產(chǎn)香氣化合物微生物的研究進(jìn)展

李媚媛，劉安琪，唐道埔，劉 冰，張新國,*，張 繼

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省高校中藏藥篩選評(píng)價(jià)及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；2.西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅 蘭州 730070）

香氣化合物是自身具有香氣的酯類、醛類、醇類、酮類、萜類、有機(jī)酸類等化合物的統(tǒng)稱[1-3]，其具有抗氧化、抗菌等活性，在食品、化妝品、香料等行業(yè)應(yīng)用廣泛，部分香氣化合物還可以作為燃料、溶劑、天然殺蟲劑、信息素和藥物前體[4-5]。目前香氣化合物主要是通過化學(xué)合成以及從天然動(dòng)植物中提取來獲得。化學(xué)合成是當(dāng)前獲取香氣化合物的主要方法之一，但存在環(huán)境污染、產(chǎn)物含有反應(yīng)副產(chǎn)物等問題，應(yīng)用于食品、化妝品中安全性難以保證。盡管利用傳統(tǒng)方法從天然動(dòng)植物中提取香精、香料可以滿足安全性的需求，但受到資源的限制，且溶劑消耗量大、提取率低、提取成本高[6]，難以滿足市場(chǎng)的需求。

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平提高，人們對(duì)香氣化合物的需求日益增加[7]，綠色香氣化合物成為主流。研究顯示，許多微生物不僅能利用酶對(duì)香氣化合物進(jìn)行從頭合成，還可以通過生物轉(zhuǎn)化作用產(chǎn)生香氣化合物[8-13]，這些微生物除了原始菌株外，還有通過基因工程改造后的工程菌株。中、美兩國均將酶法或微生物法所得的香料定義為天然香料[14-15]，推動(dòng)了生物技術(shù)合成香料市場(chǎng)的發(fā)展[16-17]。本文就產(chǎn)香微生物來源、產(chǎn)香氣化合物研究概況及利用微生物發(fā)酵提高香氣化合物產(chǎn)量的探索與策略等方面進(jìn)行綜述，為通過微生物生產(chǎn)綠色香氣化合物提供重要的理論依據(jù)。

1 產(chǎn)香微生物的來源與分離

1.1 土壤中的產(chǎn)香微生物及其分離

土壤是自然界最豐富的微生物庫，已有不少的研究從土壤中篩選產(chǎn)香微生物用于食品發(fā)酵或香料等生產(chǎn)。Wang Xuzeng等[18]從8 個(gè)不同地區(qū)的葡萄園土壤中篩選出了3 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和1 株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），通過頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)菌株揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，得到45 種芳香物質(zhì)，為獲得香氣濃郁的葡萄酒提供了重要參考。Muddapur等[19]從森林土壤中分離到一株黑青霉菌（Penicillium nigricans），該菌株能通過多種途徑將具有松木香氣的3-蒈烯[20]轉(zhuǎn)化為二氫香芹酮、香芹酮、紫蘇酸等香料物質(zhì)或香料合成中間產(chǎn)物。Bao Yanrong等[21]從芒果園的芒果果皮及土壤中分離到一株庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），經(jīng)HS-SPME和GC-MS對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了乙酸乙酯、異戊醇（蘋果味）、苯乙醇（蜂蜜和玫瑰味）以及β-紫羅蘭酮（花香、果香和甜味）。Li Xuewei等[22]從甘薯根際土壤中分離鑒定出一株淡紫鏈霉菌SPS-33（Streptomyces lavendulaeSPS-33），發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物含有3-甲基-1-丁醇/異戊醇、癸酸乙酯、苯乙醇等多種香味化合物。

一些大型土壤真菌往往能合成數(shù)十種香氣物質(zhì)。如松露作為定殖在松樹根部土壤的一類蕈菌，因能產(chǎn)生醇類、酮類、醛類、芳香族和硫類化合物而擁有獨(dú)特的香氣[23]，研究發(fā)現(xiàn)，多種定殖于松露上的細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌共同參與了松露的香氣產(chǎn)生[24]。Zhang Huiying等[25]發(fā)現(xiàn)鮮牛肝菌（Boletus edulis）具有29 種香氣物質(zhì)，包括多種醛、醇類化合物。松露、牛肝菌及其他蕈菌也因其復(fù)雜的香氣而深受人們喜愛。張炳火等[26]對(duì)從森林土壤中分離的產(chǎn)香真菌JXJ 01進(jìn)行鑒定，顯示該菌種與赤褐鵝膏菌（Amanita fulva）親緣相近但子實(shí)體形態(tài)不同，可能是一種新型蕈菌，通過GC-MS對(duì)其香氣成分進(jìn)行分析，鑒定出20余種香氣物質(zhì)，其中反-桂酸甲酯、桂酸乙酯和芳樟醇含量占到總揮發(fā)性成分的31.71%。

土壤微生物基數(shù)大且種類繁雜，對(duì)分離方法和技術(shù)有更高的要求[27]，現(xiàn)有產(chǎn)香微生物的研究多采用富集培養(yǎng)法，以花園、果園等土壤為樣本來源[18-21]。探索一些新方法是必要的，比如通過向培養(yǎng)基中加入特定生長介質(zhì)，如待發(fā)酵物、轉(zhuǎn)化底物、生長因子等，或者直接以某種底物為唯一碳源，為目標(biāo)菌種創(chuàng)造出適宜的環(huán)境[28-30]，以實(shí)現(xiàn)目的菌種的富集[31-32]。

1.2 植物中的產(chǎn)香微生物及其分離

植物內(nèi)生菌是生活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)植物明顯病癥的微生物，部分植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似活性的物質(zhì)[33]，因此分離香料植物內(nèi)生菌已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

Monggoot等[34]從泰國采集的芳香木本植物Aquilaria subintegra中發(fā)現(xiàn)來自Arthrinium屬、Colletotrichum屬和Diaporthe屬的4 株菌能產(chǎn)生苯甲酸乙酯、苯甲酸芐酯以及β-沉香呋喃等廣譜揮發(fā)性化合物，這些化合物與宿主產(chǎn)生的沉香油組成成分非常相似，對(duì)于尋找沉香木主要香氣化合物的替代資源具有重要意義。劉選明等[35]用4 種不同的分離培養(yǎng)基從成熟香茅草中分離篩選出一株具有明顯清新、愉悅香味的菌株P(guān)antoea ananatisCcSh-1，對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中香氣化合物橙花醛和香葉醛的含量都相對(duì)較高。Bier等[36]從Pinus taeda樹皮中分離出一株擬莖點(diǎn)屬（Phomopsissp.）內(nèi)生真菌，其能產(chǎn)生松油烯-4-醇、薄荷醇和香葉醇等香氣化合物。Molina等[37]從Dipteryx alataVog.果實(shí)中分離出3 株真菌，其能將α-蒎烯轉(zhuǎn)化為具有樟腦和薄荷風(fēng)味[38]的馬鞭草烯醇，產(chǎn)量最高的菌株在發(fā)酵72 h后質(zhì)量濃度達(dá)80 mg/L。從植物中尋找與宿主有相似代謝的內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)香彌補(bǔ)了香料資源的短缺，也為香氣化合物的發(fā)現(xiàn)的提供了重要的機(jī)會(huì)。

植物產(chǎn)香微生物的分離與植物內(nèi)生菌相似。采用傳統(tǒng)分離方法時(shí)應(yīng)注意不同處理方法特別是消毒程序的選擇，會(huì)導(dǎo)致微生物量有較大差別[39]，需針對(duì)不同微生物選擇合適的培養(yǎng)基、適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間從而兼顧環(huán)境中生長緩慢的微生物。此外，在分離過程中可以采用一些新技術(shù)，比如運(yùn)用宏基因組學(xué)的技術(shù)[40]確定目標(biāo)菌株、選擇合適的培養(yǎng)基，對(duì)于產(chǎn)香微生物的分離具有重要指導(dǎo)意義。

1.3 水體中的產(chǎn)香微生物及其分離

地球上的水體約占地球表面積的71%，是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)，蘊(yùn)藏著巨大的生物資源，其中不乏各種產(chǎn)香微生物。Hosoglu[41]對(duì)3 種海洋微藻（Crypthecodinium cohnii、Schizochytrium limacinum、Tetraselmis chuii）和2 種淡水微藻（Chlorella vulgaris、Chlorella protothecoides）的特征香氣成分進(jìn)行分析，共檢測(cè)到29 種揮發(fā)性有機(jī)物，分屬硫化物、醛、醇、酮、芳香烴和酯等六大類，在這5 種菌株發(fā)酵樣品中都檢測(cè)到二甲硫醚（卷心菜氣味，嗅覺閾值低、氣味活性強(qiáng)，易由香味過渡到異味[42-43]）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香味）、(Z)-1,5-辛二烯-3-酮（天竺葵清香）、2-異丙基-3-甲氧基吡嗪（豌豆清香）和(E,Z)-2，6-二十二烯（黃瓜清香）等。Sutani等[44]從日本海洋沉積物中分離出菌株MS1和MS2，并被鑒定為白地霉（Geotrichum candidum），其可以釋放出類似甜瓜的香氣，GC-MS分析結(jié)果表明與其相關(guān)的主要化學(xué)物質(zhì)為順式-3-己烯-1-醇、順式-6-壬烯醛、3,6-壬二烯-1-醇等。梁龍?jiān)萚45]從深海海泥中取樣，用含三丁酸甘油酯的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到一株產(chǎn)酯酵母。以乙醇和己酸為底物，酵母菌株的酯化能力為2.6976 U，經(jīng)鑒定與近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）的同源性為99%。趙希景[46]從潮間帶沉積物中分離獲得8株可以將阿魏酸轉(zhuǎn)化為香蘭素的菌株，篩選獲得了一株高產(chǎn)菌株B-32，在1 g/L阿魏酸的發(fā)酵液中能生成0.71 g/L的香蘭素。Chen Wen等[47]對(duì)從印度洋分離的深海細(xì)菌Bacillus aryabhattaiMCCC 1K02966揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該菌能產(chǎn)生具有強(qiáng)烈洋蔥、大蒜和蘿卜香氣的硫代乙酸甲酯和具有花香和果香的1-丁醇[48]。

水體中產(chǎn)香微生物的取樣，特別是海洋產(chǎn)香微生物，通常在海洋沉積物和其他特殊生態(tài)位中進(jìn)行[49]，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)考慮其特殊條件，引入含有海水的培養(yǎng)基，兼顧水壓、溫度等。微藻作為水體中較為豐富的微生物，培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意光照、溫度和鹽度[50]。此外，一些新分離方法比如通過選擇性濾膜進(jìn)行天然環(huán)境原位培養(yǎng)以分離難培養(yǎng)的產(chǎn)香微生物仍然值得期待[51]。

1.4 發(fā)酵環(huán)境中的產(chǎn)香微生物及其分離

除自然環(huán)境中存在的微生物，人類在發(fā)酵食品等過程中營造的人工環(huán)境也存在豐富的產(chǎn)香微生物，且由于特定的生長環(huán)境，這些菌種往往有更高的特異性。以中國的白酒為例，富志磊等[52]從衡水老白干酒曲中分離出一株高產(chǎn)β-苯乙醇的季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）F11601，在優(yōu)化培養(yǎng)條件后β-苯乙醇產(chǎn)量可達(dá)1.66 g/L，除苯乙醇外，還能產(chǎn)生棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸、月桂酸等白酒中的重要特征香味物質(zhì)。Lai等[53]從高粱酒的黃水中分離出3 株酵母菌，經(jīng)鑒定分別為Candida humilis、釀酒酵母和Kazachstania exigua，均具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力，產(chǎn)物中2-苯乙醇、乙偶姻、異戊醇、乙酸乙酯的含量較高。Liu Chaolan等[54]從濃香型白酒窖泥中分離出一株新型梭狀芽孢桿菌（Clostridium swellfunianumsp.nov.）S11-3-10T，其發(fā)酵產(chǎn)物含有豐富的乙醇、乙酸，以及微量的丁酸和異戊酸（奶酪味、酸味），這些化合物在白酒香氣形成中起著重要的作用。曾婉俐等[55]從自然醇化的紅大煙葉樣品取樣，用含煙葉浸提物的培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，得到一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌屬的產(chǎn)香細(xì)菌HD-40，從該菌的發(fā)酵液中檢測(cè)出44 種香味物質(zhì)，包括苯乙醇、2,3-丁二醇、丙酸乙酯等，其中乙偶姻占比達(dá)60.31%，這些化合物有可能增加煙葉風(fēng)味。余翔等[56]從發(fā)酵用煙葉中篩選出一株產(chǎn)香菌株GXY35，其被鑒定為克雷伯氏桿菌（Klebsiellasp.），GC-MS分析結(jié)果顯示該菌含量最高的特征香味物質(zhì)為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。此外，葡萄酒[57]、酸奶[58]、醬油[59]和醋[60]的發(fā)酵都有豐富的產(chǎn)香微生物參與，賦予產(chǎn)品各種風(fēng)味。

盡管鮮有研究對(duì)產(chǎn)香微生物多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，但是現(xiàn)有研究關(guān)于產(chǎn)香微生物主要集中在真菌界的酵母菌屬[61]、庫德畢赤酵母[20]、青霉屬[18]、曲霉屬[34]、地霉屬[44]、威克漢姆酵母屬[62]、節(jié)菱孢屬[33]、間座殼屬[33]、刺盤孢屬[33]、小球藻屬[41]、擬莖點(diǎn)屬[36]、假絲酵母屬[45,53]、Schizochytrium屬[41]、Crypthecodinium屬[41]、Tetraselmis屬[41]、Meyerozyma屬[52]、Kazachstania屬[53]、耶氏酵母屬[63]、蕈菌[26]、擔(dān)子菌[64]，細(xì)菌界的泛菌屬[35]、克雷伯氏菌屬[56]、鏈霉菌屬[21]、芽孢桿菌屬[47,55]、梭狀芽孢桿菌屬[54]、Chitinophaga屬[65]、假單胞菌屬[66]、腸桿菌屬[67]共26 個(gè)產(chǎn)香屬的微生物（部分無屬分類），其中以酵母菌、霉菌以及芽孢桿菌的研究最多。多樣性豐富的產(chǎn)香微生物不僅能直接用于生產(chǎn)，而且其代謝途徑及相關(guān)基因可用于代謝工程以高效生產(chǎn)香氣化合物，避免了毒性副產(chǎn)物的產(chǎn)生及大量污染物的排放[68-70]。

2 微生物產(chǎn)香氣化合物的研究概況

目前，微生物發(fā)酵作為香氣化合物的重要來源，資源廣泛、環(huán)境友好而且產(chǎn)物具有天然屬性，在食品行業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力。

2.1 酯類香氣化合物

作為水果和花卉中香味的主要來源，酯類香氣化合物廣泛應(yīng)用于香精、香料、食品、化妝品等方面[71]。Zhang Zhongtian等[72]研究發(fā)現(xiàn)菌株Clostridium tyrobutyricumATCC 25755能產(chǎn)生具有水果香氣的丁酸丁酯，在發(fā)酵過程中添加脂肪酶和丁醇可將丁酸丁酯產(chǎn)量提高60%。Kumar等[73]發(fā)現(xiàn)的一株芽孢桿菌Bacillus safensisDVL-43能產(chǎn)生耐有機(jī)溶劑的DVL-43脂肪酶，可產(chǎn)生具有特殊的果香的月桂酸乙酯。Gao Wenyuan等[74]用一種新型酯酶EST4構(gòu)建了工程大腸桿菌EPI300?-T1R，以肉桂醇、香茅醇、香葉醇和異戊醇作為底物，獲得了乙酸肉桂酯、醋酸香茅酯、乙酸香葉酯和乙酸異戊酯4 種香氣化合物。鄰氨基苯甲酸甲酯是一種有葡萄香味的酯類化合物，天然存在于葡萄、草莓、葡萄酒中。Luo Ziwei等[75]以葡萄糖作為唯一碳源，利用工程大腸桿菌ZWA4和工程谷氨酸棒桿菌YTM8分別產(chǎn)生4.47 g/L和5.74 g/L鄰氨基苯甲酸甲酯，合成關(guān)鍵酶為鄰氨基苯甲酸甲基轉(zhuǎn)移酶1，該發(fā)現(xiàn)可以較大程度提高鄰氨基苯甲酸甲酯產(chǎn)量，從而降低獲得葡萄香味產(chǎn)品的成本。γ-十二內(nèi)酯和γ-癸內(nèi)酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，可以作為食品香料。Marella等[76]發(fā)現(xiàn)一種解脂耶氏酵母Y-63746（Yarrowia lipolyticaY-63746），其以非羥基化脂肪酸亞油酸為底物，利用脂肪酸水合酶合成了γ-十二內(nèi)酯。Braga等[77]利用解脂耶氏酵母W29（Yarrowia lipolyticaW29）獲得了γ-癸內(nèi)酯，該過程與酰基輔酶A氧化酶密切相關(guān)。

2.2 醛類香氣化合物

醛類香氣化合物普遍存在于食物中并且對(duì)大多數(shù)香水的制作而言必不可少，常用作食品添加劑出現(xiàn)在酒類、軟飲料及冰激凌中[78-80]。Chattopadhyay等[81]利用菌株Streptomyces sannanensis（MTCC 6637）將麥麩中的阿魏酸酯生物轉(zhuǎn)化得到708 mg/L的香草醛。芳香醛作為香精、香料應(yīng)用廣泛，Kunjapur等[82]成功搭建了芳香醛生物合成的平臺(tái)，利用醛酮還原酶、醇脫氫酶構(gòu)建工程大腸桿菌K-12 MG1655產(chǎn)生芳香醛，該菌株合成的苯甲醛在24 h內(nèi)向苯甲醇的轉(zhuǎn)化率低于12%，大大提高了苯甲醛產(chǎn)量。Buchhaupt等[83]用大豆脂氧合酶和西瓜過氧化氫裂解酶基因構(gòu)建了一種釀酒酵母工程菌BY.JG10-2B，其以亞麻酸為底物合成了大量3(Z)-己烯醛（60 mg/L）。香茅醛是香茅精油中重要的成分之一[84]，Zhang Baoyi等[85]利用基因工程改造獲得了一株催化效率和立體選擇性同時(shí)提高的釀酒酵母工程菌株——Y84V，其能將(E/Z)-檸檬醛完全轉(zhuǎn)化為(R)-香茅醛。

2.3 醇類香氣化合物

醇類香氣化合物是一類常用的香料，通常具有花香、果香、葉香或木香特征。2-苯乙醇是一種芳香醇，具有蜂蜜和玫瑰香氣，是玫瑰中最主要的花香化合物[86]。Braga等[87]將Yarrowia lipolyticapET-rrbdh菌株用于L-苯丙氨酸的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇，最終該菌株利用用4 g/LL-苯丙氨酸可生產(chǎn)2.2 g/L 2-苯乙醇。橙花醇（C10H18O）是一種無環(huán)單萜，是天然存在于植物精油中的一種香料成分。Zong Zhen等[88]在工程大腸桿菌LZ005中利用橙花醇合成酶對(duì)葡萄糖進(jìn)行生物合成獲得產(chǎn)量為1.564 mg/L的橙花醇。香葉醇是一種無環(huán)單萜醇，具有玫瑰花氣息，可用于蘋果、草莓等果香型、肉桂、生姜等香型的食用香精。Wang Xun等[89]利用香葉基二磷酸合酶和香葉醇合酶構(gòu)建工程大腸桿菌TOP10，并利用該菌株獲得了2.124 g/L的香葉醇。Chen Zhenya等[90]提出了一種利用工程大腸桿菌BW25113生產(chǎn)食品調(diào)味劑香草醇的人工途徑。該途徑從4-羥基苯甲酸開始，利用對(duì)羥基苯甲酸羥化酶、羧酸還原酶和咖啡酸鹽O-甲基轉(zhuǎn)移酶3 種異源酶對(duì)香草醇進(jìn)行從頭生物合成，使香草醇的產(chǎn)量變得可控。苯甲醇常見于茉莉和風(fēng)信子的精油中。Pugh等[91]在工程大腸桿菌yqhD中設(shè)計(jì)非天然途徑并利用多種內(nèi)源性乙醇脫氫酶、醛酮還原酶探索了從葡萄糖生物合成苯甲醇，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)114 mg/L的苯甲醇產(chǎn)量。

2.4 酮類香氣化合物

酮類香氣化合物在香料中的應(yīng)用廣泛，一般具有花香或果香，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在香料工業(yè)中占有重要地位[92-93]。4-(4-羥基苯基)丁烷-2-酮，又稱樹莓酮，是樹莓果實(shí)的主要香味成分，也可以作為食品添加劑。Yang Bo等[94]在工程大腸桿菌JM109中以4-羥基亞芐基丙酮為底物，表達(dá)樹莓酮合成酶和葡萄糖脫氫酶獲得轉(zhuǎn)化率高達(dá)98%樹莓酮。Nawrath等[65]發(fā)現(xiàn)菌株Bacterium ChitinophagaFx7914能合成食品級(jí)香料2-甲基四氫噻吩-3-酮。β-紫羅蘭酮存在于許多花卉和水果中具有突出香味。López等[95]構(gòu)建了可合成β-紫羅蘭酮的釀酒酵母工程菌株JLS07，利用香葉基二磷酸合酶使β-紫羅蘭酮濃度增加了8.5 倍。α-紫羅蘭酮是覆盆子和黑莓中主要的香氣化合物。Chen Xixian等[96]將突變的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶1與番茄紅素ε-環(huán)化酶進(jìn)行融合表達(dá)，構(gòu)建的工程大腸桿菌Bl21-Gold DE3可將α-紫羅蘭酮的濃度提高2.5 倍以上。乙偶姻主要用于配制奶油、酸奶和草莓等香料，He Yuanzhi等[97]開發(fā)了一種含有3-丁二醇脫氫酶、NADH氧化酶和Vitreoscilla hemoglobin相關(guān)基因的工程大腸桿菌pET-rrbdh-nox-vg，在最佳條件下誘導(dǎo)催化2,3-丁二醇立體定向氧化獲得質(zhì)量濃度為72.38 g/L的(3S)-乙偶姻。

2.5 萜類香氣化合物

萜類香氣化合物是食品和化妝品工業(yè)不可缺少的天然香料[98]。檸檬烯是柑橘類精油中主要的單萜。Rolf等[99]將甘油作為檸檬烯合成的唯一碳源，利用含有甲戊酸途徑和檸檬烯合成酶基因的工程大腸桿菌BL21（DE3）pJBEI-6410合成3.6 g/L檸檬烯。月桂烯是一種單萜類香料化合物，在云杉油、松節(jié)油、檸檬草油等中均存在，Kim等[100]以甘油作為碳源，通過引入異源甲戊酸途徑、表達(dá)香葉二磷酸合酶及月桂烯合酶，利用工程大腸桿菌Ec-pM1/pGM(Qi)得到產(chǎn)量達(dá)58.19 mg/L的月桂烯。香檜烯是天然雙環(huán)單萜，常被用作香料添加劑使用。Zhang Haibo等[101]利用甲基赤蘚糖醇4-磷酸或異源甲羥戊酸構(gòu)建生物合成途徑，在工程大腸桿菌菌株BL21(DE3)中插入香檜烯合酶基因，經(jīng)工藝優(yōu)化使香檜烯的產(chǎn)量提高至82.18 mg/L。β-古巴烯是三環(huán)倍半萜烯，主要存在于煙草、茶葉及一些芳草中[102]，Mischko等[64]從擔(dān)子菌Coniophora puteana中發(fā)現(xiàn)萜烯合酶被證明參與了倍半萜烯的合成并在工程大腸桿菌HMS174中表達(dá)，并得到215 mg/Lβ-古巴烯。

2.6 有機(jī)酸類香氣化合物

部分有機(jī)酸類香氣化合物可作為香料為食品帶來清爽口感。對(duì)香豆酸常被用于制備香精香料[103]，Rodriguez等[104]開發(fā)了生產(chǎn)對(duì)香豆酸的工程釀酒酵母菌株CEN.PK102-5B，在該菌株中通過高效表達(dá)酪氨酸解氨酶、DAHP合成酶（ARO4K229L）、分支酸變位酶（ARO7G141S）和大腸桿菌莽草酸激酶II，最高可得到產(chǎn)量為1.937 g/L的對(duì)香豆酸。檸檬酸是一種弱有機(jī)酸，常作為酸化劑增強(qiáng)食品的風(fēng)味和香氣[105]。Yarrowia lipolyticaH222菌株是可以產(chǎn)檸檬酸的酵母菌，Abghari等[106]對(duì)該菌株進(jìn)行基因改造，高表達(dá)乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A，發(fā)酵最高可產(chǎn)檸檬酸45 g/L。Mi Jia等[66]通過基因改造獲得的重組工程菌Pseudomonas putidaDSM 12264在48 h內(nèi)可產(chǎn)有機(jī)酸香料香葉酸193 mg/L。對(duì)羥基肉桂酸可用作調(diào)味劑,Vargas-Tah等[107]構(gòu)建了含有編碼分支酸變位酶-預(yù)苯酸脫氫酶基因的工程大腸桿菌W3110，使對(duì)羥基肉桂酸的產(chǎn)量增加了8 倍。

2.7 其他香氣化合物

吡嗪化合物在肉味香精、堅(jiān)果香精及蔬菜香精中起著重要作用。2-乙基-3,5(3,6)-二甲基吡嗪（2-ethyl-3,5(6)-dimethylpyrazine，EDMP）具有烘焙可可或堅(jiān)果的宜人香氣，Zhang Huaizhi等[108]提出并證實(shí)了EDMP的生物合成途徑，從白酒發(fā)酵中分離到一株產(chǎn)EDMP的枯草芽孢桿菌Nr.5（LAM 19024），研究表明該反應(yīng)與L-蘇氨酸脫氨酶、L-蘇氨酸脫氫酶有關(guān)。當(dāng)然，自然界豐富的微生物中是否存在其他結(jié)構(gòu)新穎的香氣化合物以及其安全性如何，仍然是一個(gè)值得深入研究的課題。

表1對(duì)微生物源香氣化合物的研究進(jìn)行了匯總。

表1 微生物產(chǎn)香氣化合物研究概況Table 1 Overview of research on aroma compounds produced by microorganisms

3 利用微生物發(fā)酵提高香氣化合物產(chǎn)量的探索與策略

產(chǎn)香氣化合物的微生物普遍存在培養(yǎng)液中香氣化合物含量低、缺乏適于發(fā)酵的工業(yè)菌株等問題。除了繼續(xù)從自然界中篩選更好的原始菌株，對(duì)現(xiàn)有產(chǎn)生菌進(jìn)行遺傳改造及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化提高產(chǎn)量仍然是該方向研究的熱點(diǎn)之一。

3.1 菌種改良

菌種改良主要是對(duì)微生物菌種進(jìn)行基因改造以提高其應(yīng)用潛力[109]?？赏ㄟ^增刪編碼基因或誘變等方式獲得所需的獨(dú)特菌株，將其用于香氣化合物的生產(chǎn)。Wang Yuepeng等[110]將低雙乙酰積累的Bacillussp.DL01-ΔalsD菌株與高溫敏感穿梭質(zhì)粒載體pKS1進(jìn)行同源重組，刪除了編碼磷酸三酯酶的基因，使雙乙酰產(chǎn)量增加了130%。Devanthi等[111]通過基因重組得到一種高耐鹽性Z.rouxii突變體，其可在較短時(shí)間內(nèi)大量合成乙酸乙酯。Binder等[112]將光誘導(dǎo)的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷應(yīng)用于谷氨酸棒狀桿菌的tac表達(dá)模塊中，使瓦倫烯產(chǎn)量大幅度提升。此外，在誘變技術(shù)上，室溫常壓等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）介導(dǎo)的誘變技術(shù)已成為了菌種改良的新型誘變工具[113]，其可瞬間破壞DNA鏈，避免了對(duì)熱敏微生物的潛在熱損傷[114]。Li Yuncheng等[115]利用ARTP系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)酯酵母進(jìn)行誘變處理，最終使其總酯含量比野生型菌株高1.4 倍左右。此外，與香氣化合物密切相關(guān)的閾值問題同樣值得關(guān)注。例如，酸奶中的乙醛質(zhì)量濃度低于8.0 mg/kg會(huì)使風(fēng)味變?nèi)酰^高時(shí)又會(huì)產(chǎn)生澀味[116]。乙酸乙酯通常具有較低的氣味閾值，有學(xué)者通過在酵母基因組中的相關(guān)代謝基因前后插入磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK1）基因啟動(dòng)子和終止子來修飾靶基因的表達(dá)強(qiáng)度，提升了乙酸乙酯滴度[117]。Darsonval等[118]將克隆的EstA2等相關(guān)基因在Oenococcus.oeni菌株中表達(dá)，使葡萄酒中合成的乙酸異丁酯低于閾值以達(dá)到較好風(fēng)味。

原生質(zhì)體融合也是菌種改良常見的手段，通過兩個(gè)或兩個(gè)以上不相容物種的快速組合，從而得到親本菌株特征被改進(jìn)后的新重組菌株以提高香氣化合物的產(chǎn)量。Lin Lucheng等[119]將3 株酵母菌經(jīng)兩輪原生質(zhì)體融合后得到融合菌株，發(fā)酵轉(zhuǎn)化后得到的2-苯乙醇滴度高于親本，達(dá)4.31 g/L。Xin Yi等[120]將菌株酵母菌株Et20和CTZ30通過原生質(zhì)體融合產(chǎn)生酵母雜交種，其發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味化合物總含量比原來高19.99%～26.55%。

針對(duì)傳統(tǒng)方法突變隨機(jī)和不定向性的缺點(diǎn)，近年來，使用現(xiàn)代基因工程技術(shù)對(duì)原生菌細(xì)胞進(jìn)行定向改造的代謝工程漸成菌種改良的熱點(diǎn)方向。通過增加前體供應(yīng)、過度表達(dá)或提高瓶頸酶的效率、引入關(guān)鍵酶并優(yōu)化表達(dá)、減少不需要的副產(chǎn)物或競(jìng)爭途徑的通量等手段提高產(chǎn)物滴定度或產(chǎn)量[121-122]。Chen Hefeng等[123]將瓦倫烯合酶引入釀酒酵母BJ5464，通過構(gòu)建啟動(dòng)子-終止子對(duì)優(yōu)化瓦倫烯合酶表達(dá)，提升了瓦倫烯的產(chǎn)量。異戊二烯是合成香料的重要中間體，有學(xué)者對(duì)工程異戊二烯生產(chǎn)菌株的關(guān)鍵酶IspG過表達(dá)，使異戊二烯產(chǎn)量增加30%，約為21 mg/L[124]。Lin Pocheng等[125]將香葉二磷酸合酶引入菌株SynechocystisPCC 6803，并對(duì)磷酸戊糖途徑中5-磷酸核糖異構(gòu)酶和核酮糖-5-磷酸3-二聚體酶基因過表達(dá)，最終將檸檬烯產(chǎn)量提高至6.7 mg/L。Furuya等[126]使用表達(dá)脫羧酶的大腸桿菌細(xì)胞將阿魏酸轉(zhuǎn)化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，再利用表達(dá)加氧酶的大腸桿菌細(xì)胞將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香蘭素，滴度達(dá)到7.8 g/L。利用代謝工程進(jìn)行合理菌株改良無疑是提高香氣化合物產(chǎn)量的一個(gè)有前途的工具。

3.2 生產(chǎn)及發(fā)酵工藝的改進(jìn)

發(fā)酵是通過微生物代謝獲得各種初級(jí)、次級(jí)代謝產(chǎn)物的過程，具有成本低、能耗低、環(huán)境污染小等顯著特點(diǎn)[127]。改進(jìn)發(fā)酵工藝中條件參數(shù)、操作方式是生產(chǎn)高質(zhì)量、高產(chǎn)量香氣化合物的重要保障。Zhang Wenqing等[128]以釀酒谷物改進(jìn)的Fuqu 培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌XJB-104，使得風(fēng)味化合物四甲基吡嗪的前體乙炔產(chǎn)量提高至5.23 g/kg。Saeed等[67]在以石榴皮為底物的發(fā)酵中，使用Enterobacter屬腸桿菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后香蘭素的產(chǎn)量達(dá)4.2 g/L。Nitta等[129]對(duì)菌株腸桿菌（Pantoea ananatis）IP04S/pBLAAaLINS-ispA采用“雙階段”補(bǔ)料分批發(fā)酵并優(yōu)化條件，提高了(S)-芳樟醇的生產(chǎn)效率。Shi Wenke等[130]采用畢赤酵母F2-24與釀酒酵母順序發(fā)酵，產(chǎn)生的葡萄酒酯類含量更高。Chen Li等[131]在反式二氫卡瓦酮的生產(chǎn)過程中，對(duì)發(fā)酵溫度、攪拌速度、檸檬烯濃度等優(yōu)化后，產(chǎn)量增加16 倍，達(dá)1 058 mg/L。Martínez等[132]以甘蔗渣為底物，接種菌株Kluyveromyces marxianu并提高還原糖的含量后香氣化合物總量增加了70%。Czajka等[133]利用對(duì)甘油、纈氨酸和異亮氨酸進(jìn)行優(yōu)化后的酵母-氮堿培養(yǎng)基培養(yǎng)β-胡蘿卜素菌株，最后生產(chǎn)的β-胡蘿卜素（紫羅蘭酮前體）滴度為1.26 g/L。Henke等[134]將十二烷改進(jìn)的兩相有機(jī)覆蓋培養(yǎng)基用于廣藿香醇生產(chǎn)的優(yōu)化，將廣霍香醇的滴度提高至60 mg/L。因此，除了獲得最優(yōu)良的菌株，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化改進(jìn)還可以控制生產(chǎn)成本、提質(zhì)增效，是提升微生物產(chǎn)香氣化合物最經(jīng)濟(jì)有效的方式。

4 結(jié)語

隨著消費(fèi)觀念的改變和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，人們對(duì)于綠色香氣化合物的需求不斷增加。在可持續(xù)發(fā)展成為全球發(fā)展戰(zhàn)略的今天，采用綠色技術(shù)從源頭上消除或減輕污染，已經(jīng)成為必然趨勢(shì)。利用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)香氣化合物具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物可降解、香味純正持久等明顯優(yōu)點(diǎn)，正在變成獲取高質(zhì)量、高附加值的香氣化合物的重要途徑，但由實(shí)驗(yàn)室層面轉(zhuǎn)變?yōu)槟墚a(chǎn)業(yè)化的生物技術(shù)存在著以下瓶頸[135-136]。1）尋找新的產(chǎn)香微生物仍然是未來需要關(guān)注的重點(diǎn)。微生物資源豐富，但目前進(jìn)入生產(chǎn)研究的種類還較少，需要擴(kuò)大篩選，挖掘更多的產(chǎn)香微生物。2）新微生物分離方法的應(yīng)用。目前產(chǎn)香微生物多采用常規(guī)分離，新的微生物分離技術(shù)如原位培養(yǎng)等相關(guān)研究依然不足。3）尋找適宜產(chǎn)業(yè)化的菌株是當(dāng)前階段的重點(diǎn)問題。香氣化合物作為次級(jí)代謝產(chǎn)物在野生菌株中濃度很低，如何充分利用基因工程、發(fā)酵工程等技術(shù)手段深入研究，加大與產(chǎn)業(yè)化對(duì)接仍然需要長期關(guān)注。4）微生物產(chǎn)香機(jī)制以及生物香氣化合物在相關(guān)行業(yè)中的應(yīng)用仍然需要持續(xù)探索。目前，用生物技術(shù)代替化學(xué)合成正在加速推進(jìn)，相信更符合綠色化學(xué)時(shí)代潮流的微生物制備香氣化合物將迎來美好的未來。