不同膠原肽對光損傷皮膚細(xì)胞的修復(fù)作用

劉爽，劉愛青,2，王佳，閆征

1.北京盛美諾生物技術(shù)有限公司（北京 100062）；2.安徽盛美諾生物技術(shù)有限公司（淮北 235000）

膠原蛋白是動物結(jié)締組織的重要組成成分，占動物總蛋白含量的25%～30%，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，人體內(nèi)含有20余種膠原蛋白[1]。膠原蛋白肽作為一種功能性食品原料，在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用[2]，其是以動物的皮、骨為原料通過酶解技術(shù)制備的小分子物質(zhì)。隨著人們對膠原蛋白肽市場的認(rèn)知深度增加，特殊的肽段也越來越受市場關(guān)注，尤其是膠原三肽。膠原三肽是由大分子膠原經(jīng)過酶解得到的由3個氨基酸組成的小肽。膠原三肽的氨基酸組成為Gly-X-Y，其中X的位置通常是脯氨酸（Pro），Y通常為羥脯氨酸（Hyp）和羥賴氨酸（Hyl），后兩種氨基酸在其他蛋白質(zhì)中很少見[3]。理論上膠原蛋白含有至少400個三肽序列，含量超過1%的僅24種，其中Gly-Pro-Hyp含量最為豐富[3]。

在功效方面，膠原三肽對皮膚的生長、修復(fù)具有重要的促進(jìn)作用[4-6]，以及具有抗氧化作用[7]等。Choi等[8-9]報(bào)道膠原三肽可提高人體皮膚的彈性和含水量；成靜等[10]報(bào)道膠原三肽可抑制黑色素的形成；Hee-Bong等[11]報(bào)道膠原三肽可抑制光老化引起的皺紋的形成，證明膠原三肽具有作為抗光老化劑的潛力。光損傷也是較受關(guān)注的皮膚問題，其表現(xiàn)為皮膚暴露部位粗糙、皺紋加深加粗、不規(guī)則性色素沉著、真皮彈性纖維變性及降解產(chǎn)物蓄積等，紫外線的照射會使皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白合成減少，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷[12]。人皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚真皮層中主要細(xì)胞，不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性蛋白以及多種細(xì)胞修復(fù)因子，從而修復(fù)老化皮膚[13-14]。關(guān)于膠原蛋白肽對皮膚光老化的修復(fù)報(bào)道較多[15-16]，但膠原三肽在該方面的研究較少，試驗(yàn)主要研究膠原三肽對光損傷皮膚細(xì)胞的修復(fù)作用，并對比普通膠原蛋白肽對皮膚成纖維細(xì)胞的修復(fù)差異，以及不同工藝產(chǎn)品的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑及耗材

DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技）；DMEM/F-12培養(yǎng)架（賽默飛世爾科技）；0.25%胰酶（賽默飛世爾科技）；青鏈霉素混合液（賽默飛世爾科技）；磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾科技）；胎牛血清（賽默飛世爾科技）；蛋白酶抑制劑（上海羅氏制藥有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（康寧公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（康寧公司）；Anti-MMP1抗體[EP1247Y]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-MMP13抗體[EP1263Y]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-Collagen I抗體[EPR7785]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-COL3A1（E8D7R），Cell Signaling Technology；Anti-Elastin抗體[EPR20603]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Anti-GAPDH抗體[EPR16891]，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；Goat anti Mouse antibody（北京康為生物科技有限公司）；Goat anti Rabbit antibody（北京康為生物科技有限公司）；NC膜（0.45 μm孔徑Millipore，默克生物）；ECL Millipore（默克生物）；甲醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛血清白蛋白Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；丙烯酰胺Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；過硫酸銨Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；吐溫-20 Amresco（北京伊諾凱科技有限公司）；N, N,N′, N′-四甲基乙二胺（賽默飛世爾科技）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物）；羥脯氨酸檢測試劑盒，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；透明質(zhì)酸檢測試劑盒（R & D Systems）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD Biosciences）。

1.1.2 主要試驗(yàn)與儀器

低溫冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技）；電泳槽，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；電泳儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技）；濕轉(zhuǎn)電泳槽，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；水平脫色搖床（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技）；UV輻照系統(tǒng)（法國VILBER LOURMAT公司）；倒置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)）；流式細(xì)胞儀CytoFlex（貝克曼庫爾特生命科學(xué)事業(yè)部）。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)試驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞（Human skin fibroblast，HSF）常規(guī)培養(yǎng)

將HSF細(xì)胞在10 cm皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度至80%融合度時吸棄上清液，加入2 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞；消化完成后加入等體積完全培養(yǎng)基（10% FBS的DMEM+雙抗）中和胰酶，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，按1 500 r/min室溫離心5 min；棄上清液后加入2 mL新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸取200 μL加入新10 cm培養(yǎng)皿中；加入10 mL新鮮完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度至80%時再次進(jìn)行傳代或鋪板。

1.2.2 多肽處理建模

將1#膠原三肽（市購，平均分子量約800 Da）、2#膠原三肽（市購，平均分子量約500 Da）、1#膠原蛋白肽（市購，平均分子量約2 000 Da）、2#膠原蛋白肽（市購，平均分子量約2 000 Da）分別稀釋至10，50，100，500和1 000 mg/L不同的質(zhì)量濃度；將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞使用0.25%胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為80%～90%；將肽按照5個不同濃度加入細(xì)胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)；在加入肽處理后第1～第5天分別收集細(xì)胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖曲線。

1.2.3 UVB處理建模

將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為80%～90%；在100和200 mJ/cm2的UVB照射下處理細(xì)胞；在UVB后第1～第5天分別收集細(xì)胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 CCK8評估UBV處理?xiàng)l件下不同多肽就細(xì)胞增殖的影響

將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細(xì)胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細(xì)胞；在加入多肽處理后第1～第5天分別收集細(xì)胞，加入10 μL CCK8溶液，避光孵育2 h；測定450 nm波長處吸光度，并根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測

將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細(xì)胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細(xì)胞；處理完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用胰酶消化細(xì)胞，按1 500 r/min室溫離心5 min，收集細(xì)胞；使用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞2次，按1 500 r/min離心5 min洗滌細(xì)胞；每管加入300 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞；每管加入5 μL Annexin V-FITC，混勻細(xì)胞，室溫避光染色20 min；每管加入5 μL PI，室溫避光染色5 min；每管補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer，輕輕混勻后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

將處于對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞使用胰酶消化后鋪至12孔板中，過夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率為80%～90%；將4種肽按照50，100和500 mg/L加入細(xì)胞上清液，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)18 h；在200 mJ/cm2的UVB照射下處理細(xì)胞；處理完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集不同處理組細(xì)胞上清液培養(yǎng)基；將上清液在4 ℃條件下按1 500 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；使用ELISA試劑盒檢測透明質(zhì)酸和羥脯氨酸含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 Western Blotting檢測HSF細(xì)胞中蛋白表達(dá)

1.3.1 蛋白提取

將不同處理組和對照HSF細(xì)胞使用胰酶消化后收集。棄上清液后在細(xì)胞沉淀中加入500 μL細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹懸細(xì)胞沉淀后冰上放置30 min，按12 000 r/min離心15 min。離心完成后取上清液作為待測樣品。

1.3.2 BCA蛋白定量和樣品制備

將待測樣本溶于稀釋緩沖溶液中，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。定量完成后使用蛋白裂解液調(diào)整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液，將樣品終質(zhì)量濃度定為1 mg/mL。將加入緩沖液的樣品煮沸10 min進(jìn)行蛋白變性，煮沸后的樣品在4 ℃以10 000 r/min離心30 s后備用。

1.3.3 蛋白表達(dá)量檢測

根據(jù)目的蛋白分子量，配制10%或12%分離膠及5%濃縮膠；將待檢測蛋白樣品加入上樣孔，每孔上樣量約20 μg；上樣完成后進(jìn)行電泳，濃縮膠恒壓90 V電泳約20 min。分離膠恒壓160 V電泳約90 min，通過預(yù)染蛋白Marker和Loading buffer上樣緩沖液停止電泳；電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)模，在300 mA恒流冰浴轉(zhuǎn)膜1 h；轉(zhuǎn)膜完成后5% BSA室溫輕搖45 min進(jìn)行封閉減少非特異雜交；使用1% BSA-TBST稀釋一抗，具體一抗稀釋度見抗體說明書進(jìn)行優(yōu)化。加入一抗后在4℃孵育過夜；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；使用1% BSA-TBST稀釋二抗，二抗稀釋度1∶10 000，加入二抗后室溫輕搖60 min；一抗孵育完成后使用TBST洗膜6次，快洗3次后慢洗3次，每次3 min；二抗孵育完成后將ECL發(fā)光液加到膜上，室溫反應(yīng)3 min。使用膠片曝光10 s～3 min，顯影2 min后進(jìn)行定影。

2 結(jié)果及分析

2.1 CCK-8評估膠原肽對UVB處理?xiàng)l件細(xì)胞增殖和活力的影響

從圖1可以看出，與UVB處理組相比，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進(jìn)光輻照后的細(xì)胞增殖，且呈一定劑量相關(guān)性，其中2#膠原三肽的效果最好，之后依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。2#膠原三肽試驗(yàn)第5天細(xì)胞水平可與達(dá)到未處理組一致，與UVB組差異極顯著（P＜0.001）。

圖1 膠原肽對UVB處理后細(xì)胞增殖和活力的影響

2.2 流式細(xì)胞術(shù)評估膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下細(xì)胞凋亡比例

從圖2可以看出，UVB處理后細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加。膠原三肽組、膠原蛋白肽組均減低細(xì)胞凋亡數(shù)量，且呈一定劑量相關(guān)性，其中2#膠原三肽的效果最好，之后依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)評估膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下細(xì)胞凋亡比例

2.3 膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下透明質(zhì)酸含量的影響

從圖3可以看出，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進(jìn)光輻照損傷成纖維細(xì)胞生成透明質(zhì)酸，且呈一定劑量相關(guān)性，其中2#膠原三肽的效果最好，與UVB處理組相比差異顯著（P＜0.01）。

2.4 膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下羥脯氨酸含量的影響

從圖4可以看出，膠原三肽組、膠原蛋白肽組均可促進(jìn)光輻照損傷成纖維細(xì)胞生成羥脯氨酸，且呈一定的劑量相關(guān)性，效果最好的為2#膠原三肽，其次依次為1#膠原三肽、2#膠原蛋白肽、1#膠原蛋白肽。

圖4 ELISA評估膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下羥脯氨酸含量的影響

圖5 Western blot檢測膠原三肽對UVB處理?xiàng)l件下蛋白表達(dá)的影響

圖6 Western blot檢測膠原蛋白肽對UVB處理?xiàng)l件下蛋白表達(dá)的影響

2.5 Western blot檢測膠原肽對UVB處理?xiàng)l件下蛋白表達(dá)的影響

Western Blot檢測蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)膠，原蛋白肽、膠原三肽均有降低MMP-1、MMP-13及提高COL1a1、COL1a2、原彈性蛋白mRNA的趨勢。其中，MMP-1和MMP-13是降解動物體內(nèi)膠原蛋白的酶，降低其活性，即可減少人體膠原蛋白的流失[17]。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)通過UVB處理建模，對比不同膠原肽對人皮膚成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，膠原三肽及膠原蛋白肽對UVB處理后的人皮膚成纖維細(xì)胞均具有一定的修復(fù)作用，且呈一定劑量相關(guān)性，其中效果顯著的依次性為2#膠原三肽＞1#膠原三肽＞2#膠原蛋白肽＞1#膠原蛋白肽。ELISA檢測透明質(zhì)酸和羥脯氨酸的含量顯示，膠原三肽、膠原蛋白肽均可以修復(fù)UVB損傷后人皮膚成纖維細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)的能力，且呈一定劑量相關(guān)性，其中效果顯著的依次性為2#膠原三肽＞1#膠原三肽＞2#膠原蛋白肽＞1#膠原蛋白肽。Western Blot檢測蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，膠原三肽、膠原蛋白肽均有降低MMP-1、MMP-13以及提高COL1a1、COL1a2、原彈性蛋白mRNA的趨勢。結(jié)果說明，膠原肽對光老化人皮膚成纖維細(xì)胞具有一定修復(fù)作用，其中膠原三肽的效果優(yōu)于普通的膠原蛋白肽。

從分子量角度看，試驗(yàn)組膠原三肽組的平均分子量均小于膠原蛋白肽組平均分子量，這可能是影響其發(fā)揮修復(fù)作用的原因之一，張寧等[18]研究不同分子量的膠原蛋白肽在動物體內(nèi)吸收過程，其證明分子量越小，吸收速率越快。從結(jié)構(gòu)來看，膠原三肽組的三肽含量高于膠原蛋白肽組，三肽透皮吸收性較強(qiáng)，研究表明三肽可促使成纖維細(xì)胞的增殖活性，修復(fù)受損組織，即可高效率地促進(jìn)皮膚透明質(zhì)酸及膠原蛋白的生成，以實(shí)現(xiàn)抗皺、保濕、抗老化、修復(fù)等功效[19-21]，Kim[22]利用無毛小鼠驗(yàn)證膠原三肽具有抗光老化的作用。

對膠原三肽的功效近兩年已有多項(xiàng)研究報(bào)道，如：Han等[23]研究了膠原三肽對UVB下光老化損傷的抑制作用；Saito-Takatsuji等[24]研究了膠原三肽對細(xì)胞的保護(hù)作用；金載桓等[25]將其應(yīng)用于食品或化妝品中，來改善免疫力和皮膚狀態(tài)。膠原三肽在功能性食品中領(lǐng)域也有了越來越多的應(yīng)用案例，其市場售價高于普通膠原蛋白肽，但是關(guān)于該成分的機(jī)理研究還較少，與普通膠原蛋白肽的功效對比研究也較少，所以為將其更好、更精確地應(yīng)用到功能性食品中，可以考慮多針對其機(jī)理及具體肽段對機(jī)體的具體作用進(jìn)行更深刻的探討研究，包括皮膚、骨骼、關(guān)節(jié)等方面的應(yīng)用研究，為市場新品的開發(fā)提供更完善的理論依據(jù)。