高效液相色譜法測定腐乳中3種紅曲色素

任意

上海市營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站/上海源本食品質(zhì)量檢驗有限公司（上海 200090）

腐乳，又稱豆腐乳，是豆腐經(jīng)根霉或毛菌霉發(fā)酵，加鹽腌制，根據(jù)需要放入酒及各種配料釀制而成的一種發(fā)酵豆制品，通常分為青方、紅方和白方三大類。其中，紅方是在后期發(fā)酵過程中，通過添加著色劑紅曲，使腐乳表面呈現(xiàn)出一種紅色。紅曲色素，是一種我國傳統(tǒng)的天然食用色素，其以大米、大豆為主要原料，通過紅曲霉菌發(fā)酵提取而得到的一種混合物，包含3種色系，分別為紅、黃、橙?；旌衔镏写蟛糠譃榇既苄陨?，少部分為水溶性色素。紅曲色素的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好，光穩(wěn)定性較差[1-2]。

由于不同生產(chǎn)工藝制成的紅曲色素組成不同，這使得不同紅腐乳所呈現(xiàn)的紅色略有不同。我國關(guān)于紅腐乳中紅曲的研究多為菌種的研究，很少有關(guān)于其色素含量的研究。因此，結(jié)合GB 5009.150—2016《食品中紅曲色素的測定》[3]，對紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素3種醇溶性色素進(jìn)行含量的測定，同時優(yōu)化檢測條件，為研究紅腐乳中3種色素含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀（配SPD-M20A二級陣列管檢測器，日本島津公司）；Silversil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪馬科技有限公司）；Master-D純水機（上海和泰儀器有限公司）；BSA323S電子天平（精度0.001 g，德國賽多利斯集團(tuán)）；XS105電子天平[精度0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；GL20M醫(yī)用離心機（江蘇鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；BE-2600多管渦旋混合儀（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；0.22 μm水相過濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；0.22 μm有機相針式濾器（尼龍，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

乙酸銨、乙酸、無水乙醇等（均為分析純）；甲醇（色譜純）；試驗用水為18.2 MΩ·cm去離子水。

乙酸-乙酸銨溶液（pH 5.0）：稱取0.77 g乙酸銨，加水溶解，用冰乙酸調(diào)整溶液pH至5.0，定容至1 L，混勻后經(jīng)0.22 μm水相過濾膜抽濾后備用。

紅曲紅胺（N-Fmoc-8-Aminooctanoic Acid，CAS號126631-93-4，純度99.14%，美國Panphy公司）；紅曲素（Monascin，CAS號21516-68-7，純度99.5%，美國Panphy公司）；紅曲紅素（Monascus Red，CAS號874807-57-5，純度98%，美國Panphy公司）。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取0.005 0 g紅曲紅胺、0.002 5 g紅曲素和0.255 1 g紅曲紅素，用甲醇定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度分別為紅曲紅胺100 μg/mL、紅曲素50 μg/mL和紅曲紅素5 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

腐乳（市售）。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g（精確至0.001 g）攪拌均勻的腐乳樣品于50 mL刻度離心管中，加入20 mL無水乙醇，渦旋振蕩提取10 min，按5 000 r/min離心3 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL刻度離心管中，向樣品中再次加入20 mL無水乙醇，重復(fù)提取后離心，合并上清液，用無水乙醇定容至50 mL，混勻，取溶液過0.22 μm有機濾膜，上機待測（如提取液過于渾濁，可再次適當(dāng)離心）。

1.3 色譜條件

Silversil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相A為甲醇，流動相B為乙酸-乙酸銨溶液（pH 5.0），梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長：紅曲紅胺264 nm，紅曲素和紅曲紅素390 nm；運行時間40 min。標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1 紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取0，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（紅曲紅胺100 μg/mL、紅曲素50 μg/mL、紅曲紅素5 000 μg/mL）于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為紅曲紅胺0，2.00，4.00，8.00，20.00和40.00 μg/mL，紅曲素0，1.00，2.00，4.00，10.00和20.00 μg/mL，紅曲紅素0，100，200，400，1 000和2 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇

有關(guān)文獻(xiàn)記載的關(guān)于食品中紅曲色素的前處理條件有多種，如甲醇-乙酸乙酯提取結(jié)合凝膠滲透色譜（GPC）凈化[4]、乙醇-水提取結(jié)合固相萃取柱（SPE）凈化[3,5]、乙腈-水直接提取[6]等。紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素均為醇溶性色素，試驗發(fā)現(xiàn)采用SPE小柱凈化上柱時，如果待上柱液中有機溶劑比例較低，則紅曲色素?zé)o法完全溶解，如果有機溶劑比例較高時，則不易被SPE小柱保留，同時腐乳中脂肪含量較少，蛋白質(zhì)又難溶于乙醇，因此選擇通過乙醇提取并離心的手段進(jìn)行前處理。試驗選取80%乙醇水溶液和無水乙醇對同一樣品進(jìn)行提取比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用無水乙醇進(jìn)行提取含量更高。

2.2 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

將紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。稱樣量5 g，定容50 mL時，以3倍信噪比（rSN）計算3中紅曲色素的檢出限（SLOD），結(jié)果為0.031 2～28.8 mg/kg。以10倍信噪比（rSN）計算定量限（SLOQ），結(jié)果為0.104～96.0 mg/kg。其回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、檢出限和定量限見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2～圖4。

圖2 紅曲紅胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 紅曲素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 紅曲紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 3種紅曲色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度試驗

準(zhǔn)確稱取充分混勻的白腐乳，分別進(jìn)行低、中、高3個加標(biāo)水平的基質(zhì)加標(biāo)回收試驗，每一水平分別進(jìn)行6份平行試驗，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3，加標(biāo)色譜圖見圖5。3種加標(biāo)水平的基質(zhì)加標(biāo)回收率分別為91.5%～95.4%，95.6%～98.7%和98.8%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD，n=6）分別為1.02%～1.36%，0.76%～1.14%和0.36%～0.98%，方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 加標(biāo)回收和精密度試驗結(jié)果

2.4 樣品含量測定

在試驗條件下，分別對市場上6份不同紅腐乳進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 6份紅腐乳中紅曲色素的含量測定結(jié)果單位：mg/kg

3 結(jié)論

試驗采用無水乙醇直接提取，Silversil C18色譜柱進(jìn)行分離，對腐乳中紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素的含量進(jìn)行測定。相關(guān)系數(shù)R2為0.999 90～0.999 98，紅曲紅胺檢出限為0.075 8 mg/kg，定量限為0.252 mg/kg；紅曲素檢出限為0.031 2 mg/kg，定量限為0.104 mg/kg；紅曲紅素檢出限為28.8 mg/kg，定量限為96.0 mg/kg。回收率為91.5%～101.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為0.36%～1.36%。試驗方法準(zhǔn)確度高、精密度良好，可適用于腐乳中紅曲紅胺、紅曲素和紅曲紅素含量的測定。