基于多組學探討川陳皮素調控脂質合成氧化逆轉胃癌順鉑耐藥的機制

申雋于，李懷志，陳夢麟，鄭姍姍，張粲粲，韓 博，吳 堅，孫慶敏

基于多組學探討川陳皮素調控脂質合成氧化逆轉胃癌順鉑耐藥的機制

申雋于1，李懷志1，陳夢麟1，鄭姍姍1，張粲粲1，韓 博1，吳 堅2*，孫慶敏2*

1. 南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029

運用脂質代謝組學和網絡藥理學尋找川陳皮素對胃癌順鉑耐藥細胞（AGS-DDP）的核心靶點，并結合細胞實驗進一步探究川陳皮素逆轉胃癌順鉑耐藥的機制。采用UPLC-Orbitrap質譜系統(tǒng)進行非靶向脂質組學分析。利用GENE Card、TCMSP數據庫挖掘川陳皮素和甘油磷脂代謝通路的潛在靶點，通過微生信在線作圖工具平臺整合二者的交集靶點，并進行基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，通過STRING數據庫繪制蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，運用Cytoscape軟件將川陳皮素的核心靶點可視化。川陳皮素給藥后，通過CCK-8法檢測AGS和AGS-DDP細胞的存活率；流式細胞術檢測AGS-DDP細胞的凋亡情況；劃痕實驗檢測AGS-DDP細胞的遷移能力；Western blotting檢測AGS-DDP細胞的B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）和三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）蛋白表達。AGS和AGS-DDP細胞通過脂質組學分析檢測得到31個亞類中的1450個差異的脂質化合物，主要富集在甘油磷脂代謝通路，對川陳皮素潛在靶點進行KEGG富集分析結果顯示川陳皮素具有逆轉鉑類耐藥的潛力。細胞實驗結果顯示，與對照組比較，川陳皮素劑量相關性地抑制AGS-DDP細胞的存活率（＜0.05、0.01），增加AGS-DDP細胞對順鉑的敏感性（＜0.05），且能誘導AGS-DDP細胞凋亡并抑制其遷移能力（＜0.05、0.01）。Western blotting實驗結果顯示川陳皮素組Bax、E-cadherin蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、ACLY和PPARγ蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。AGS和AGS-DDP細胞的差異脂質代謝產物主要富集在甘油磷脂代謝通路，川陳皮素通過調控脂質合成氧化關鍵基因抑制AGS-DDP細胞增殖、遷移，最終逆轉胃癌順鉑耐藥。

胃癌；川陳皮素；網絡藥理學；順鉑耐藥；脂質合成氧化；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位列全球惡性腫瘤的前5名，對人們的健康造成巨大威脅[1-2]。順鉑是一種能夠產生有效細胞毒性的非特異性抗腫瘤藥物，被廣泛應用于胃癌的治療。但其在治療過程中的持續(xù)使用會逐漸產生耐藥性[3-4]，因此尋求一種療效確切且可以減少胃癌細胞順鉑耐藥性的藥物尤為重要。

腫瘤細胞的代謝重編程是腫瘤的重要特征，代謝重編程發(fā)生在腫瘤生成的各個階段，與細胞對抗癌藥物的敏感性也有很密切的關系。相較于糖代謝，對腫瘤細胞中脂質代謝的研究較少，但近年越來越多的研究證明在腫瘤細胞中，脂質代謝也發(fā)生了明顯的變化[5]。脂質作為第二信使和激素在信號傳遞中扮演著重要的角色，脂質堆積在腫瘤中非常常見，它本身被視為癌癥的標志[6]，脂肪酸的合成和氧化也受到過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）轉錄因子家族的調控[7]。腫瘤耐藥的機制十分復雜，研究發(fā)現抑制PPAR對于治療腫瘤耐藥有顯著的抑制作用，PPAR介導的脂肪酸氧化水平升高會導致耐藥的發(fā)生[8]。三磷酸腺苷檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）是糖酵解和脂質代謝的連接酶，是腫瘤細胞脂肪酸從頭合成的第一步，在多種腫瘤中表達增加[9]，已有研究發(fā)現可通過下調ACLY抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路和激活單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/活性氧（reactive oxygen species，ROS）通路逆轉卵巢癌順鉑耐藥[10]。因此，抑制PPAR和ACLY可能是克服腫瘤順鉑耐藥的新策略。通過調控脂代謝可以改善胃癌細胞耐藥性，研究脂質代謝物的改變對于闡明脂質代謝在胃癌細胞耐藥中的作用意義重大[11]。

中醫(yī)治療腫瘤類疾病依據扶正祛邪的原則，中藥輔助放射治療、化療可增敏減毒，改善耐藥，減少術后復發(fā)轉移，提高患者生存質量[12-13]。因此，研究中醫(yī)藥改善腫瘤耐藥的機制具有重大意義。陳皮是最常用的理氣藥，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效。藥理學研究表明陳皮及其有效成分類黃酮可以減少肝臟中的脂質堆積[14]。川陳皮素是多甲氧基黃酮類化合物，是陳皮中發(fā)揮作用的重要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應激、降血糖、調血脂等多種藥理活性[15-17]，川陳皮素作為一類天然的活性物質，具有較高安全性。已有研究發(fā)現川陳皮素能有效緩解由高脂膳食誘導的代謝紊亂，可改善血脂水平和肝臟脂肪變性程度[18]，但其對胃癌耐藥的作用卻鮮有報道。因此，本研究基于中藥理論并結合網絡藥理學和脂質組學方法探究川陳皮素在胃癌順鉑耐藥中的作用，并從分子層面揭示川陳皮素改善胃癌細胞順鉑耐藥的機制。

1 材料

1.1 細胞

人胃腺癌細胞株（AGS）和人胃腺癌順鉑耐藥株（AGS-DDP）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 藥品與試劑

川陳皮素（質量分數≥98%，批號Must-22100917）購自成都Must生物科技有限公司；順鉑（批號WA2A1210）購自齊魯制藥有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（批號BC-M-018）、PBS溶液（批號BC-BPBS-04）購自Bio-Channel生航生物公司；新生牛血清（批號22011-8612）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；胰酶細胞消化液（批號C0201）、RIPA裂解液（批號P0013B）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號P1005）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）、Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號C1062）購自碧云天生物技術有限公司；CCK-8試劑盒（批號FD3788）購自杭州弗德生物科技有限公司；ECL發(fā)光液（批號BL520B）購自Biosharp公司；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號12789）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號89477）、E-cadherin抗體（批號220874）、N-cadherin抗體（批號22018）、Vimentin抗體（批號10366）、PPARγ抗體（批號16643）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；ACLY抗體（批號AB40793）購自英國Abcam公司；二抗（批號ZB-2301、ZB-2305）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 儀器

UHPLC Nexera LC-30A型超高效液相色譜（日本島津公司）；ELX800型全自動酶標儀測（美國Bio-Tek公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國FORMA公司）；SW-CJ-HS2型細胞培養(yǎng)超凈臺（蘇州凈化設備廠）；IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；5430R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；電泳儀、MP-4型電泳槽（美國Bio-Rad公司）；Tanon-4600型化學發(fā)光成像儀（Tanon公司）；渦旋混合器（Thermolyne公司）。

1.4 數據庫與軟件

MetaboAnalyst 5.0網站（https://www. metaboanalyst.ca/home.xhtml）；TCMSP數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；GSEA GENE Set Enrichment Analysis網站（http://www.gsea-msigdb. org/gsea/index.jsp）；Sangerbox 3.0在線平臺（http:// vip.sangerbox.com/home.html）；STRING網站（https://cn.string-db.org/cgi/input），GENE Card數據庫（https://www.genecards.org/）；微生信網站（www. bioinformatics.com.cn）；LipidSearch（Thermo Scientific）自動化脂質組學分析軟件；Cytoscape 3.7.2軟件。

2 方法

2.1 AGS和AGS-DDP細胞的脂質代謝組學檢測與分析

將樣本加入200 μL 4 ℃超純水中，渦旋混勻，加入240 μL預冷甲醇，渦旋混合后加入800 μL甲基叔丁基醚，再次渦旋混合后低溫水浴中超聲20 min，室溫放置30 min，10 ℃、14 000×離心15 min，取上層有機相，氮氣吹干，?80 ℃保存樣本。樣品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色譜系統(tǒng)進行分離，柱溫45 ℃；體積流量300 μL/min；流動相A為10 mmol/L甲酸銨乙腈水溶液（乙腈-水6∶4），B為10 mmol/L甲酸銨乙腈異丙醇溶液（乙腈-異丙醇1∶9），梯度洗脫：0～2 min，30% B；2～25 min，30%～100% B；25～35 min，100%～30% B。整個分析過程中樣品置于10 ℃自動進樣器中，為避免儀器檢測信號波動而造成的影響，采用隨機順序進行樣本的連續(xù)分析。

當白砂糖添加量12%，姜水比1∶1，姜汁添加量14%，檸檬酸添加量0.625%，β-環(huán)狀糊精添加量0.04%時，在配比為7∶1∶1的卡拉膠、黃原膠、槐豆膠的膠凝劑添加量分別為1.00%，1.10%，1.20%，1.30%，1.40%時，設計單因素試驗，進行感官評價。

采用LipidSearch自動化脂質組學分析軟件進行峰識別、峰提取、脂質鑒定等處理，主要參數：前體耐受性5×10?6，產物離子閾值5%。對LipidSearch提取得到的數據進行數據分析，包括單變量統(tǒng)計分析、多元變量統(tǒng)計分析、層次聚類分析和相關性分析等；單變量統(tǒng)計分析包括Student’s-test/非參檢驗和變異倍數分析。

2.2 MetaboAnalyst通路分析

在脂質代謝組學分析得到的結果中，根據差異倍數（fold change，FC）值由高到低篩選出前20個耐藥細胞的代謝物，并將其導入MetaboAnalyst 5.0進行系統(tǒng)通路分析[19]。以Impact＞0.1和＜0.05為篩選條件，確定最相關的路徑，最后將分析出的代謝途徑輸入GSEA GENE Set Enrichment Analysis網站獲得該代謝途徑的相關靶點信息。

2.3 川陳皮素的京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在TCMSP中預測的川陳皮素靶點進行KEGG富集分析。使用Sangerbox 3.0 在線平臺進行數據分析和可視化的KEGG富集分析。最后將＜0.01設定為閾值，以確定具有顯著差異的生物過程和信號通路。

2.4 川陳皮素與代謝途徑靶點的獲取和網絡藥理學分析

TCMSP數據庫是根據中藥系統(tǒng)藥理學的相關理論建立的。藥物篩選以吸收、分布、代謝、排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）為標準，如人體口服生物利用度、半衰期、藥物親和性、Caco-2滲透性、血腦屏障和Lipinski規(guī)則[20]。從TCMSP數據庫中檢索川陳皮素中的靶點；以“glycerophospholipid metabolism”為關鍵詞，在GENE Card數據庫中檢索甘油磷脂代謝通路相關的靶點，得到的結果以“Relevance”為指標獲得相關靶點，將預測的靶點與川陳皮素的靶點聯系起來，得到的交集基因上傳到STRING網站進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，根據PPI的結果，建立了包含藥物和代謝物相互作用的基因之間關系的網絡圖。

2.5 CCK-8法檢測AGS細胞和AGS-DDP細胞的存活率

將處于對數生長期的AGS和AGS-DDP細胞細胞分別用胰酶消化，離心收集后重懸，然后以5000個/孔接種于96孔板中。分別用不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑或者不同濃度（0、5、10、100、150、200 μmol/L）的川陳皮素分別處理細胞24、48 h，或者50 μmol/L的川陳皮素聯合不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑處理24 h，另設置不接種細胞不加入藥物的空白孔，每孔加入10 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

2.6 流式細胞術檢測AGS-DDP細胞凋亡

AGS-DDP細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h，收集細胞并用PBS洗滌2次。采用Annexin-V和碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒檢測AGS-DDP細胞的凋亡，將細胞重懸于195 μL結合緩沖液中，然后依次加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。避光孵育15 min后，上機檢測AGS-DDP細胞的凋亡情況。

2.7 平板克隆形成實驗檢測AGS-DDP細胞增殖

AGS-DDP細胞以2×103個/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h后，更換完全培養(yǎng)基生長10 d，然后用多聚甲醛固定細胞，再加入0.1%結晶紫溶液染色10 min，染色后拍照，最后進行細胞克隆計數。

2.8 劃痕實驗檢測AGS-DDP細胞遷移

2.9 Western blotting檢測Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、ACLY和PPARγ蛋白表達

取對數生長期AGS-DDP細胞，以2×105個/孔接種于6孔板中，用不同濃度（0、50、100、200 μmol/L）的川陳皮素處理24 h，收集細胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解15 min。4 ℃、12 000×離心20 min，吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%牛血清白蛋白溶液封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫搖床孵育1 h后，經TBST漂洗，使用ECL液進行發(fā)光，用Image J軟件進行條帶分析。

2.10 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析及作圖，兩組間比較采用檢驗分析，兩組以上比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 AGS和AGS-DDP細胞的脂質代謝物存在顯著差異

主成分分析結果表明2組細胞能夠得到明顯的區(qū)分，提示本實驗建立的模型具有較高可靠性（圖1-A）；火山圖展示AGS和AGS-DDP細胞中脂質分子的整體差異表達倍數情況，圖中的點為FC＞1.5或FC＜0.67、＜0.05的脂質分子，即單變量統(tǒng)計分析篩選的差異脂質分子（圖1-B）；熱圖顯示了AGS-DDP和AGS細胞差異脂質的層次聚類結果（圖1-C）；弦圖顯示了AGS和AGS-DDP細胞差異脂質的相關性分析結果（圖1-D）。

A-AGS與AGS-DDP細胞的PCA得分圖 B-差異脂質分子火山圖 C-AGS與AGS-DDP細胞差異脂質的層次聚類熱圖 D-差異脂質的相關性分析弦圖

3.2 MetaboAnalyst通路分析脂質代謝產物富集在甘油磷脂代謝通路

根據FC值篩選出了差異最為顯著的前20個脂質代謝產物，熱圖顯示了這20個代謝物（圖2）。將這20個代謝產物導入MetaboAnalyst網站中，最終分析得到的5條代謝通路（甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝、糖基磷脂酰肌醇-錨生物合成、花生四烯酸代謝）。以Impact＞0.1、＜0.05為指標來確定最相關的途徑，重點分析了差異最為顯著的甘油磷脂代謝途徑。

3.3 川陳皮素潛在靶點與鉑類耐藥相關

從TCMSP數據庫中得到川陳皮素的34個潛在靶點，分別是環(huán)加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1，PTGS1）、PPARγ、凝血因子X（F10）、PTGS2、雌激素受體2（estrogen receptor 2，ESR2）、核受體共激活因子2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、環(huán)腺苷酸反應元件結合蛋白1（cAMP responsive element binding protein 1，CREB1）、磷脂酶A2組IVA（phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、兔抗凝血酶III（rabbit antithrombin-III，SERPINC1）、鉀電壓門控通道亞家族H成員2（potassium voltage-gated channel KQT-like subfamily member 2，KCNH2）、ESR1、雄激素受體（androgen receptor，AR）、凝血因子VII（F7）、蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPN1）、DNA拓撲異構酶IIα（TOP2A）、TOP2B、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）、熱休克蛋白90AB1（heat shock protein 90 kDa alpha class B member 1，HSP90AB1）、檢查點激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1，CHEK1）、絲氨酸蛋白酶1（protease serine 1，PRSS1）、大電導鈣離子激活的鉀通道M亞族α亞基（potassium large conductance calcium-activated channel subfamily M alpha member 1，KCNMA1）、糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3B）、電壓門控鈉通道α亞基5（sodium voltage-gated channel alpha subunit 5，SCN5A）、BCL2、BAX、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cystein-asparate protease 9，CASP9）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）、CD163、促紅細胞生成素產生肝細胞B2受體（erythropoietin-producing hepatocyte B2 receptor，EPHB2）。對這些靶點進行KEGG富集分析發(fā)現川陳皮素具有逆轉鉑類耐藥的潛力（圖3）。

3.4 網絡藥理學預測川陳皮素抑制胃癌鉑類耐藥的潛在靶點

將川陳皮素的34個靶點與從GENE Card數據庫獲得甘油磷脂代謝相關的548個潛在靶點相交，其中共同作用的靶點有8個，分別是PTGS1、PPARγ、F10、PTGS2、ESR2、NCOA2、CREB1、PLA2G4A。將數據導入Cytoscape進行可視化后顯示2個節(jié)點（紅色倒三角表示川陳皮素，深藍色倒三角表示甘油磷脂代謝）和34個潛在靶點（菱形表示潛在靶點），每條連線表示節(jié)點之間的相互作用（圖4）。

圖2 AGS和AGS-DDP細胞的前20個差異脂質代謝產物熱圖

圖3 KEGG通路富集分析

3.5 川陳皮素濃度-時間相關性地逆轉順鉑耐藥

如圖5所示，不同濃度順鉑處理后的AGS-DDP細胞存活率在給藥48 h后高于AGS細胞。與對照組比較，10、50、100、200 μmol/L川陳皮素處理24 h后，AGS和AGS-DDP細胞的存活率均顯著降低（＜0.05、0.01），5、10、50、100、200 μmol/L川陳皮素處理48 h后的AGS和AGS-DDP細胞的存活率均顯著降低（＜0.05、0.01）。50 μmol/L的川陳皮素和不同濃度（0、1、5、10、50、100 μmol/L）的順鉑聯用時，AGS-DDP細胞的存活率與僅用順鉑給藥時相比有顯著性差異（＜0.05），說明川陳皮素能增強AGS-DDP細胞對順鉑的敏感性，逆轉順鉑耐藥。

3.6 川陳皮素誘導AGS-DDP細胞凋亡

如圖6所示，與對照組比較，川陳皮素各劑量組細胞凋亡率均顯著升高（＜0.01），且呈劑量相關性。

3.7 川陳皮素抑制AGS-DDP細胞增殖能力

如圖7所示，與對照組比較，川陳皮素各劑量組細胞克隆形成數目均顯著減少（＜0.01），且呈劑量相關性。

3.8 川陳皮素抑制AGS-DDP細胞遷移能力

如圖8所示，與對照組比較，川陳皮素各劑量組給藥12 h后細胞遷移能力均顯著降低（＜0.05、0.01），川陳皮素中、高劑量組給藥24、48 h后細胞遷移能力均顯著降低（＜0.05、0.01），且呈時間-劑量相關性。

3.9 川陳皮素可以調控Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、ACLY和PPARγ蛋白表達

如圖9～11所示，與對照組比較，川陳皮素中、高劑量組Bax、E-cadherin蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），ACLY蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；川陳皮素高劑量組Bcl-2、N-cadherin、Vimentin和PPARγ蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。

A-DDP作用24 h后細胞存活率 B-DDP作用48 h后細胞存活率 C-川陳皮素作用24 h后細胞存活率 D-川陳皮素作用48h后細胞存活率 E-川陳皮素與順鉑共同作用24 h后細胞存活率 與對照組（0 μmol·L?1）比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與AGS-DDP組比較：#P＜0.05，下圖同

圖6 川陳皮素對AGS-DDP細胞凋亡的影響(, n = 3)

圖7 川陳皮素對AGS-DDP細胞增殖的影響(, n = 3)

圖8 川陳皮素對AGS-DDP細胞遷移的影響(, n = 3)

圖9 川陳皮素對AGS-DDP細胞凋亡相關蛋白表達的影響(, n = 3)

圖10 川陳皮素對AGS-DDP細胞遷移相關蛋白表達的影響(, n = 3)

圖11 川陳皮素對AGS-DDP細胞脂質代謝相關蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

順鉑為金屬鉑類絡合物，是一種周期非特異性抗腫瘤藥，被廣泛應用于胃癌的治療，但長期使用順鉑會產生獲得性的耐藥[3]。近年來，天然活性化合物的潛在機制已成為藥物研發(fā)的重要內容，越來越多研究證實了陳皮有抗癌的功效[21]，川陳皮素是從陳皮中分離得到的一種多甲氧基黃酮類化合物[22]，具有抑制腫瘤細胞增殖、控制癌癥發(fā)生和發(fā)展的作用，對多種癌癥都有著極強的抗癌功效[23-24]。在課題組前期研究中已經證實了川陳皮素在胃癌中的作用，并且通過抑制脂肪酸的從頭合成以改善胃癌的進展[25]，因此選取了川陳皮素繼續(xù)展開接下來的研究，探索川陳皮素對胃癌耐藥細胞AGS-DDP的潛在抗癌和逆轉耐藥的作用機制。

本研究首先采用了超高效液相色譜脂質代謝組學技術，其主要研究目標為各機體內的脂類物質、鑒定脂類分子在蛋白表達和基因代謝中的調控機制[26]。結果顯示，AGS與AGS-DDP細胞的脂質代謝產物有顯著的差異，根據FC值篩選出了差異最顯著的20個代謝產物集中在甘油磷脂代謝途徑，預測胃癌耐藥可能與甘油磷脂通路的脂質代謝相關。利用網絡藥理學對川陳皮素的潛在靶點進行KEGG通路富集分析，結果顯示川陳皮素可能通過誘導細胞凋亡逆轉鉑類耐藥。進一步發(fā)現川陳皮素與甘油磷脂代謝通路預測的靶點中共同作用的有8個，分別是PTGS1、PPARγ、F10、PTGS2、ESR2、NCOA2、CREB1、PLA2G4A，其中PPARγ重組蛋白與脂質的合成與代謝密切相關，研究發(fā)現川陳皮素可上調脂肪組織中PPAR家族mRNA表達水平，表明川陳皮素可以誘導脂質貯積和脂肪酸氧化[27]，因此PPARγ可能是川陳皮素治療胃癌細胞耐藥的關鍵靶點。

隨后在體外進行細胞實驗驗證，CCK-8結果顯示，不同濃度順鉑處理后的AGS-DDP細胞的存活率在處理48 h后明顯高于AGS細胞，證實AGS-DDP細胞對順鉑更不敏感，產生了耐藥性；與對照組比較，用不同濃度川陳皮素處理24、48 h后的AGS和AGS-DDP細胞的存活率均降低，50 μmol/L的川陳皮素和順鉑聯用時，AGS-DDP細胞的存活率與僅用順鉑給藥時相比明顯降低，說明川陳皮素能增強AGS-DDP細胞對順鉑的敏感性，逆轉順鉑耐藥，且呈時間-劑量相關性，因此選用對照組和川陳皮素低、中、高劑量（50、100、200 μmol/L）組進行后續(xù)的實驗。流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)現AGS-DDP細胞凋亡數量隨著川陳皮素濃度的升高而增加，并且有顯著的差異，說明川陳皮素能誘導AGS-DDP細胞凋亡。平板克隆形成結果顯示川陳皮素給藥后的克隆形成數目與對照組克隆形成數目相比降低，并且有顯著性差異，說明川陳皮素能抑制AGS-DDP細胞的增殖能力。細胞劃痕實驗結果顯示，川陳皮素可以明顯抑制AGS-DDP細胞的遷移能力。

Bcl家族在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Bcl-2在細胞凋亡中起抑制作用，Bax則起到促進作用，Bcl-2、Bax在評定細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[28]。Western blotting實驗檢測了Bcl-2和Bax的蛋白表達水平，與對照組比較，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高，且與給藥劑量呈正相關，說明川陳皮素能誘導AGS-DDP細胞的凋亡；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是維持細胞骨架和細胞黏附能力的重要蛋白，是評定細胞遷移能力的重要標志[29]。E-cadherin表達水平升高，N-cadherin和Vimentin的表達降低，且與給藥劑量呈正相關，說明川陳皮素能抑制AGS-DDP細胞的遷移能力；PPARγ是一種重要的轉錄因子，在炎癥性細胞因子產生和細胞分化中起控制作用[30]，文獻報道PPARγ表達和轉錄活性的上調與肌肉內脂質沉積有關，拮抗PPARγ可以成功阻止各種來源腫瘤細胞的體外生長，而激活PPARγ則可通過將有毒脂肪酸轉化為惰性三酰甘油促進腫瘤生長，并且PPARγ還可以調控ACLY的表達量，ACLY是葡萄糖代謝和脂肪酸合成的橋梁，能催化檸檬酸轉化為乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA），從而將過量的糖酵解產物導向脂質合成，從而促進腫瘤的生長和分化。因此，PPARγ和ACLY可能成為腫瘤治療的潛在靶點[31-32]。為了探究川陳皮素是否能調控AGS-DDP細胞的脂質合成和氧化，Western blotting實驗檢測了PPARγ和ACLY的蛋白表達水平，在給藥24 h后均減低，且與給藥劑量呈正相關，說明川陳皮素可以通過PPARγ和ACLY調控AGS-DDP細胞的脂質合成和氧化過程。

綜上，本研究運用脂質代謝組學和網絡藥理學探究川陳皮素通過調控脂質合成和氧化改善胃癌順鉑耐藥的作用機制，并結合細胞實驗驗證了川陳皮素對順鉑胃癌耐藥細胞增殖、凋亡和遷移能力的作用，為后續(xù)川陳皮素治療胃癌耐藥的研究提供新思路、新方向，為進一步研究其作用機制提供數據支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of nobiletin on reversing cisplatin resistance in gastric cancer by regulating lipid synthesis and oxidation based on multiomics

SHEN Jun-yu1, LI Huai-zhi1, CHEN Meng-lin1, ZHENG Shan-shan1, ZHANG Can-can1, HAN Bo1, WU Jian2, SUN Qing-min2

1. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China

To search for the core targets of nobiletin on gastric cancer cisplatin resistant cells (AGS-DDP) by lipid metabolomics and network pharmacology, and further explore the mechanism of nobiletin on reversing gastric cancer cisplatin resistance through cell experiments.UPLC-Orbitrap mass spectrometry system was used for non-targeted lipidomics analysis. GENE Card and TCMSP databases were utilized to explore potential targets for the metabolic pathways of nobiletin and glycerol phospholipids, the intersection targets were integrated through Microbioinformatics online mapping tool platform, and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis was performed. STRING database was used to construct protein-protein interaction (PPI) network, the core targets of nobiletin was visualized by Cytoscape software. After administration of nobiletin, the survival rate of AGS and AGS-DDP cells was detected by CCK-8 method; Flow cytometry was used to detect the apoptosis of AGS-DDP cells; Scratch experiment was used to detect the migration ability of AGS-DDP cells; Western blotting was used to detect B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ) and adenosine triphosphate citrate lyase (ACL) protein expressions in AGS-DDP cells.A total of 1450 different lipid compounds were detected in 31 subclasses of AGS and AGS-DDP cells through lipidomics analysis, mainly enriched in glycerol phospholipid metabolism pathway. KEGG enrichment analysis of potential targets of nobiletin showed that nobiletin had the potential to reverse platinum resistance. The results of cell experiment showed that compared with control group, nobiletin significantly inhibited the survival rate of AGS-DDP cells in a dose-dependent manner (< 0.05, 0.01), increased the sensitivity of AGS-DDP cells to cisplatin (< 0.05), induced AGS-DDP cells apoptosis and inhibited its migration ability (< 0.05, 0.01). The results of Western blotting experiments showed that Bax and E-cadherin protein expression levels were significantly increased (< 0.05, 0.01), as well as Bcl-2, N-cadherin, Vimentin, ACL and PPARγ protein expression levels were significantly reduced (< 0.05, 0.01).The differential lipid metabolites between AGS and AGS-DDP cells are mainly enriched in glycerol phospholipid metabolism pathway. Nobiletin inhibits the proliferation and migration of AGS-DDP cells by regulating key genes for lipid synthesis and oxidation, ultimately reversing cisplatin resistance in gastric cancer.

gastric cancer; nobiletin; network pharmacology; cisplatin resistance; lipid synthesis and oxidation; peroxisome proliferators-activated receptor γ

R28.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7066 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.015

2023-07-10

國家自然科學基金資助項目（81973609）；國家自然科學基金資助項目（81973782）；國家自然科學基金資助項目（82174197）；江蘇省自然科學基金項目（BK20211392）；江蘇省醫(yī)學青年人才項目（QNRC2016641）；江蘇省“333”計劃項目（LGY2018065）；江蘇省中醫(yī)院學術人才計劃項目（Y2021RC29，Y2021RC45）

申雋于，碩士研究生，從事腫瘤臨床藥學研究。E-mail: 20210143@njucm.edu.cn

通信作者：孫慶敏，副主任藥師，從事腫瘤臨床藥學研究。E-mail: qingminsun@njucm.edu.cn

吳 堅，副研究員，從事腫瘤微環(huán)境的研究。E-mail: czcyg@sina.com

[責任編輯 李亞楠]