透明質(zhì)酸鈉組合物對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用

張霞，宋永民，馮曉毅，郭學(xué)平*

華熙生物科技股份有限公司（濟(jì)南 250014）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種以慢性間歇性腸道炎癥為特征的炎癥性消化系統(tǒng)疾病，其可因環(huán)境因素、遺傳易感性、腸道上皮屏障功能損傷或腸道菌群的免疫反應(yīng)受損而惡化[1]。潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是IBD的主要類別之一，其主要癥狀為嘔吐、腹瀉、腹痛、直腸出血以及體重減輕等，嚴(yán)重降低了UC患者的生活質(zhì)量[2]。目前，UC主要是通過5-氨基水楊酸鹽、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等藥物治療，然而藥物治療會(huì)表現(xiàn)出一些副作用，如過敏反應(yīng)、藥物依賴性和肝毒性[3]。因此，在不損害個(gè)人生活質(zhì)量的情況下預(yù)防和控制UC的替代和補(bǔ)充療法受到了人們的重視和青睞。其中，采用溫和、功效持久穩(wěn)定、無副作用或副作用很小的天然活性物質(zhì)緩解UC癥狀的治療方法也越來越受到人們的關(guān)注。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種線性糖胺聚糖，由重復(fù)的N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸雙糖單位組成[4]。國家衛(wèi)健委批準(zhǔn)的HA用于普通食品的形式為其鈉鹽，即透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）。HA是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，主要在大部分軟結(jié)締組織中起著重要的生理功能，包括腸道。有研究表明，HA可以維持腸道通透性，增強(qiáng)腸道免疫力，減少腸道感染[5]。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充外源性透明質(zhì)酸增加了小鼠對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）的耐藥性，并能夠減輕腸道炎癥狀。從而，通過口服HA改善UC成為值得關(guān)注的一種手段。

文章通過構(gòu)建小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，考察SH分別與乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）、菊粉（inulin，INU）及維生素C（vitamin C，VC）復(fù)配對(duì)腸道的保護(hù)功效，為以HA為主要天然活性物質(zhì)緩解UC的治療方式提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物和試劑

SPF級(jí)C 57 BL/6 J小鼠（濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司），生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（魯）20180031，雄性，1～2月齡，體重約20±5 g，動(dòng)物合格證號(hào)：NO.370726221100437887。動(dòng)物飼養(yǎng)和處理遵循中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)規(guī)定。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。

透明質(zhì)酸鈉（分子量：2 190 kDa，華熙生物科技股份有限公司）；乳清分離蛋白（杭州科田生物技術(shù)有限公司）；菊粉（廣東雅惠生物科技有限公司）；維生素C（河南天得商貿(mào)有限公司）；葡聚糖硫酸鈉（分子量：4萬，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE染色劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；甲醛水溶液和石蠟（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.1.2 儀器和設(shè)備

UW 2200 H型電子天平（日本島津公司）；Tissue-Tek?PrismaTM型全封閉組織脫水機(jī)（日本櫻花公司）；TK-218型攤烤片機(jī)（湖北泰維醫(yī)療器械有限公司）；NP-B型生物組織包埋機(jī)（湖北諾普醫(yī)療器械有限公司）；RM 2235型切片機(jī)（德國Leica公司）；尼康E 100生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建

健康雄性C 57 BL/6 J小鼠，SPF級(jí)，20±5 g，50只，按體重將其隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（Control）、模型組（DSS）、SH+乳清分離蛋白組（SH+WPI），SH+菊粉組（SH+INU），SH+維生素C組（SH+VC），每組10只。

空白對(duì)照組的小鼠在28 d期間都飲用純水。模型組小鼠在28 d內(nèi)用純水灌胃，在第22～第28天期間飲用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.50% DSS的純水溶液，用以建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型；其他SH組合物組小鼠在28 d內(nèi)灌胃相應(yīng)同體積的供試品溶液，在第22～第28天飲用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.50% DSS的純水溶液。各試驗(yàn)組的灌胃劑量及質(zhì)量濃度見表1，按照0.20 mL/10 g體積給小鼠進(jìn)行灌胃。透明質(zhì)酸鈉的用量為人體推薦攝入量200 mg/d的10倍。

除空白對(duì)照組外，各個(gè)試驗(yàn)組在22～28 d間，每2 d更換1次DSS溶液。在試驗(yàn)第28天下午全部小鼠禁食，第29天對(duì)小鼠實(shí)施安樂死。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)估

通過潰瘍性結(jié)腸炎模型建立后每天記錄的臨床癥狀表現(xiàn)進(jìn)行腸道疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估。體重減輕（0：無；1：減少1%～5%；2：減少5%～10%；3：減少10%～15%；4：減少＞15%）、大便稠度（0：正常；2：稀便；4：水樣腹瀉）和血便情況（0：正常；2：輕微出血；4：嚴(yán)重出血）三項(xiàng)的總和，作為腸道疾病活動(dòng)指數(shù)的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 結(jié)腸長度測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行安樂死處理，迅速剖開腹腔，分離小鼠結(jié)腸，測(cè)量盲腸末端至肛門整個(gè)腸段的長度。

1.2.4 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè)

取距肛門處2 cm的結(jié)腸組織，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，最后通過光學(xué)顯微鏡觀察腸黏膜的病理變化，并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。隱窩結(jié)構(gòu)的破壞（0～4：無損傷、基底三分之一損傷、基底三分之二損傷、僅表面上皮完整、整個(gè)隱窩和整個(gè)上皮丟失）、病變深度（0～3：無、黏膜、黏膜下、透壁）和炎癥細(xì)胞浸潤的程度（0～3：無、輕微、中度、嚴(yán)重）三項(xiàng)的總和，作為組織病理學(xué)評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

文章數(shù)據(jù)均以表示，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用單因素方差分析（ANOVA）或T檢驗(yàn)，評(píng)分資料采用秩和檢驗(yàn)（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）。所有圖均采用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SH組合物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI值的影響

DAI評(píng)分是UC模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)之一。參照試驗(yàn)記錄，空白對(duì)照組小鼠體重變化輕微，精神狀態(tài)及活動(dòng)量正常，而其他各組小鼠在給予DSS后逐漸出現(xiàn)體重減輕、精神不振、活動(dòng)量下降、腹瀉等現(xiàn)象。這種現(xiàn)象與孫晶晶等[7]的研究中描述一致。從圖1可以看出，小鼠以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.50% DSS溶液自由飲用期間，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠DAI評(píng)分顯著升高（P＜0.05），表明小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型形成。與模型組相比，經(jīng)SH+WPI、SH+INU和SH+VC干預(yù)后，小鼠DAI評(píng)分分別降低了26.42%，35.85%和33.96%，說明三組SH組合物具有減輕由DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎癥狀的趨勢(shì)。

2.2 SH組合物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

小鼠結(jié)腸萎縮是UC的重要特征之一[8]。從圖2可以看出，與空白對(duì)照組相比，DSS組的結(jié)腸長度萎縮了1.15 cm（P＜0.05），說明小鼠UC模型建立成功。同時(shí)，經(jīng)SH+WPI、SH+INU干預(yù)后，小鼠結(jié)腸長度分別縮短了0.52 cm、0.14 cm，而SH+VC組的結(jié)腸更長，增加了0.51 cm，腸內(nèi)容物為健康的黑色狀態(tài)，說明口服這三種SH組合物能顯著抑制小鼠結(jié)腸長度縮短（P＜0.05），有效改善UC的結(jié)腸萎縮。吳銘等[9]的研究中，經(jīng)紫色菜蔬乙醇提取物干預(yù)后的小鼠結(jié)腸長度較模型組小鼠顯著增長，得出其能夠有效抑制DSS導(dǎo)致結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸萎縮情況的結(jié)論，該試驗(yàn)結(jié)論與文章研究類似。

圖2 SH組合物對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響

2.3 SH組合物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道組織病理的影響

腸道組織學(xué)改變和結(jié)腸黏膜損傷是UC的病理表現(xiàn)特征[10]。從圖3可以看出，空白對(duì)照組小鼠的結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞及腺體隱窩結(jié)構(gòu)完整，且排列整齊，沒有炎性細(xì)胞浸潤，而模型組小鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞丟失，腺體隱窩結(jié)構(gòu)破壞，伴有炎性細(xì)胞浸潤。這與Lü等[11]用DSS對(duì)小鼠構(gòu)建UC模型后的結(jié)腸組織病理學(xué)變化一致。SH+INU組、SH+VC組小鼠的結(jié)腸黏膜損傷有一定程度減輕，腺體隱窩排列趨于整齊，上皮結(jié)構(gòu)較完整，炎性細(xì)胞浸潤減少。同時(shí)，根據(jù)圖4小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分，對(duì)比模型組，SH+INU組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分降低了43.18%，SH+VC組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分降低38.64%（P＜0.05）。病理結(jié)果表明，SH+INU具有改善小鼠結(jié)腸組織損傷的趨勢(shì)，SH+VC可明顯改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織損傷。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎因其慢性、復(fù)發(fā)、高發(fā)病率等特性，已成為世界范圍內(nèi)主要的健康問題之一[12]?；加袧冃越Y(jié)腸炎的人，其免疫反應(yīng)被激活，腸道通透性增加，腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)及腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)被破壞，從而激活更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)[13]。透明質(zhì)酸是一種糖胺聚糖聚合物，已被證明在胃腸道的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。透明質(zhì)酸在腸道炎癥疾病中具有抗炎和富集微生物的作用[14]。同時(shí)，有研究表明透明質(zhì)酸主要通過維持腸道屏障防御和功能來預(yù)防腸道細(xì)菌感染和減少腸道炎癥[5,15-18]。菊粉是一種天然果聚糖，其作為益生元可以改善腸道中菌群的結(jié)構(gòu)與組成，以及加強(qiáng)腸黏膜屏障作用，從而發(fā)揮對(duì)炎癥性腸病的有效影響[19]。乳清蛋白為常見蛋白補(bǔ)充劑之一，其主要組成成分為免疫球蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等。乳清蛋白含有蛋氨酸與半胱氨酸，能夠抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激以及改善腸道中致病菌群的相對(duì)豐度，最終發(fā)揮保護(hù)腸道屏障的功能[20]。維生素C具有強(qiáng)大的氧自由基清除能力，其能夠通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤，調(diào)節(jié)炎癥因子等多種途徑抑制炎癥反應(yīng)[21]。同時(shí)，維生素C可以增強(qiáng)腸道黏膜的屏障功能[22]。

基于此，文章將透明質(zhì)酸鈉分別與菊粉、乳清分離蛋白、維生素C進(jìn)行復(fù)配，研究不同SH組合物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用。文章采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.50%DSS溶液對(duì)小鼠造成潰瘍性結(jié)腸炎模型，與模型組對(duì)比，各SH組合物組小鼠的DAI值增長緩慢，結(jié)腸長度均顯著延長（P＜0.05），同時(shí)，SH+INU、SH+VC組小鼠的結(jié)腸黏膜損傷有一定程度減輕，腺體隱窩排列較整齊，上皮結(jié)構(gòu)較完整，炎性細(xì)胞浸潤減少，且SH+VC組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。

4 結(jié)論

綜上所述：透明質(zhì)酸鈉分別與乳清分離蛋白、菊粉、維生素C復(fù)配均可發(fā)揮對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的緩解作用，其中，透明質(zhì)酸鈉與維生素C復(fù)配的效果更為明顯。此研究結(jié)果為透明質(zhì)酸鈉及其組合物在緩解潰瘍性結(jié)腸炎方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。