁潔怡等（2021）制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=51.0173C-0.0042（R2= 0.9973）。

1.2.3 綠原酸提取率 移液槍吸取0.4 mL 樣品提取液，置于10 mL 量瓶，根據(jù)1.4 方法測(cè)定，用下列公式計(jì)算血滿草中綠原酸提取率。

式中：Y為血滿草葉中綠原酸提取率，%；c為綠原酸濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液體積，mL；m為血滿草葉粉末質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化血滿草葉中綠原酸因素與水平依照單因素試驗(yàn)結(jié)果， 確定最高綠原酸提取率的四個(gè)單因素參數(shù)， 作為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化血滿草葉中綠原酸的零點(diǎn)水平，進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素及水平

1.5 血滿草葉中綠原酸抗氧化活性測(cè)定

1.5.1 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 分別配制0.20 mmol/L DPPH 乙醇溶液、不同濃度的血滿草葉提取液和Vc 溶液（王翔等，2018）。 避光環(huán)境下，分別移取無(wú)水乙醇、 不同濃度的血滿草葉提取液或Vc 溶液2 mL， 加2 mL DPPH 乙醇溶液與其混合，37 ℃水浴30 min，517 nm 處測(cè)其吸光度， 各記為A1和A2。 DPPH 自由基清除率按下列公式計(jì)算。

1.5.2 ABTS 自由基清除活性測(cè)定 7.4×10-3mol/L ABTS 和2.6×10-3mol/L 過(guò)硫酸鉀水溶液取相同體積混合，避光保存12 h 待用（Thaipong 等，2012）。試驗(yàn)時(shí)配制成734 nm 下吸光度為（0.70±0.02）的工作液。 分別移取0.4 mL 無(wú)水乙醇或不同濃度綠原酸提取液與3.6 mL ABTS 工作液混合，37 ℃水浴6 min，734 nm 處測(cè)其吸光度，各記為A’1和A’2。ABTS 自由基清除率按下列公式計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響 由圖1 可見(jiàn)，綠原酸提取率呈先升后降趨勢(shì)，35%乙醇濃度時(shí)綠原酸提取率達(dá)到2.03%， 可能是因?yàn)橐掖紳舛仍龃?，溶劑極性降低，其他親脂性雜質(zhì)大量溶出的同時(shí)， 血滿草葉中綠原酸溶出會(huì)隨之減少（趙俊宏等，2021），因此試驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇溶液。

圖1 乙醇濃度對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響

2.2 液料比對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響如圖2 可見(jiàn)，液料比40：1（mL/g）時(shí)血滿草葉中綠原酸提取率達(dá)到最大2.25%，之后開(kāi)始下降?？赡苁且毫媳刃r(shí)， 增大乙醇溶液的量會(huì)加速溶質(zhì)傳質(zhì)，有利綠原酸的溶出，繼續(xù)增加乙醇溶液時(shí)，醇溶性雜質(zhì)會(huì)大量溶出，阻礙了綠原酸的溶出（許丹丹等，2020）。因此試驗(yàn)采用液料比為40：1（mL/g）。

圖2 液料比對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響

2.3 超聲時(shí)間對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響 如圖3 可見(jiàn)，隨超聲時(shí)間增長(zhǎng)，血滿草葉中綠原酸提取率呈先增后減趨勢(shì)，45 min 時(shí)達(dá)到最大值。 可能是因?yàn)樘崛r(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致綠原酸被氧化、分解、結(jié)構(gòu)被破壞或者雜質(zhì)含量的增加，從而使綠原酸提取率下降（趙俊宏等，2021）。因此試驗(yàn)超聲時(shí)間為45 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)血滿草中綠原酸提取率的影響

2.4 超聲溫度對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率的影響 如圖4 可見(jiàn)， 隨超聲溫度升高血滿草葉中綠原酸提取率呈先增后急劇減小趨向，60 ℃時(shí)達(dá)到最大值。 這可能是因?yàn)榫G原酸含有鄰二酚羥基不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在高溫條件下，易被氧化，從而降低血滿草葉中綠原酸提取率。 因此試驗(yàn)超聲溫度為60 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)血滿草中綠原酸提取率的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用Design Expert11.0 軟件對(duì)表2 進(jìn)行Box-Behnken 分析，所得試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。 模型優(yōu)化的數(shù)學(xué)回歸方程為：Y= 2.21-0.1017A-0.0008B-0.3067C+0.1075D-0.2350AB-0.1425AC-0.0125AD+0.0425BC+0.0750BD-0.1450 CD-0.2102A2-0.1265B2-0.3977C2+0.1360D2。

2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析 方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。 模型P值＜0.0001；失擬項(xiàng)P值0.2390＞0.05，說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇合適，在此試驗(yàn)條件下，對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率進(jìn)行測(cè)定。 變異系數(shù)CV為1.33%， 在有效范圍內(nèi)。 模型R2=0.9974，Radj2=0.9944，表明此模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差小，99.44%血滿草葉中綠原酸提取率變化可用此試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒忉?。由? 中F值可知，一次項(xiàng)中，除液料比對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率影響表現(xiàn)為不顯著外，其余三項(xiàng)均為極顯著，影響排序?yàn)椋篊＞D＞A＞B。二次項(xiàng)均為極顯著。 交互項(xiàng)中除AD 項(xiàng)外，其余均極顯著。

表4 方差分析

2.5.3 交互項(xiàng)作用分析 經(jīng)表3 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析可得交互項(xiàng)的3D 曲面和等高線變化圖，3D 曲面圖呈拱形或坡度陡峭時(shí)，等高線分布的越密，呈橢圓形或馬鞍形時(shí)，交互項(xiàng)作用影響就越顯著（曹艷華等，2020）。 由圖5 可知，AB、AC、BC 交互項(xiàng)的曲面圖坡度較陡峭， 等高線密集并呈典型的橢圓形，因此AB、AC、BC 交互項(xiàng)對(duì)血滿草葉中綠原酸的提取率影響最顯著。由AD 項(xiàng)3D 曲面圖和等高線可得，隨著超聲溫度的升高，血滿草葉中綠原酸的提取率呈緩慢上升趨勢(shì)；隨著乙醇濃度的升高，血滿草葉中綠原酸的提取率先緩慢上升至最高點(diǎn)再稍下降，曲線變化較為平滑，說(shuō)明AD 之間交互作用較小。 BD、CD 交互項(xiàng)的3D 曲面圖坡度相對(duì)較峻峭，等高線較密集且呈馬鞍形，因此BD、CD交互項(xiàng)對(duì)血滿草葉中綠原酸的提取率影響顯著。由圖5 分析可知， 結(jié)果與方差分析表3 中數(shù)據(jù)相一致。

圖5 交互項(xiàng)對(duì)血滿草葉中綠原酸提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.5.4 響應(yīng)面最佳工藝試驗(yàn)條件驗(yàn)證 由軟件Design Expert 對(duì)表3 數(shù)據(jù)優(yōu)化分析得提取血滿草葉中綠原酸的最佳工藝參數(shù)， 其乙醇濃度、 液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度分別為29.91%、46.92：1（mL/g）、40.61 min、70.00 ℃，此血滿草葉中綠原酸提取率預(yù)測(cè)值為2.61%。 為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的有效性和可行性， 實(shí)際操作最佳工藝采用乙醇濃度30%、液料比45：1（mL/g）、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度70 ℃，平行試驗(yàn)三次得到血滿草葉中綠原酸的提取率平均值為2.55%，與該試驗(yàn)預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦m合血滿草葉中綠原酸的提取。

2.6 血滿草葉中綠原酸抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH 自由基清除活性 如圖6 所示，在10 ～60 mg/L 試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)， 血滿草葉中綠原酸提取液與DPPH 自由基清除率呈正相關(guān)，Vc 溶液的DPPH 自由基清除率明顯高于綠原酸提取液，Vc 溶液和綠原酸提取液IC50值分別為18.4 mg/L 和59.7 mg/L， 說(shuō)明提取液中的綠原酸對(duì)DPPH 自由基有一定的清除作用。

2.6.2 ABTS 自由基清除活性 如圖7 所示，在5～30 mg/L 試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，血滿草葉中綠原酸提取液與ABTS 自由基清除率呈正相關(guān)，且Vc 溶液的ABTS 自由基清除能力較強(qiáng)。 綠原酸提取液濃度為30 mg/L 時(shí)，ABTS 自由基清除率達(dá)到61.5%。 Vc 溶液和綠原酸提取液的IC50值分別為6.5 mg/L 和23.0 mg/L，因此血滿草葉中綠原酸提取液對(duì)ABTS 自由基有一定的清除作用。

圖7 ABTS 自由基清除能力

3 結(jié)論

采用超聲輔助乙醇浸取法對(duì)血滿草葉中綠原酸提取條件進(jìn)行研究， 依照單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得最佳工藝條件為乙醇濃度30%、 液料比45：1（mL/g）、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度70 ℃，此條件下血滿草葉中綠原酸的提取率達(dá)到2.55%。體外抗氧化能力研究表明， 血滿草葉中綠原酸具有一定清除自由基作用，但Vc 對(duì)DPPH、ABTS 自由基的清除能力更強(qiáng)。