杜仲葉發(fā)酵綜合利用的研究進(jìn)展

胡競月， 岳 芽， 譚 欣， 徐 鶯， 莊國慶， 時(shí)小東

（1.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081）

杜仲（Eucommia ulmoides）是杜仲科的單科單屬植物，其適應(yīng)性強(qiáng)，在我國分布廣泛，在湖北、湖南、四川、江西、安徽、河南等27 個(gè)省、自治區(qū)、直轄市均有栽培（Li 等，2020b；Wu 等，2018）。 杜仲渾身是寶， 其干燥樹皮和葉均被收載于《中國藥典》，具有降血壓、強(qiáng)筋骨、抑菌等作用（Yan 等，2022；Huang 等，2021；Lyu 等，2017）。 杜仲葉作為潛在的新食品和杜仲膠資源， 已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)（Yan 等，2023；Li 等，2022a；郭姝等，2020）。微生物發(fā)酵是提高植物活性成分、改變功效、降低毒性的常用方法（Li 等，2020a）。 本文對杜仲葉發(fā)酵后營養(yǎng)物質(zhì)、活性成分以及揮發(fā)性成分的變化，杜仲葉發(fā)酵在食品、 飼料方面應(yīng)用的研究以及杜仲葉及其內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的功效研究進(jìn)行綜述，以期為杜仲葉的開發(fā)和綜合利用提供參考。

1 杜仲葉發(fā)酵的物質(zhì)變化

1.1 非揮發(fā)性成分的變化 杜仲葉含有粗蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸等營養(yǎng)成分，以及綠原酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、多酚等活性成分，發(fā)酵過程中微生物的代謝活動(dòng)使杜仲葉的非揮發(fā)成分含量發(fā)生變化（Li 等，2022b；Wu 等，2021）。 經(jīng)過產(chǎn)朊假絲酵母和黑曲霉菌復(fù)合發(fā)酵的復(fù)配杜仲葉， 其粗蛋白質(zhì)、 總氨基酸、 必需氨基酸的含量從發(fā)酵前的12.41%、9.76%和3.74%增加到25.23%、17.49%、6.34%（曹銀娣等，2020）。 白腐真菌固態(tài)發(fā)酵能夠促進(jìn)木質(zhì)素水解酶作用而釋放出還原糖， 從而提高杜仲葉片中還原糖的產(chǎn)量（Qian 等，2020）。 燕飛等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉制品發(fā)酵前期以脂肪代謝為主，后期則表現(xiàn)為戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換代謝、抗壞血酸和醛酸代謝豐度增加。發(fā)酵過程中微生物通過對外界物質(zhì)的利用進(jìn)行生長和代謝活動(dòng)，導(dǎo)致其生存、增殖和副產(chǎn)物的合成（De Villa等，2021）。 杜仲葉中營養(yǎng)成分的變化與發(fā)酵時(shí)間呈相關(guān)性， 在其他植物葉發(fā)酵中也有相似結(jié)果（Wang 等，2022）。 同時(shí)， 外界微生物能夠引起活性成分含量的變化以及新物質(zhì)的形成（Adebo 等，2022；Qiao 等，2022）。 在杜仲葉發(fā)酵中，研究主要集中在綠原酸、黃酮、萜類等非揮發(fā)性活性成分的變化。劉夢培等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，杜仲葉中總黃酮、總酚、綠原酸的含量呈先增加后下降的趨勢，發(fā)酵第4 天時(shí)相對較高。屠萬倩等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，渥堆發(fā)酵提高了杜仲葉中京尼平苷酸、 桃葉珊瑚苷和車葉草苷等環(huán)烯醚萜苷的含量，而黃酮類成分的含量變化相對較小。內(nèi)生菌與植物的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系決定了某些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力（魏寶陽等，2011）。 Shi 等（2012）從杜仲葉中篩選分離產(chǎn)松脂醇二葡萄糖苷（PDG）內(nèi)生真菌，具有微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)PDG 的潛力。

1.2 揮發(fā)性成分的變化 發(fā)酵可以引起揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生變化進(jìn)而導(dǎo)致風(fēng)味的改變， 能夠有效解決不良?xì)馕兜葐栴}（Li 等，2023；Kim 等，2021）?；跉庀嗌V-離子遷移譜（GC-IMS）聯(lián)用技術(shù)對食用菌株杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定出68 種化合物，包括醇、醛、酮、酸、酯等（Wang 等，2020）。 利用植物乳桿菌、德式乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌對杜仲葉水提液進(jìn)行發(fā)酵， 無論哪種乳酸菌發(fā)酵后揮發(fā)性成分的種類和含量均增加， 能夠降低杜仲葉青葉味而產(chǎn)生具有花香味的二氫-α-紫羅蘭酮（劉夢培等，2021）。 曾橋等（2022） 運(yùn)用茯磚茶生產(chǎn)工藝對杜仲葉茶發(fā)酵， 也證實(shí)微生物發(fā)酵能夠降低杜仲葉本身不良?xì)馕稉]發(fā)性成分而提升呈香揮發(fā)性物質(zhì)。 微生物發(fā)酵對杜仲葉揮發(fā)性成分的影響是個(gè)復(fù)雜的過程，與菌株和工藝等密切相關(guān)，其將作為杜仲葉產(chǎn)品改善和品質(zhì)提升的重要手段。

2 杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)物的功效研究

2.1 抗氧化及抑菌作用 杜仲葉中的綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和紫云英苷等活性成分與其抗氧化活性相關(guān)（屠萬倩等，2022）。 發(fā)酵能夠?qū)Χ胖偃~的抗氧化能力產(chǎn)生影響。 劉夢培等（2018）研究表明，杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)品的DPPH 自由基清除能力、鐵還原力與發(fā)酵時(shí)間及其活性成分的變化趨勢一致。通過巴氏醋酸桿菌As141 發(fā)酵杜仲葉，DPPH、羥基自由基清除活性和還原力的IC50值分別達(dá)到2.62、27.21 μg/mL 和1.72 mg/mL，表明通過發(fā)酵杜仲葉，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性得到提高（Jia 等，2019）。在動(dòng)物試驗(yàn)中也證實(shí)發(fā)酵后杜仲葉復(fù)合物能顯著提高總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和總抗氧化能力（TAOC）（曹銀娣等，2021）。 在抑菌方面，Jia 等（2020）研究了杜仲葉發(fā)酵醋對不同微生物的抑制效果，發(fā)現(xiàn)對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母等均有一定的抑制作用，抑菌活性明顯優(yōu)于對照組。

2.2 生長性能及免疫力作用 杜仲葉及其提取物具有改善動(dòng)物生長性能和提高機(jī)體免疫力的作用（陳玉敏等，2015；Zhou 等，2009）。 添加0.3%發(fā)酵杜仲葉日糧能夠提高生長育肥豬的平均末重、平均日增重和屠宰率，且料重比顯著降低，說明發(fā)酵杜仲葉粉的添加提高了豬的生長性能（段明房等，2018）。 適量杜仲葉復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物能夠?qū)θ庾须u十二指腸絨毛高度、 空腸絨毛高度及隱窩深度均產(chǎn)生影響，進(jìn)而增強(qiáng)腸道消化吸收能力，促進(jìn)肉雞的生長性能（曹銀娣等，2020）。將杜仲葉發(fā)酵和提取作為飼料添加劑飼喂幼齡雞， 發(fā)酵組雞的平均體重顯著高于提取物組與對照組， 同時(shí)增加了血清球蛋白含量， 表明杜仲葉發(fā)酵物較提取物不僅可以促進(jìn)雞的生長發(fā)育， 而且能提高機(jī)體免疫力（李卓妮等，2022）。彭密軍等（2019）在斷奶仔豬飼糧中添加杜仲葉提取物、 發(fā)酵杜仲葉和杜仲葉干粉， 結(jié)果表明杜仲葉提取物在促進(jìn)斷奶仔豬生長性能和提高免疫能力等方面優(yōu)于發(fā)酵杜仲葉和杜仲葉干粉， 但未對其差異性形成原因進(jìn)行深入研究。而在羅非魚中，添加杜仲葉提取物未對其生長性能產(chǎn)生顯著影響，但能夠通過激活Nrf2 信號通路提高腸道抗氧化能力和抑制TLR2-MyD88-NF-κB 信號通路實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)免疫應(yīng)答能力（Huang等，2022）。 而發(fā)酵杜仲葉通過何種方式和信號通路調(diào)控動(dòng)物免疫力尚有待深入研究。

3 杜仲葉發(fā)酵在生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 杜仲葉發(fā)酵在食品方面的應(yīng)用 杜仲葉具有食用習(xí)慣，可用于炒菜、煮粥、飲茶或榨汁加入面團(tuán)等。 毒理學(xué)試驗(yàn)也證實(shí)了杜仲葉的食用安全性，其在食品方面得到了應(yīng)用開發(fā)（龔頻等，2022）。 通過發(fā)酵工藝杜仲葉制品能夠更符合消費(fèi)者的期望，以發(fā)酵飲品類為主。 張麗華等（2019b）采用冠突散囊菌發(fā)酵杜仲葉，在最佳工藝條件下，即接種量20%、含水量35%、渥堆溫度45 ℃、渥堆時(shí)間3 h、發(fā)酵時(shí)間為8 d，制得香味濃郁的杜仲茶，其綠原酸含量為0.478 mg/g。徐青梅等（2021）以杜仲葉與新鮮茶葉為主要原料，優(yōu)化發(fā)酵條件等工藝，研制出滋味醇和、風(fēng)味俱佳的杜仲葉復(fù)合工夫紅茶。在其他飲品方面，張麗華等（2019a）利用植物乳桿菌對杜仲鮮葉進(jìn)行發(fā)酵， 以低聚木糖為糖源使其具有更優(yōu)的活菌數(shù)， 為杜仲葉活菌型發(fā)酵飲料的開發(fā)提供參考。 同時(shí)，添加適量杜仲葉制備的發(fā)酵醋具有良好的風(fēng)味（Jia 等，2019；周琳娜等，2012）。目前，陜西、湖南、廣西、江西、河北等省份已經(jīng)開展杜仲葉即是食品又是中藥材的試點(diǎn)工作。

3.2 杜仲葉發(fā)酵在飼料方面的應(yīng)用 發(fā)酵是飼糧生產(chǎn)中常用的生產(chǎn)工藝， 通過微生物發(fā)酵可有效降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，生成大量有機(jī)酸、小肽、氨基酸、酶以及各種代謝產(chǎn)物，改善飼料適口性， 促進(jìn)動(dòng)物對營養(yǎng)成分的消化吸收 （趙瑩等，2022）。在動(dòng)物飼料添加一定量的杜仲葉粉經(jīng)微貯后制備出發(fā)酵飼料， 能夠有效提高飼料的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值， 提升動(dòng)物飼料養(yǎng)分消化率和利用價(jià)值（表1）。 譚世圖等（2020）在玉米秸稈發(fā)酵飼料中添加杜仲粉， 表明適宜量的杜仲粉可以有效提高飼料中非蛋白氮（PA）含量，降低結(jié)合蛋白（PC）含量，進(jìn)而提高飼料的消化利用率。在花生秧和紅薯秧微貯飼料中結(jié)果一致， 表明發(fā)酵過程中杜仲粉能夠有效提高飼料蛋白品質(zhì)， 并能夠起到改善飼料質(zhì)地和氣味的作用（楊樂赟等，2022；平偉夢等，2021）。 同時(shí)，飼糧中添加杜仲發(fā)酵產(chǎn)物能夠改善肉品質(zhì)，在一定程度上改善氨基酸和脂肪酸含量，并對肌肉pH、滴水損失、蒸煮損失和剪切力產(chǎn)生影響，進(jìn)而改善肉色、嫩度、多汁性及風(fēng)味（曹銀娣等，2021；彭密軍等，2019；段明房等，2018）。 近年來，隨著綠色飼料添加劑及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，發(fā)酵杜仲葉飼料具有廣闊的市場前景。

表1 發(fā)酵杜仲葉在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用

4 總結(jié)與展望

目前， 生物發(fā)酵技術(shù)的研究已經(jīng)受到廣泛關(guān)注（王聰聰?shù)龋?022）。 發(fā)酵杜仲葉的成分、功效和用途等方面發(fā)生了不同程度的變化（圖1）。 杜仲葉經(jīng)過發(fā)酵后， 其粗蛋白質(zhì)和氨基酸含量均呈現(xiàn)不同程度的提高，而黃酮、綠原酸、多酚等活性物質(zhì)也隨著發(fā)酵產(chǎn)生不同程度的變化。 同時(shí)， 發(fā)酵能夠改善杜仲葉中呈香味揮發(fā)性物質(zhì)， 從而提高產(chǎn)品品質(zhì)。發(fā)酵杜仲葉中各組分物質(zhì)含量與菌株、發(fā)酵時(shí)間、工藝等密切相關(guān)。作為我國重要的木本藥用植物， 杜仲葉含有的活性成分可能會對發(fā)酵菌株生長產(chǎn)生影響， 造成發(fā)酵難度的增加和工藝的復(fù)雜性。因此，對于杜仲葉發(fā)酵專用菌株仍需開展深入研究，尤其是杜仲內(nèi)生菌的鑒定和篩選。杜仲葉和發(fā)酵杜仲葉及提取物作為飼料添加劑已經(jīng)得到應(yīng)用， 但其通過何種調(diào)控機(jī)制提高動(dòng)物抗氧化性和免疫性等尚有待深入研究。此外，杜仲葉即是食品又是中藥材的試點(diǎn)工作已經(jīng)在多個(gè)省份開展，杜仲葉迎來了快速發(fā)展機(jī)遇。發(fā)酵杜仲葉在食品中應(yīng)用還是過于單一， 加工過程中有效成分的變化規(guī)律及其影響因素還不明確， 其安全性還有待全面深入研究。 杜仲葉發(fā)酵使其揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分發(fā)生變化，目前尚未標(biāo)準(zhǔn)化，可根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需求建立杜仲葉發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程， 促進(jìn)杜仲葉發(fā)酵相關(guān)產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

圖1 杜仲發(fā)酵葉研究進(jìn)展及應(yīng)用