不同分子量的透明質(zhì)酸鈉及其組合物對酒精性胃黏膜損傷的保護作用

王猛，馮曉毅，宋永民，郭學(xué)平*

華熙生物科技股份有限公司（濟南 250000）

胃是消化系統(tǒng)重要組成部分，在營養(yǎng)吸收中起關(guān)鍵作用，胃病的發(fā)生常與胃黏膜損傷密切相關(guān)[1]。胃黏膜受到外界因素侵害時，黏膜上皮會發(fā)生損傷和再生，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜功能受損。酗酒、高壓力、幽門螺旋桿菌感染、急性/慢性胃炎、長期使用非甾體抗炎藥等[1]都會導(dǎo)致胃黏膜損傷。研究表明，乙醇直接接觸胃黏膜會造成損傷，30 min時開始出現(xiàn)，60 min出現(xiàn)高峰，且呈劑量關(guān)系[2]。

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種人體內(nèi)本身存在的生物活性物質(zhì)，主要以透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）的形式廣泛存在于皮膚、關(guān)節(jié)、眼睛等組織器官中，起補水保濕[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]等作用。研究報道，HA在口腔黏膜、皮膚黏膜、胃黏膜、膀胱黏膜具有良好的輔助保護作用[6-8]。正常情況下，黏膜組織是抵御細(xì)菌入侵和傳播的有效屏障；在屏障被破壞時，具有宏觀聚集活性的HA分子可以幫助重建該屏障[9]。因此，HA被認(rèn)為是最具有前景的生物活性物質(zhì)之一[10]，在2020年，被國家衛(wèi)健委列入新食品原料類目中，可添加到普通食品中。劉磊等[10]報道1 000 kDa的HA對不同致病因素導(dǎo)致的大鼠胃黏膜損傷均有輔助保護作用，能夠減少損傷面積，改善組織病理變化。Al-Bayaty等[11]研究表明含有240 mg/100 g的高分子量HA凝膠具有更好的輔助保護作用，但具體分子量不明。

因此，為進一步考察透明質(zhì)酸鈉對胃黏膜的輔助保護作用，探究不同分子量透明質(zhì)酸鈉對胃黏膜輔助保護效果，在此基礎(chǔ)上，分別與維生素C、羅伊氏乳桿菌組合，通過建立酒精性胃黏膜損傷大鼠模型并進行口服干預(yù)研究，為HA及其組合物在胃黏膜保護領(lǐng)域研究及食品開發(fā)提供新思路和科學(xué)參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試劑

SPF級SD雄性大鼠，6～7周齡，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號SCXK（魯）20190003；動物飼養(yǎng)和處理遵循中國實驗動物科學(xué)協(xié)會實驗動物福利和倫理委員會規(guī)定。

SH（平均分子量分別為400 kDa和2 190 kDa，華熙生物科技股份有限公司）；維生素C（Vitamin C，VC，河南天得商貿(mào)有限公司）；滅活羅伊氏乳桿菌DSM17648[Lactobacillus reuteri，LR，諾維信（中國）生物有限公司]。

1.2 試驗儀器

LE203E-02電子天平[精度0.1 mg，梅特勒-托利多（上海）有限公司]；Tissue-TekRVIPR6全封閉組織脫水機（日本櫻花公司）；NP-B生物組織包埋機（湖北諾普醫(yī)療器械有限公司）；RM2235切片機（德國Leica公司）；尼康E100生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)與分組

SPF級大鼠喂養(yǎng)于山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評價中心，溫度維持在20～26 ℃，日溫差≤4 ℃；濕度40%～70%；晝夜明暗交替時間12 h/12 h；期間大鼠自由進食飲水。5 d適應(yīng)期結(jié)束后，根據(jù)體重隨機分組，每組10只，體重約190～225 g，按體重隨機分組，每組2籠共10只，分別在頭、頸、背、尾、左前腿位置處標(biāo)識。

國家衛(wèi)健委2020年第9號公告顯示，新食品原料HA人體推薦食用量≤200 mg/d（約合3.33 mg/kg），參考《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中“保健食品功能評價的基本要求”和《輔助保護胃黏膜檢驗方法》關(guān)于受試樣品劑量和時間的要求。每日灌胃1次，連續(xù)30 d，模型組、對照組給予純水。試驗劑量設(shè)計見表1。

表1 劑量分組表

1.3.2 酒精性胃黏膜損傷模型建立

每天經(jīng)口給予0.5 mL/100 g受試樣品，模型組、對照組同時給予等體積的純水，定期稱量體重。于末次給藥后24 h禁食不禁水。所有受試動物灌胃給予1.0 mL/只無水乙醇，并在1 h后處死，暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10%甲醛溶液，固定20 min后沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物，展開胃黏膜，并用游標(biāo)卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度，作胃黏膜損傷評分。

1.3.3 肉眼觀察評定

胃黏膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷積分指數(shù)和損傷抑制率表示，按式（1）～（4）計算，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酒精性胃黏膜損傷肉眼觀察評分標(biāo)準(zhǔn)

式中：因?qū)挾人頁p傷的嚴(yán)重性高于長度，故雙倍積分。

1.3.4 病理組織學(xué)觀察及評分

切下每只動物胃黏膜中損傷最嚴(yán)重的部位，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)制片，經(jīng)HE染色，觀察包括黏膜全層的區(qū)域。

以充血、出血、黏膜細(xì)胞變性壞死在整個黏膜上皮層的累及程度為標(biāo)準(zhǔn)，將損傷分為5級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3，病變總積分按式（5）計算，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 酒精性胃黏膜損傷鏡下評分標(biāo)準(zhǔn)

病變總積分=充血積分+出血積分×2+上皮細(xì)胞變性壞死積分×3 （5）

1.3.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（ANOVA）或T檢驗，評分資料采用秩和檢驗（Mann-Whitney U檢驗），P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 試驗結(jié)果

2.1 SH及組合物對大鼠體重的影響

由表4可知在4周的試驗周期內(nèi)，各組大鼠之間體重穩(wěn)定增長且無顯著差異，外觀體征和活動未見異常，不存在生病中毒死亡個例現(xiàn)象?？诜H及組合物對大鼠安全。

表4 4周內(nèi)受試物對大鼠體重的影響

2.2 SH及組合物對酒精性胃黏膜損傷觀察評分

如表5和圖1所示，與正常組相比，各試驗組的大鼠胃黏膜損傷發(fā)生率為100%，均產(chǎn)生酒精性胃黏膜損傷，出血點及出血帶明顯，滿足建模要求。受試物的口服干預(yù)，對胃黏膜酒精性損傷有不同的抑制效果，體現(xiàn)為損傷積分降低，出血點、出血帶有不同程度減少；HSH組的損傷抑制效果要優(yōu)于LSH組，損傷積分為31.9±12.4，與模型組存在極顯著差異，說明高分子量SH的保護作用強于低分子量SH，這與Al-Bayaty研究趨勢一致[11]。HSH-VC組和HSH-LR組皆對酒精性胃黏膜損傷有顯著保護作用，其中SH與VC復(fù)配的HSH-VC組保護效果最強，損傷抑制率達42.7%。

圖1 SH及組合物對酒精性胃黏膜損傷外觀觀察

表5 SH及組合物對酒精性胃黏膜損傷大體觀察結(jié)果

2.3 SH及組合物對酒精性胃黏膜損傷病理觀察

在圖2可以看出：大鼠胃黏膜組織的HE病理結(jié)果趨勢與外觀觀察趨勢一致；與模型組相比，各試驗組的病變總積分均降低，說明SH及組合物均對胃黏膜具有預(yù)防保護作用；其中，HSH-VC組病變積分最低，輔助保護效果最優(yōu)，與模型組呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 SH及組合物對酒精性胃黏膜損傷病理觀察結(jié)果

如圖3所示：健康大鼠的胃黏膜F組組織呈光滑細(xì)膩狀，色澤正常，細(xì)胞排列明顯有序，不存在出血現(xiàn)象；模型組E組出現(xiàn)充血、出血現(xiàn)象，細(xì)胞排列疏散，黏膜細(xì)胞腫脹，這在劉磊等[10]研究中得到印證；試驗組（A～D）經(jīng)過口服干預(yù)后，組織形態(tài)整體色澤趨于正常，出血現(xiàn)象減輕，與LSH組（A）相比，HSH組、HSH-VC組與HSH-LR組的黏膜組織損傷減輕，說明高分子量SH的輔助保護作用強于低分子量SH；結(jié)合圖2病變積分結(jié)果，HSH-VC的損傷積分最低，具有更好的胃黏膜輔助保護作用。

圖3 SH及復(fù)配物對酒精性胃黏膜損傷HE切片觀察

3 討論

乙醇致胃黏膜損傷包括直接損傷和其代謝產(chǎn)物造成的損傷。乙醇是一種有機溶劑，與水互溶，會破壞胃黏膜的黏液層，打破胃黏膜屏障正常生理平衡，損傷黏液細(xì)胞；乙醇在代謝過程中產(chǎn)生的乙醛，會使蛋白質(zhì)變性，加劇胃黏膜損傷，甚至增大胃癌的發(fā)生率。胃黏膜上皮和血管內(nèi)皮損傷產(chǎn)生的炎性介質(zhì)可以導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生大量活性氧，高度富集的活性氧降低抗氧化酶活性，抑制胃潰瘍愈合，從而加劇損傷[7,14]。

一方面，高分子量的透明質(zhì)酸會降低胃運動，通過使胃褶皺變平，建立一個機械屏障，形成保護層，減小乙醇刺激的胃黏膜收縮壓力；限制活性氧中間體進入細(xì)胞表面，減少DNA損傷，NF-kB和半胱天冬酶激活[11]，達到預(yù)防保護作用。另一方面，在黏膜組織潰瘍愈合的關(guān)鍵過程中，HA可參與調(diào)控上皮細(xì)胞分化、促進上皮細(xì)胞形成和黏膜水化[15]；HA分子中的羥基官能團能與乙醇產(chǎn)生的活性氧（超氧陰離子）和自由基結(jié)合，達到清除目的。

組合物中的VC是一種水溶性抗氧化劑，能夠與HA協(xié)同清除活性氧、自由基，降低胃丙二醛含量[16]，阻礙1-羥乙基的形成[17]。減少胃黏膜中的脂質(zhì)過氧化，從而保護胃微循環(huán)。VC刺激胃上皮細(xì)胞中抗氧化劑和血管擴張劑血紅素加氧酶的表達，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶[18]的表達，一氧化氮可以影響肌肉張力及外分泌和內(nèi)分泌功能[19]。同時VC可參與抗體和膠原的形成，促進損傷后的愈合和維持正常的細(xì)胞生長、復(fù)制過程和神經(jīng)再支配作用[20]。羅伊氏乳桿菌是一種耐胃酸、對黏膜存在很強黏附性的乳酸桿菌。研究表明，羅伊氏乳桿菌可以在胃腸道中定植[21]，參與免疫反應(yīng)，降低瞬時電位感受器香草醛受體1染色強度，恢復(fù)胃黏膜抗氧化參數(shù)（谷胱甘肽、超氧化物歧化酶）的正常水平[13]，在體內(nèi)外均能抑制幽門螺桿菌。

4 結(jié)論

試驗通過口服SH及SH組合物對乙醇誘導(dǎo)的急性胃黏膜損傷大鼠進行干預(yù)，結(jié)果表明高分子量SH及組合組均具有胃黏膜輔助保護作用，其中HSH-VC保護作用更為顯著，可以更好地改善胃黏膜組織形態(tài)，減緩損傷程度。試驗結(jié)果可為SH在胃黏膜保護領(lǐng)域的食品、藥品開發(fā)提供新的思路和依據(jù)，但其對胃黏膜保護的作用機理仍需進一步探究。