復(fù)合益生菌發(fā)酵鮮茶飲料揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

陳一萌*，顏麟灃，李鳴，馮德建，杜曉，羅凡

1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司（成都 611130）；2.四川省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司（宜賓 644007）；3.四川大學(xué)（成都 610065）；4.中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院（成都 610056）；5.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)（雅安 625014）；6.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所（成都 610066）

風(fēng)味是評(píng)價(jià)食品質(zhì)量的重要指標(biāo)，影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量[1]。茶葉中的主要風(fēng)味物質(zhì)為茶湯中溶解的可溶性化合物，包括多酚類、咖啡堿、氨基酸、可溶性糖、有機(jī)酸等。發(fā)酵茶飲料的風(fēng)味受到原料、菌種、發(fā)酵工藝、熟化過程等多種因素的影響[2-4]。尤其是發(fā)酵菌種的差異對(duì)產(chǎn)品最終風(fēng)味影響極大，市面上常見的發(fā)酵茶飲料以乳酸菌發(fā)酵為主，研究表明經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后風(fēng)味成分會(huì)變得更加復(fù)雜。

試驗(yàn)選用茶鮮葉為主要原料，以酵母菌結(jié)合植物乳桿菌混合發(fā)酵制備茶飲料，采用SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)分析樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，并與由市售菌劑（含植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌）發(fā)酵制備的樣品進(jìn)行對(duì)比，探究酵母菌+乳酸菌混菌發(fā)酵與市售菌種發(fā)酵的茶飲料主要揮發(fā)性風(fēng)味成分的區(qū)別，確定益生菌發(fā)酵鮮茶飲料中關(guān)鍵揮發(fā)物質(zhì)，為復(fù)合益生菌的商業(yè)化應(yīng)用及益生菌發(fā)酵鮮茶飲料的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鮮茶葉（四川省茶業(yè)集團(tuán)股份有限公司茶葉基地）；蜂蜜（威遠(yuǎn)縣劉青蜜蜂養(yǎng)殖專業(yè)合作社）；酵母菌、植物乳桿菌（四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司）；市售菌劑（含植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、瑞士乳桿菌，安琪酵母股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GC/MS-TQ2040氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津儀器公司）；DGG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TD5A-WS臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；YXQLS-SH全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DH-500電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)世紀(jì)有限公司）；SW-CJ-1CU潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ESJ200-4B電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 益生菌發(fā)酵鮮茶飲料工藝流程

新鮮茶葉→挑選→攤放→殺青→切碎→浸提→過濾→調(diào)配→殺菌→接種→發(fā)酵→殺菌→灌裝→成品

挑選干凈、無腐爛、無霉變的夏秋茶鮮葉，清洗掉表面灰塵和泥土后在室溫25 ℃、空氣相對(duì)濕度67%～72%環(huán)境中攤放4 h；采用滾筒殺青的方式進(jìn)行殺青，殺青葉攤晾冷卻后進(jìn)行切碎；稱取碎茶葉與80 ℃熱水按1∶70（g/mL）比例進(jìn)行混合，并在80 ℃條件下浸提30 min。過濾掉茶葉收集濾液；利用蜂蜜調(diào)節(jié)茶葉浸提液的糖度至10%，升溫殺菌，待液體冷卻后接種發(fā)酵菌劑，在28 ℃下發(fā)酵24 h。升溫終止發(fā)酵；所得到的發(fā)酵鮮茶飲料進(jìn)行灌裝后密封，隨即檢測(cè)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

分別取3.00 g樣品，于10 mL頂空瓶中，于60 ℃水浴平衡5 min，頂空萃取55 min。上機(jī)解析50 min，開始進(jìn)行GC/MS檢測(cè)[5]。

1.3.2 GC條件

色譜柱載氣He，流速1.67 mL/min；進(jìn)樣口溫度240 ℃；頂空萃取手動(dòng)進(jìn)樣。升溫程序：起始溫度45℃，保持3 min，以3 ℃/min 升至150 ℃（保留3 min），以12 ℃/min升至220 ℃（保留3 min）。

1.3.3 MS條件

EI電離源，離子源溫度200 ℃，接口溫度40 ℃；采用全離子掃描（Scan）模式采集信號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GC-MS得到的總離子圖，在NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行初步比對(duì)，將相似度＞80的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，鑒定出各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，化合物相對(duì)含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS測(cè)定不同復(fù)合益生菌發(fā)酵鮮茶飲料中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

采用SPME-GC-MS方法對(duì)2種不同菌種發(fā)酵得到的樣品組1和樣品組2的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，主要揮發(fā)性風(fēng)味成分如表1所示。

表1 不同菌種發(fā)酵鮮茶飲料的揮發(fā)性風(fēng)味成分及其相對(duì)含量

由表1可知，2組不同的發(fā)酵劑發(fā)酵所得樣品共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)119種，其中醇類物質(zhì)42種、醛類物質(zhì)18種、酯類物質(zhì)18種、酸類物質(zhì)14種、酮類物質(zhì)18種、烯烴類物質(zhì)2種、酚類物質(zhì)1種、呋喃類物質(zhì)2種及其他類化合物4種。由實(shí)驗(yàn)室的酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵的樣品1中檢出74種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醇類33種、醛類8種、酯類13種、酸類6種、酮類6種、烯類2種、酚類1種、呋喃類1種、其他化合物4種；由市售菌種發(fā)酵得到的樣品2中檢出99種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類31種、醛類16種、酯類14種、酸類12種、酮類17種、烯類2種、酚類1種、呋喃類2種、其他化合物4種。相對(duì)含量較高的物質(zhì)是醇類、醛類、酯類以及其他類化合物。樣品1中醇類物質(zhì)含量略高于樣品2，分別為39.22%和38.10%，占總體風(fēng)味成分的較大比例；醛類物質(zhì)在樣品2（28.62%）中含量高于樣品1（6.02%）；而樣品1（45.67%）中的酯類物質(zhì)的含量明顯高于樣品2（8.12%）；樣品2中酸類、酮類、呋喃類物質(zhì)含量分別為5.06%，7.4%和5.49%，均高于樣品1，其他類化合物含量相當(dāng)。

2.2 醇類化合物的比較和分析

醇類化合物是酵母通過糖分解代謝或脫羧反應(yīng)和氨基酸的脫氨基作用形成的代謝產(chǎn)物，該類物質(zhì)適宜濃度可襯托出酯香，促進(jìn)香氣的協(xié)調(diào)性[6]。由表1可知，從樣品1和樣品2中共檢出42種醇類物質(zhì)，由實(shí)驗(yàn)室的酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵的樣品1中醇類物質(zhì)含量比由市售菌種發(fā)酵的樣品2的含量高。前者檢出醇類物質(zhì)33種，含量39.22%，后者檢出31種，含量38.10%。其中，正己醇、(Z)-3-己烯-1-醇、(E)-2-己烯-1-醇、順式-5-乙烯基四氫-α,α, 5-三甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇等22種醇類均在2組樣品中檢出。苯乙醇是樣品1含量最高的醇類物質(zhì)，含量為19.71%，樣品2中含量?jī)H1.75%，苯乙醇是莽草酸衍生物，具有玫瑰花香、薔薇花香、香粉味[7]。芳樟醇是樣品2中含量最高的醇類，含量為10.13%，樣品1中含有3.16%，表現(xiàn)出較甜的玫瑰香，是綠茶、烏龍茶、紅茶等茶葉香氣中的重要成分。正己醇在2組樣品中含量分別為1.37%和1.76%，具有青草香，是茶葉中常檢測(cè)出的風(fēng)味物質(zhì)。異戊醇只在樣品1中檢測(cè)出，含量為3.69%，異戊醇具有蘋果白蘭地香氣，可能是酵母菌發(fā)酵所產(chǎn)生的風(fēng)味成分[8]。

2.3 酯類化合物的比較和分析

酯類物質(zhì)主要來源于乙醇發(fā)酵，具有水果香氣，是對(duì)樣品風(fēng)味有很大影響的一類呈發(fā)酵香味的化合物。試驗(yàn)中，樣品1中酯類物質(zhì)含量最高，為45.67%，明顯高于樣品2的8.12%。樣品1中檢出13種酯類，其中乙酸2-苯乙酯含量高達(dá)42.38%，其次為己酸乙酯，含量為1.82%；樣品2中檢出14種酯類，含量最高的是甲酸辛酯（2.03%），其次為乙酸2-苯乙酯（1.59%）。乙酸2-苯乙酯是樣品1的主要風(fēng)味成分，具有玫瑰花香、蜂蜜香，研究表明該成分是組成烏龍茶香氣的重要成分[9]，可見樣品1中酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵可以有效促進(jìn)該成分的產(chǎn)生。己酸乙酯具有青蘋果的香氣，只在樣品1中檢測(cè)出；甲酸辛酯具有較甜的水果香氣，但未有相關(guān)報(bào)道；乙酸己基酯、乙酸苯甲酯、水楊酸甲酯等一般存在于鮮茶葉或曬干的茶葉中，有研究表明乙酸苯甲酯是茉莉花茶香氣的重要成分[10]，這幾種成分均在樣品1中檢測(cè)出。

2.4 醛酮類化合物的比較和分析

醛酮類物質(zhì)可通過醇氧化形成，可為樣品提供水果香，但這類化合物不穩(wěn)定，會(huì)進(jìn)一步氧化成羧酸，使其含量降低[11]。研究表明，部分醛類、酮類物質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的香味有消極影響[12]。樣品1中檢出醛類8種，含量為6.08%，樣品2中檢出酮類17種，含量為28.62%。壬醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯甲醛共同存在于2組樣品中，這類化合物的風(fēng)味閾值一般較低，在2.0 μg/L左右，其中苯甲醛呈苦杏仁味、壬醛呈皂味、糠醛呈焦香味。芳香醛中苯乙醛的閾值（4 μg/L）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于苯甲醛（100～4 600 μg/L），因此對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)更大[13]。苯乙醛是樣品2的主要風(fēng)味成分，含量為11.89%，對(duì)樣品2的風(fēng)味有較大影響。酮類化合物含量較低，分別為0.52%和7.40%，其中樣品1中僅檢出6種，樣品2中檢出18種，只有5種是兩者共有。酮類風(fēng)味閾值一般較低，α-紫羅蘭酮的閾值為2.6 μg/L，具有花香、木香等風(fēng)味[14]，是茶葉中常見的風(fēng)味成分，在2組樣品中均檢出，含量分別為0.11%和0.23%。結(jié)果表明，樣品1中醛酮類物質(zhì)種類和含量均低于樣品2。

2.5 酸類化合物的比較和分析

酸類物質(zhì)大部分是由酵母或乳酸菌發(fā)酵的副產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)，酸類物質(zhì)含量在合適范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的感官品質(zhì)有積極貢獻(xiàn)，濃度太高時(shí)會(huì)產(chǎn)生酸澀味和腐臭味[15]。其可與醇類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成酯類，使產(chǎn)品香氣更加協(xié)調(diào)、平衡[16]。樣品1和樣品2中分別檢出6種和12種酸類，其中4種為共有，分別為2-乙基己酸、辛酸、壬酸、十二酸。辛酸具有奶酪味、腐敗味和澀味，壬酸具有淡的脂肪和椰子香氣，十二酸微有月桂油的氣味，這些酸類成分會(huì)產(chǎn)生不愉快的氣味。同時(shí)，從樣品2中檢出0.45%的乙酸，乙酸具有較刺激的酸味，通過對(duì)2個(gè)樣品組進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，能明顯感受到樣品2具有較為刺激的酸澀味。

2.6 烯烴類、酚類、呋喃類以及其他類化合物的比較和分析

烯烴類化合物風(fēng)味閾值較高，對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。酚類化合物濃度較高時(shí)可賦予產(chǎn)品類似藥的香氣。2組樣品均只檢出2, 4-二叔丁基苯酚一種酚類物質(zhì)，且含量均較低。呋喃類化合物具有燒焦、甜的氣味，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味有一定消極影響，樣品1中僅檢出反式芳樟醇氧化物（呋喃類）1種，樣品2中檢出反式芳樟醇氧化物（呋喃類）和2, 3-二氫苯并呋喃2種。在2組樣品中還檢出4種其他類化合物，兩者含量相當(dāng)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用SPME-GC-MS法對(duì)不同菌種發(fā)酵的茶食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。由酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵的樣品1中檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)74種，包括醇類33種、醛類8種、酯類13種、酸類6種、酮類6種、烯類2種、酚類1種、呋喃類1種、其他化合物4種；由市售菌種發(fā)酵得到的樣品2中檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)99種，其中醇類31種、醛類16種、酯類14種、酸類12種、酮類17種、烯類2種、酚類1種、呋喃類2種、其他4種。樣品1中醇類物質(zhì)和酯類物質(zhì)的含量高于樣品2，占總體風(fēng)味成分的絕大比例；樣品2中醛類、酸類、酮類、呋喃類物質(zhì)含量高于樣品1，其他類化合物含量相當(dāng)。樣品1中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是苯乙醇、異戊醇、芳樟醇、乙酸2-苯乙酯、2, 4-二甲基苯甲醛等，這類物質(zhì)為樣品1提供豐富且宜人風(fēng)味，由酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵使樣品1中醛酮類、酸類、呋喃類等對(duì)風(fēng)味有消極影響的風(fēng)味成分減少。對(duì)比樣品2，其主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是芳樟醇、香葉醇、苯乙醛、(E)-2-己烯醛、苯甲醛、甲酸辛酯等，醛酮類、酸類物質(zhì)較多，不愉快風(fēng)味增加。