香菇菜中多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究

謝桂勉*，楊培新，黃瑩星，陳一村，鄭佳琳

1.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系（揭陽 522000）；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院（汕頭 515041）；3.廣東好菇婆食品有限公司（揭陽 515300）

香菇菜是以香菇柄為原料，經(jīng)清洗、浸泡、壓榨、打絲、高溫炒制（約120 ℃）、灌裝加工而成的一道風(fēng)味獨(dú)特的潮汕佐餐小菜。香菇具有良好的食用價(jià)值和保健價(jià)值[1-4]，香菇柄作為加工香菇的副產(chǎn)品，其營養(yǎng)成分及生物活性成分不亞于菌蓋部分。研究表明香菇柄中含38.70%膳食纖維、24.80%碳水化合物、19.20%蛋白質(zhì)、0.35%脂肪、4.80%灰分，同時(shí)含有維生素B1、B2、C等維生素，蘇氨酸、谷氨酸等氨基酸，F(xiàn)e、Ca、Mg、Zn、Cu、Mn、K等多種微量元素，其中Fe、K、Ca、Zn含量高于菌蓋[5-7]。香菇柄還含有多糖、多酚、黃酮類物質(zhì)和萜類物質(zhì)[8-9]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗突變、免疫調(diào)節(jié)、抑菌等作用[10-11]，對人體健康非常有益，被加工成香菇醬、香菇柄松、香菇菜等制品。相對香菇多糖的提取及生物活性[12-15]研究，香菇柄多糖提取及抗氧化活性[16-18]研究報(bào)道較少，而香菇柄加工制品中多糖的提取及加工方式對多糖抗氧化活性和結(jié)構(gòu)的影響未見報(bào)道。試驗(yàn)通過樣品前處理、單因素試驗(yàn)、響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)、抗氧化活性評價(jià)及紅外光譜表征研究香菇柄制品中多糖的提取工藝及香菇菜高溫炒制加工方式對功能活性的影響，為加工制品中多糖的提取及有效活性評價(jià)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

香菇柄（西峽縣大鵬菇業(yè)有限公司）；香菇菜（廣東好菇婆食品有限公司）；1 000 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（phygene公司）；DPPH自由基、羥自由基、ABTS自由基清除試劑盒（南京建成生物工程研究所）；重蒸酚（上海吉至生化科技有限公司）；維生素C（上海吉至生化科技有限公司）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；KM-500DE超聲波清洗儀（昆山美美超聲儀器有限公司）；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國賽默飛）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；IRSpirit紅外光譜儀（日本島津）；H1850高速臺式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

香菇菜因加工工藝含有較大量植物油，同時(shí)經(jīng)過高溫炒制，制品顏色較深，需經(jīng)過脫色脫油處理。稱取適量香菇菜，加入適量乙醇與蒸餾水（9∶1，V/V）溶液，加熱回流脫色脫油，干燥備用（細(xì)絲索狀）。食用菌多糖已報(bào)道的提取方法包括酶提取法、超聲波提取法、微波提取法、亞臨界水萃取法、酶-微波-超聲提取法等[19-24]。試驗(yàn)采用超聲波提取法，取適量干燥香菇菜，按超聲波時(shí)間45 min、液料比40∶1 mL/g、超聲波功率300 W、超聲波溫度60 ℃進(jìn)行超聲波提取，離心取上清液，減壓濃縮，醇沉，冷凍干燥即得香菇菜粗多糖。

1.3.2 香菇菜中多糖含量測定

參照苯酚-硫酸法[25]測定多糖濃度，以A490nm為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A490nm與葡萄糖質(zhì)量濃度關(guān)系的線性方程：y=0.014 9x-0.029 6，R2=0.999 2。多糖提取得率按式（1）計(jì)算。

式中：C為粗多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V為粗多糖提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.3 香菇菜中多糖提取單因素試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定超聲波時(shí)間、液料比、超聲波功率、超聲波溫度為香菇菜多糖提取主要因素。以超聲波時(shí)間45 min、液料比40∶1 mL/g、超聲波功率300 W、超聲波溫度60 ℃為基礎(chǔ)條件，控制基礎(chǔ)工藝其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察超聲波時(shí)間、液料比、超聲波功率、超聲波溫度對香菇菜中多糖提取的影響。

驅(qū)動(dòng)模塊設(shè)計(jì)以直流電機(jī)和舵機(jī)為主，直流電機(jī)控制容易，舵機(jī)容易提供更大的扭力。相對于不同的障礙應(yīng)選不同的電機(jī)和裝配方式。通常情況下，六電機(jī)、[1]六輪式機(jī)器人具有越障能力高、承載能力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)和控制簡單、轉(zhuǎn)向靈活、工作效率高等優(yōu)勢。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化香菇菜中多糖超聲波提取工藝

采用Box-Behnken模型[26-27]，對超聲波時(shí)間（A）、液料比（B）、超聲波溫度（C）和超聲波功率（D）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)自變量因素水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)自變量因素水平表

1.3.5 香菇菜中多糖抗氧化能力分析

配制合適濃度的香菇菜多糖溶液，不同濃度多糖的對二苯代苦味酰基（DPPH）自由基、羥自由基和2, 2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基的清除能力分別用南京建成生物工程研究所的測試盒方法進(jìn)行檢測。結(jié)果用Origin Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值。各自由基清除能力按式（2）～（4）計(jì)算。

1.3.6 香菇菜中多糖紅外分析[28]

取1 mg多糖樣品和100 mg KBr粉末混合，在紅外燈下研磨均勻并壓片，用紅外光譜儀進(jìn)行檢測，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率16 cm-1，掃描10次。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對香菇菜中多糖提取得率的影響

固定超聲波時(shí)間45 min、超聲波功率300 W、超聲波溫度60 ℃，分析不同液料比（20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1 mL/g）對香菇菜中多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著提取液的增加，多糖提取得率呈上升趨勢，液料比50∶1 mL/g時(shí)得到最大提取得率。

圖1 液料比對香菇菜中多糖提取得率的影響

2.1.2 超聲波時(shí)間對香菇菜中多糖提取得率的影響

固定液料比40∶1 mL/g、超聲波功率300 W、超聲波溫度60 ℃，分析不同超聲波時(shí)間（15，30，45，60和75 min）對多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著提取時(shí)間的延長，多糖提取得率呈先上升后下降趨勢，提取時(shí)間60 min時(shí)，提取得率最高。

圖2 超聲波時(shí)間對香菇菜中多糖提取得率的影響

2.1.3 超聲波溫度對香菇菜中多糖提取得率的影響

固定液料比40∶1 mL/g、超聲波時(shí)間45 min、超聲波功率300 W，分析不同超聲波溫度（30，40，50，60和70 ℃）對多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖3所示。多糖提取得率隨溫度呈先上升后下降趨勢，溫度為50 ℃時(shí)，提取得率最高。

圖3 超聲波溫度對香菇菜中多糖提取得率的影響

2.1.4 超聲波功率對香菇菜中多糖提取得率的影響

固定液料比40∶1 mL/g、超聲波時(shí)間45 min、超聲波溫度60 ℃，分析不同超聲波功率（100，200，300，400和500 W）對多糖提取得率的影響，結(jié)果如圖4所示。多糖提取得率隨超聲波功率增加而提高，在功率400 W時(shí)達(dá)到提取得率最高。

圖4 超聲波功率對香菇菜中多糖提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以超聲波時(shí)間、液料比、超聲波功率、超聲波溫度4個(gè)因素為自變量，以香菇菜中多糖提取得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=3）

由Design-Expert 8.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，二次多項(xiàng)回歸方程為Y=6.14+0.15A-0.17B+0.20C+0.016D-0.050AB+0.23AC-0.13AD+0.16BC-0.052BD-0.25CD-0.66A2-0.41B2-0.60C2-1.03D2。根據(jù)回歸模型方差分析結(jié)果（表3）可知，模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.064 9＞0.05），確定系數(shù)R2=0.993 5，校正系數(shù)Radj2=0.987 5，說明該模型對試驗(yàn)擬合度好，可對香菇菜中多糖提取得率進(jìn)行分析、預(yù)測。因素A、B、C差異極顯著（P＜0.01），D不顯著（P=0.461 2＞0.05）。根據(jù)F值，各因素對香菇菜中多糖提取得率的影響主次順序?yàn)槌暡囟龋疽毫媳龋境暡〞r(shí)間＞超聲波功率。因素A2、B2、C2、D2、AC、AD、BC、CD對提取率均有極顯著的影響（P＜0.01），因素AB、BD對提取得率的影響不顯著（P＞0.05）。兩因素交互作用如圖5所示，各因素對多糖得率呈拋物線，兩兩之間均存在交互作用，有最大值存在[29]。

圖5 試驗(yàn)因素間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

表3 回歸模型方差分析

通過響應(yīng)面法優(yōu)化后的最佳工藝為超聲波時(shí)間62.32 min、液料48.21∶1 mL/g、超聲波溫度51.75℃、超聲波功率398.15 W，此時(shí)預(yù)測提取得率理論值為6.19%。為方便實(shí)際操作，選擇最優(yōu)工藝條件：超聲波時(shí)間60 min、液料比50∶1 mL/g、超聲波溫度50℃、超聲波功率400 W。根據(jù)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），得到的平均提取得率為6.18%，驗(yàn)證值與理論值非常接近，說明模型預(yù)測效果良好。

2.3 香菇菜中多糖抗氧化活性分析

2.3.1 香菇菜中多糖對DPPH自由基清除能力

由圖6可知，香菇菜中提取的多糖與香菇柄中提取的多糖對DPPH·清除能力基本一致，說明香菇菜的熱油炒制加工方式幾乎不影響多糖對DPPH·的清除能力。隨著香菇菜多糖濃度的增加，DPPH·清除能力逐漸增強(qiáng)。在0.031 25～1 mg/mL的多糖濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除率由9.35%上升到84.41%，半數(shù)效應(yīng)濃度EC50為0.57 mg/mL。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，兩者的清除能力均小于VC。

2.3.2 香菇菜中多糖對羥自由基清除能力

香菇菜中多糖對羥自由基（·OH）清除能力試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。香菇菜中多糖對·OH有較強(qiáng)的清除能力，隨濃度增加而增加，在0.125～2 mg/mL多糖范圍內(nèi)，·OH清除率由17.44%上升到92.29%，試驗(yàn)范圍內(nèi)最高可達(dá)93.61%，半數(shù)效應(yīng)濃度EC50為0.33 mg/mL。但清除能力總體弱于香菇柄中多糖和VC，說明高溫炒制加工方式可能影響多糖的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響多糖對羥自由基的清除能力，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

2.3.3 香菇菜中多糖對ABTS自由基清除能力

ABTS自由基（ABTS+·）在405 nm波長處有強(qiáng)吸收，清除劑存在時(shí)，吸收減弱或消失。試驗(yàn)結(jié)果表明，香菇菜中多糖對ABTS+·有一定清除能力（圖8），在0.25～4 mg/mL的多糖濃度范圍內(nèi)，清除率由5.32%上升到68.73%，半數(shù)效應(yīng)濃度EC50為1.35 mg/mL。總體上，香菇菜中多糖對ABTS自由基清除能力基本與香菇柄中多糖一致，兩者均弱于VC。前者在較高濃度和較低濃度時(shí)，清除能力稍弱于后者，說明香菇菜加工方式對多糖的ABTS自由基清除能力有一定影響。

圖8 多糖對ABTS自由基清除作用

2.4 香菇菜中多糖紅外分析

從香菇菜多糖的紅外光譜圖（圖9）可看出：3 212 cm-1處的吸收峰是多糖—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 631 cm-1處的吸收峰是多糖—OH的彎曲振動(dòng)吸收峰；2 909 cm-1和2 832 cm-1處C—H伸縮振動(dòng)吸收峰及1 425 cm-1和1 380 cm-1處C—H變角振動(dòng)吸收峰為香菇多糖的特征吸收峰，對應(yīng)β-糖苷鍵相關(guān)振動(dòng)；1 089 cm-1和1 037 cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)上的C—O—C和C—O—H伸縮振動(dòng)引起的，表明存在吡喃糖苷；892 cm-1處有明顯的β-糖苷鍵吸收峰，表明多糖存在β-糖苷鍵；在521，497和475 cm-1處的吸收峰是CCO變形振動(dòng)。

圖9 香菇菜中多糖紅外光譜圖

從香菇柄多糖的紅外光譜圖（圖10）可看出：3 219 cm-1處的吸收峰是多糖—OH的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 609 cm-1處的吸收峰是多糖—OH的彎曲振動(dòng)吸收峰；2 919 cm-1和2 852 cm-1處C—H伸縮振動(dòng)吸收峰及1 420 cm-1和1 375 cm-1處C—H變角振動(dòng)吸收峰為香菇多糖的特征吸收峰，對應(yīng)β-糖苷鍵相關(guān)振動(dòng)。1 082 cm-1，1 043 cm-1處的吸收峰是由糖環(huán)上的C—O—C和C—O—H伸縮振動(dòng)引起的，表明存在吡喃糖苷；893 cm-1處有明顯的β-糖苷鍵吸收峰，表明多糖存在β-糖苷鍵；在522 cm-1和479 cm-1處的吸收峰是CCO變形振動(dòng)。

圖10 香菇柄中多糖紅外光譜圖

可見香菇菜中提取的多糖與香菇柄中提取的多糖紅外光譜特征基本一致，說明香菇菜高溫炒制加工方式對多糖結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)影響較小。這與俞明君[30]的研究發(fā)現(xiàn)烹飪加工處理對香菇多糖的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)影響較小一致。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對香菇菜中多糖超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過DPPH·、·OH和ABTS+·清除試驗(yàn)評價(jià)多糖抗氧化能力，并采用紅外光譜法對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。經(jīng)Design-Expert軟件分析并結(jié)合實(shí)際情況，選擇液料比50∶1 mL/g、超聲波時(shí)間60 min、超聲波溫度50 ℃、超聲波功率400 W為最優(yōu)工藝，該條件下多糖提取得率為6.18%。自由基清除試驗(yàn)表明，多糖對DPPH·、·OH和ABTS+·這3種自由基均有較好的清除能力，EC50值分別為0.57，0.33和1.35 mg/mL。高溫炒制加工方式降低多糖對·OH清除能力，但對DPPH·、ABTS+·清除能力影響不大。經(jīng)紅外光譜鑒定，香菇菜中提取的多糖與香菇柄中提取的多糖紅外光譜特征基本一致，說明香菇菜加工方式對多糖結(jié)構(gòu)影響不大。試驗(yàn)為較復(fù)雜食品基質(zhì)中提取多糖并進(jìn)行抗氧化能力評價(jià)提供一定參考。