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    干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的肌原纖維蛋白氧化、滋味變化及其相關(guān)性分析

    2023-11-07 11:09:12岳宜靜臧明伍劉海杰成曉瑜
    食品科學(xué) 2023年19期
    關(guān)鍵詞:肌原纖維白對(duì)蝦鮮味

    岳宜靜,臧明伍,劉海杰,成曉瑜,*,趙 欣,王 樂(lè)

    (1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心,北京食品科學(xué)研究院,肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100068;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

    南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei),又名凡納濱對(duì)蝦、白對(duì)蝦,是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一,原產(chǎn)于美洲太平洋沿岸水域,20世紀(jì)80年代引入我國(guó),目前養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界首位[1]。南美白對(duì)蝦肉質(zhì)細(xì)膩有彈性、滋味鮮美,富含蛋白質(zhì)、多種維生素以及豐富的礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。

    隨著消費(fèi)者對(duì)南美白對(duì)蝦食用品質(zhì)要求的提高,在加工與貯藏期過(guò)程中滋味的保持尤為重要。滋味是消費(fèi)者對(duì)食物喜好判別的重要指標(biāo)之一,是一種經(jīng)舌頭上的味蕾傳輸?shù)酱竽X的味覺(jué)信息,一般認(rèn)為至少有5 種基本的味覺(jué)特征,分別為甜、咸、鮮、酸、苦[3]。舌頭感知到蝦的味覺(jué)特征通常由一些呈味的游離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸等物質(zhì)呈現(xiàn),研究者利用這些呈味物質(zhì)指標(biāo)評(píng)價(jià)滋味品質(zhì),從而達(dá)到篩選加工工藝、提升產(chǎn)品品質(zhì)的目的[4]。Bai Jing等[5]研究發(fā)現(xiàn)加熱處理后蝦中的游離氨基酸、核苷酸以及有機(jī)酸等呈味物質(zhì)含量發(fā)生變化,有利于蝦形成獨(dú)特的風(fēng)味。而在烤制前進(jìn)行煮沸、蒸煮或微波等預(yù)處理可以改善蝦制品的整體色澤、增加鮮味氨基酸含量[6]。熱風(fēng)微波聯(lián)合干燥促進(jìn)了南美白對(duì)蝦中滋味的形成,與鮮蝦相比,雖然干制后的南美白對(duì)蝦部分核苷酸含量和游離氨基酸干基總量下降,但味精當(dāng)量(equivalent umami concentration,EUC)卻更高,鮮味、滋味豐富度增加[7]。

    南美白對(duì)蝦富含豐富的蛋白質(zhì),在貯藏過(guò)程中極易受到環(huán)境的影響而發(fā)生蛋白氧化,肌原纖維蛋白是肌肉蛋白的主要組成成分,其氧化引發(fā)的蝦及制品品質(zhì)的劣變逐漸受到關(guān)注。蛋白氧化既包括蛋白質(zhì)大分子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生的氧化還原反應(yīng),也包括多肽和游離氨基酸發(fā)生的氧化還原反應(yīng)[8]。即食日本沼蝦貯藏過(guò)程中羰基含量和自由基含量增加且質(zhì)構(gòu)品質(zhì)不斷劣變[9];南美白對(duì)蝦在熱風(fēng)干制過(guò)程中蛋白的氧化變性顯著影響蝦的硬度、膠黏性和咀嚼性等質(zhì)地特性[10]。目前關(guān)于蛋白氧化對(duì)蝦品質(zhì)的影響研究主要集中在蝦肉質(zhì)構(gòu)特性方面,而對(duì)于滋味的研究較少。添加風(fēng)味酶能夠加速蛋白質(zhì)降解,增加草魚發(fā)酵中的游離氨基酸和核苷酸含量,進(jìn)而增加草魚的滋味和風(fēng)味[11]。蝦在貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生氧化降解,因此推測(cè)貯藏過(guò)程中的蛋白質(zhì)氧化也會(huì)對(duì)蝦的滋味產(chǎn)生影響。

    干制加工是南美白對(duì)蝦主要的加工方式之一,不僅可以抑制微生物生長(zhǎng)繁殖,提高產(chǎn)品的安全性和延長(zhǎng)貨架期,同時(shí)還能賦予蝦獨(dú)特的香氣、鮮甜的滋味以及更加豐富的口感[2],但干制加工產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中也會(huì)發(fā)生品質(zhì)劣變。目前對(duì)于南美白對(duì)蝦的研究多集中在不同加工方式對(duì)于其品質(zhì)的影響[12]和生鮮南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的品質(zhì)變化[13],但是對(duì)干制后的南美白對(duì)蝦在貯藏過(guò)程中的蛋白降解和氧化對(duì)滋味影響的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以干制南美白對(duì)蝦為研究對(duì)象,考察其在加速貯藏過(guò)程中蛋白氧化、降解及滋味的變化,并分析其相關(guān)性,以期為貯藏過(guò)程中基于蛋白氧化來(lái)改善干制南美白對(duì)蝦滋味的防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    南美白對(duì)蝦(濕質(zhì)量(30.5±2.4)g、長(zhǎng)17~18 cm),同批次購(gòu)買自北京北水食品工業(yè)有限公司,冷凍貯存。

    無(wú)機(jī)試劑(均為分析純)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇、乙醚、丙酮(均為分析純)北京市通廣精細(xì)化工公司;甲醇(色譜級(jí))美國(guó)賽默飛世爾科技公司;雷氏鹽(純度>93.0%)、5×蛋白上樣緩沖液(含二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT))北京索萊寶科技有限公司;甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品 壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;胞嘧啶核苷酸(cytidine monophosphate,CMP)、腺嘌呤核苷酸(adenosine monophosphate,AMP)、次黃嘌呤核苷酸(inosinemonphosphate,IMP)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(guanosine monophosphate,GMP)、次黃嘌呤(hypoxanthine,Hx)標(biāo)準(zhǔn)品、R21256雙縮脲蛋白定量試劑盒 上海源葉生物科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CM-700d型色差儀 日本KONICA MINOLTA公司;AM-10型勻漿機(jī) 日本精機(jī)制作所;Nicolet iS10傅里葉變換紅外變換光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;FS5熒光分光光度計(jì) 英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司;E2695液相色譜儀(2998紫外檢測(cè)器)美國(guó)沃特世公司;L-8900型氨基酸全自動(dòng)分析儀 日本HITACHI公司;TS-5000Z味覺(jué)分析系統(tǒng)(電子舌)日本INSENT公司。

    1.3 方法

    1.3.1 干制南美白對(duì)蝦的制備和加速貯藏

    將冷凍的南美白對(duì)蝦在4 ℃解凍后,以m(蝦)∶m(水)=1∶2的量放置于沸水中保持3 min后將蝦撈出,冷卻至室溫后放入干燥箱(溫度60 ℃、相對(duì)濕度30%)中進(jìn)行16 h干制。干燥后將樣品進(jìn)行密封包裝并放入37 ℃保藏箱中加速貯藏[14],分別在第0、10、20、30、40天拍照并取樣。

    1.3.2 干制南美白對(duì)蝦色度測(cè)定

    采用色差儀測(cè)定粉碎后混勻樣品的色度[15],包括亮度L*、紅綠度a*、藍(lán)黃度b*值。重復(fù)測(cè)定15 次,按式(1)計(jì)算白度W。

    1.3.3 干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白的提取

    參考徐文雅等[10]的方法并稍作修改,將蝦去頭、尾、殼,蝦肉經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,蝦肉粉與10 mmol/L pH 7.00的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(0.10 mol/L NaCl)以1∶4(m/V)的比例混合,勻漿1 min,10 000×g冷凍離心10 min,棄去上清液留下沉淀。將沉淀重復(fù)上述操作3 次。最后的沉淀加入與前一步操作相同體積的緩沖液,勻漿1 min后用4 層紗布過(guò)濾,取濾液于10 000×g冷凍離心10 min,所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

    1.3.4 干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、總巰基含量、羰基含量和表面疏水性測(cè)定

    將肌原纖維蛋白溶解于20 mmol/L pH 7.0的PBS(0.60 mol/L NaCl)中,用雙縮脲蛋白定量試劑盒測(cè)定溶液中的蛋白質(zhì)量濃度。干制南美白對(duì)蝦的肌原纖維蛋白總巰基含量、羰基含量以及表面疏水性分別參考胡熠[16]、趙冰[17]、賈娜[18]等的方法進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.5 干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量測(cè)定

    將提取的肌原纖維蛋白凍干后,用傅里葉變換紅外變換光譜儀進(jìn)行掃描測(cè)定。參考陳旭等[19]的方法并對(duì)測(cè)定參數(shù)稍作修改,光譜掃描范圍400~4 000 cm-1,分辨率4 cm-1,信噪比50 000∶1,掃描64 次[19]。通過(guò)Peakfit 4.0軟件解析后計(jì)算出各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

    1.3.6 干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白熒光吸收強(qiáng)度測(cè)定

    肌原纖維蛋白的熒光吸收強(qiáng)度測(cè)定參考陳旭等[19]的方法并稍作修改,取0.50 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其內(nèi)源熒光強(qiáng)度。測(cè)定條件為:25 ℃,激發(fā)波長(zhǎng)295 nm,發(fā)射波長(zhǎng)的掃描范圍300~400 nm,掃描速率1 000 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm。空白為20 mmol/L pH 7.0的PBS(0.60 mol/L NaCl)。

    1.3.7 干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

    參考李曉等[20]的方法并稍作修改,將2.00 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液與5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)按體積比1∶1的比例混合,沸水加熱5 min制得樣品。上樣量為10 μL,初始電壓為70 V,樣品進(jìn)入分離膠后電壓為110 V。電泳結(jié)束后剝離膠片,考馬斯亮藍(lán)染色30 min,溫水洗脫7 h,再用洗脫液洗脫15 min左右至底色脫凈后拍照分析。

    1.3.8 干制南美白對(duì)蝦甜菜堿含量測(cè)定

    參考Lengkidworraphiphat等[21]的方法并稍作修改,取1.00 g蝦粉加入10 mL蒸餾水,勻漿1 min,沸水浴1 h后于10 000×g、4 ℃離心,取上清液,再用25 mL乙醇洗滌沉淀,并于10 000×g、4 ℃離心取上清液,合并兩次上清液減壓旋蒸除去乙醇后定容至100 mL。配制15 g/L、pH 1.00的飽和雷氏鹽溶液,取1 mL樣品加入1 mL雷氏鹽溶液后用乙醚洗滌結(jié)晶,再取2 mL丙酮溶解結(jié)晶,最后用分光光度計(jì)測(cè)定溶解液在525 nm處的吸光度。取1 mL的0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)上述操作,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線??瞻捉M為蒸餾水。

    1.3.9 干制南美白對(duì)蝦游離氨基酸含量測(cè)定

    參考Camacho等[22]的方法并稍作修改,取1.00 g蝦粉加入15 mL 0.02 mol/L HCl溶液進(jìn)行均質(zhì),然后離心取上清液定容至50 mL,經(jīng)0.20 μm水相膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

    1.3.10 干制南美白對(duì)蝦核苷酸含量測(cè)定

    參考Bai Jing等[5]的方法并稍作修改,取5.00 g蝦粉加入50 mL體積分?jǐn)?shù)5%的高氯酸,混合液勻漿2 min后超聲5 min,于10 000×g、4 ℃離心取上清液,用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5~6.8左右,經(jīng)0.20 μm水相膜過(guò)濾后在液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件:流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為0.05 mol/L磷酸(用KOH調(diào)節(jié)pH值為7.00),V(A相)∶V(B相)=95∶5,流速1.0 mL/min,色譜柱溫度25 ℃。

    滋味活性值(taste active value,TAV)為呈味物質(zhì)含量與呈味物質(zhì)滋味閾值(IMP為25 mg/100 g,AMP為50 mg/100 g,GMP為12.5 mg/100 g)的比值。可采用EUC來(lái)評(píng)定鮮味程度[23],按式(2)計(jì)算。

    式中:1 218為協(xié)同常數(shù);ai為鮮味氨基酸的含量/(g/100 g);bi為鮮味氨基酸相當(dāng)于谷氨酸單鈉的鮮味系數(shù)(Glu為1.0,Asp為0.077);aj為呈味核苷酸的含量/(g/100 g);bj為呈味核苷酸相當(dāng)于IMP的鮮味系數(shù)(AMP為0.18,IMP為0.10,GMP為2.3)。

    1.3.11 干制南美白對(duì)蝦滋味評(píng)價(jià)

    參考Xu Xiaodi等[24]的方法并進(jìn)行修改,稱取10.00 g樣品加入100 mL蒸餾水均質(zhì),于10 000×g、4 ℃離心后取上清液,取65 mL左右上清液過(guò)濾后在電子舌儀器上進(jìn)行測(cè)定。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3 次以上取平均值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS Staistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA),顯著性檢驗(yàn)采用Duncan多重比較,P<0.05表示差異顯著,相關(guān)性分析采用皮爾遜系數(shù)雙尾檢驗(yàn)。使用Graphpad Prism 9軟件、chiplot(https://www.chiplot.online/)和MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)作圖。用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)探究呈味物質(zhì)和電子舌評(píng)價(jià)結(jié)果之間的相關(guān)性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的外觀和色度變化

    顏色是干制蝦最重要的品質(zhì)指標(biāo)之一,圖1A是貯藏過(guò)程中蝦外觀的變化,干制后的南美白對(duì)蝦色澤鮮亮,呈橘紅色,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),蝦的顏色逐漸變暗,在第40天時(shí)蝦肉變?yōu)樯詈稚?,品質(zhì)嚴(yán)重下降。圖1B色度的變化也得到同樣的結(jié)果,在貯藏過(guò)程中干制南美白對(duì)蝦的亮度L*值、白度W值逐漸下降并且各時(shí)間點(diǎn)差異性顯著(P<0.05),紅度a*值和黃度b*值初期有所上升但后期變化不顯著(P>0.05),表示不同貯藏時(shí)間的蝦外觀色澤有很大差異。生蝦煮熟后由于色素蛋白的變性和紅色色素的釋放,由青灰色變?yōu)槌燃t色[25]。干制脫水后仍保持著最初明亮的橙紅色,但是在貯藏過(guò)程中其顏色不斷劣變,由最初明亮的橙黃色變?yōu)楹旨t色,與Li Deyang等[25]在即食蝦貯藏過(guò)程中觀測(cè)到的顏色變化一致。干制南美白對(duì)蝦在貯藏過(guò)程中的顏色褐變可能與蛋白氧化、美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化有關(guān)[10,25]。

    圖1 干制南美白對(duì)蝦外觀(A)和蝦肉色度(B)的變化Fig.1 Changes in appearance (A) and color (B) of dried Penaeus vannamei

    2.2 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白氧化情況

    2.2.1 總巰基含量、羰基含量、表面疏水性的變化

    蛋白氧化程度可以用總巰基含量、羰基含量、表面疏水性來(lái)表征[26]。總巰基含量包括了蛋白質(zhì)表面和內(nèi)部的活性巰基,是一種親水基團(tuán),易被氧化為二硫鍵,總巰基含量越低說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化程度越高[26]。從圖2A中可以看出,在貯藏過(guò)程中干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白中的總巰基含量逐漸下降,是因?yàn)橘A藏過(guò)程中干制蝦肉的肌原纖維蛋白暴露出來(lái)的大量巰基易于受到氧自由基的攻擊,被氧化成為二硫鍵,引起蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),導(dǎo)致總巰基含量下降[27]。而在貯藏后期暴露在外的巰基含量減少,總巰基含量下降速率減慢。

    圖2 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白總巰基含量(A)、羰基含量(B)和表面疏水性(C)變化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content (A),carbonyl content (B) and surface hydrophobicity (C) of myofibrillar protein in dried Penaeus vannamei during storage

    蛋白質(zhì)分子被氧自由基修飾后易形成羰基,羰基含量是判斷蛋白質(zhì)受到氧化損傷程度的重要指標(biāo),羰基含量越高說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化程度越高[26]。如圖2B所示,在貯藏過(guò)程中蝦肉肌原纖維蛋白的羰基數(shù)量不斷上升,這表明貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)了蝦肉中蛋白質(zhì)的氧化。蝦肉中羰基含量持續(xù)性上升可能是由于蛋白質(zhì)降解,原本包裹在內(nèi)部的氨基酸暴露,外露的氨基酸側(cè)鏈被氧化,形成了更多的羰基,進(jìn)而導(dǎo)致羰基含量持續(xù)上升[27]。

    蛋白質(zhì)的表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面疏水性殘基的相對(duì)含量,根據(jù)每微克肌原纖維蛋白結(jié)合的溴酚藍(lán)質(zhì)量表示其表面疏水性大小[26]。由圖2C可知,在貯藏過(guò)程中蝦肉肌原纖維蛋白的表面疏水性逐漸增加。新鮮蝦肉的疏水氨基酸一般包裹于蛋白質(zhì)內(nèi)部,其表面疏水性較低,但隨著干制以及貯藏,蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)遭到破壞,內(nèi)部疏水基團(tuán)外露,從而增加其表面疏水性[28]。另外,表面疏水性越高說(shuō)明蛋白質(zhì)變性程度越大,蛋白質(zhì)正逐漸由有序變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài),結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定[28]。溫榮欣等[29]認(rèn)為疏水性氨基酸的暴露既促進(jìn)了蛋白質(zhì)的降解,導(dǎo)致小分子肽和游離氨基酸的生成,又增加了風(fēng)味載體蛋白在外露疏水區(qū)域的風(fēng)味結(jié)合點(diǎn)位。

    因此,總巰基含量、羰基含量、表面疏水性的變化可以綜合反映出貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)了干制南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白的氧化反應(yīng)。

    2.2.2 肌原纖維蛋白熒光吸收強(qiáng)度的變化

    蛋白質(zhì)中的色氨酸具有較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光[30],屬于疏水氨基酸,包裹于蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)被改變,以及蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露后才能被氧化。當(dāng)含有色氨酸殘基的蛋白質(zhì)暴露在親水環(huán)境中時(shí),熒光強(qiáng)度會(huì)顯著降低,熒光強(qiáng)度的降低說(shuō)明蛋白質(zhì)處于部分展開(kāi)或完全展開(kāi)狀態(tài)[31]。因此通過(guò)測(cè)量蛋白的熒光強(qiáng)度變化,可以推測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[30]。由圖3可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),不同貯藏時(shí)間的蝦肉肌原纖維蛋白在波長(zhǎng)340 nm左右處熒光強(qiáng)度逐漸減小,說(shuō)明蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,這可能是蛋白質(zhì)氧化程度增加導(dǎo)致的。

    圖3 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白熒光吸收強(qiáng)度變化Fig.3 Changes in fluorescence absorption intensity of myofibrillar protein in dried Penaeus vannamei during storage

    2.2.3 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

    如圖4A所示,1 600~1 700 cm-1處為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所在區(qū)域[30](β-折疊在1 600~1 640 cm-1、無(wú)規(guī)卷曲在1 640~1 650 cm-1、α-螺旋在1 650~1 660 cm-1、β-轉(zhuǎn)角在1 660~1 670 cm-1)。紅外光譜圖經(jīng)Peakfit 4.0軟件二階導(dǎo)數(shù)擬合和積分計(jì)算后,得到蝦肉肌原纖維蛋白的不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。從圖4B中可以看出,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),β-折疊相對(duì)含量有一定程度的增加,這可能是由于巰基氧化和二硫鍵的逐漸形成導(dǎo)致肽鏈折疊結(jié)構(gòu)改變[28];α-螺旋是一種穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu),其相對(duì)含量減少可能是由于氧化造成氫鍵斷裂,破壞了原本的螺旋結(jié)構(gòu)[28]。α-螺旋相對(duì)含量的減少和β-折疊相對(duì)含量的增加表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)正在由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài),與其表面疏水性增加的結(jié)果相一致。β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈減少趨勢(shì),也說(shuō)明了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)由有序狀態(tài)向松散狀態(tài)轉(zhuǎn)化[10]。

    圖4 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的傅里葉變換紅外光譜(A)和二級(jí)結(jié)構(gòu)(B)變化Fig.4 Changes in Fourier transform infrared spectrum (A) and secondary structures of myofibrillar protein (B) in dried Penaeus vannamei during storage

    2.2.4 肌原纖維蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

    如圖5所示,肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MHC)的分子質(zhì)量約為200 kDa,肌動(dòng)蛋白約40 kDa、原肌球蛋白約37 kDa、肌鈣蛋白約34 kDa[32]。MHC的條帶在干制第0天十分明顯,隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸變淺,在加速貯藏的第30天以后消失;肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白T的條帶隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)也逐漸變淺。以上結(jié)果與Fu Yuye等[33]的研究結(jié)果一致,說(shuō)明蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中正在發(fā)生氧化,大分子蛋白質(zhì)被降解為小分子蛋白質(zhì)、多肽,甚至被分解為氨基酸[33]。

    圖5 肌原纖維蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.5 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of myofibrillar protein

    2.3 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的呈味物質(zhì)變化

    2.3.1 甜菜堿含量變化

    甜菜堿又稱甘氨酸甜菜堿,是一種氨基酸衍生物,廣泛存在動(dòng)物、植物和微生物中,可保護(hù)細(xì)胞不受滲透壓變化的影響,是蝦類甜味的來(lái)源之一[34],同時(shí)能增加鮮味強(qiáng)度,常用在調(diào)味劑中以模仿海鮮的風(fēng)味[23]。由圖6可以看出,干制南美白對(duì)蝦中的甜菜堿含量在貯藏過(guò)程中逐漸減少,后期減少速率變慢,這與Zhang Rong等[35]報(bào)道的雙殼軟體動(dòng)物貯藏期間的甜菜堿含量變化趨勢(shì)一致,其含量減少可能是在貯藏過(guò)程中逐漸被氧化。甜菜堿是一種天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有較高的生物活性,有研究表明它可清除氧自由基,具有抵抗炎癥、預(yù)防心血管疾病等功能[36-38]。因此,貯藏過(guò)程中甜菜堿含量的減少不僅降低了干制蝦的甜鮮滋味,還造成了一定程度的營(yíng)養(yǎng)損失。

    圖6 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中甜菜堿含量變化Fig.6 Changes in betaine contents of dried Penaeus vannamei during storage

    2.3.2 游離氨基酸含量變化

    游離氨基酸是水產(chǎn)品中呈味的基礎(chǔ)物質(zhì),不同氨基酸呈現(xiàn)風(fēng)味不盡相同,相互協(xié)同后產(chǎn)生具有特征性的滋味感受[39]。由表1可以看出,隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng),Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe這幾種氨基酸的含量均呈下降趨勢(shì),Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Pro的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中Asp和Glu這兩種呈鮮味的氨基酸還會(huì)與核苷酸相互作用增強(qiáng)干制南美白對(duì)蝦的鮮味[30]。Arg雖然是一種苦味氨基酸,其含量占總游離氨基酸含量的20%左右,但其苦味可以被NaCl、谷氨酸掩蓋而增強(qiáng)甜度[39],因此也可能對(duì)甜味有貢獻(xiàn)。

    表1 干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的游離氨基酸含量變化Table 1 Changes in free amino acid contents of dried Penaeus vannamei during storage mg/100 g

    對(duì)不同呈味特點(diǎn)的游離氨基酸進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)后可以看出,不同貯藏時(shí)間干制蝦中3 類呈味氨基酸含量均為甜味>苦味>鮮味,鮮味游離氨基酸含量呈先增加后減少趨勢(shì),而甜味氨基酸的總含量呈下降趨勢(shì)。含量呈下降趨勢(shì)的游離氨基酸可能不穩(wěn)定,在長(zhǎng)時(shí)間加速貯藏的條件下氧化降解,特別是Cys、Tyr和Met對(duì)溫度敏感,容易氧化[39];而對(duì)于含量呈先上升后下降趨勢(shì)的游離氨基酸,可能一方面隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)氧化分解增加了其含量;另一方面,游離氨基酸會(huì)發(fā)生脫氨、脫羧等反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為烴、醛、胺等物質(zhì),從而使其含量降低[41]。在游離氨基酸中甜味氨基酸(Gly、Ala)的含量遠(yuǎn)高于其他氨基酸,占游離氨基酸總量55%左右,說(shuō)明甜味氨基酸在游離氨基酸中對(duì)干制南美白對(duì)蝦的滋味貢獻(xiàn)較大。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),游離氨基酸總量呈下降趨勢(shì),這與Yin Mingyu等[39]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

    2.3.3 核苷酸含量變化

    除了游離氨基酸,海產(chǎn)品滋味通常認(rèn)為與核苷酸含量相關(guān)。水產(chǎn)品在死后體內(nèi)ATP存在兩種代謝途徑,一種是ATP-二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)-AMP-腺苷(adenosine,AdR)-次黃嘌呤核苷(hypoxanthine riboside,HxR)-Hx,這種途徑容易積累AMP;另一種是ATP-ADP-AMP-IMP-HxR-Hx,這種途徑易積累IMP[42]。從表2中可以看出,IMP的含量遠(yuǎn)高于AMP,說(shuō)明在干制南美白對(duì)蝦中的ATP主要是以第二種途徑代謝的。Xu Xiaodi等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小龍蝦中的IMP含量遠(yuǎn)大于AMP含量,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。AMP在低含量(<50~100 mg/100 g)時(shí)具有甜味,沒(méi)有鮮味[24]。此外IMP和AMP存在協(xié)同效應(yīng),當(dāng)IMP存在時(shí),AMP會(huì)表現(xiàn)出鮮味,并且甜味也會(huì)增強(qiáng),IMP和AMP還可以與氨基酸協(xié)同作用增加干制蝦鮮味[40]。IMP和GMP可在海產(chǎn)品、肉制品中產(chǎn)生強(qiáng)烈鮮味[24]。在干制南美白對(duì)蝦中IMP含量較高并且其TAV大于1(表3),說(shuō)明在干制南美白對(duì)蝦中的主要鮮味核苷酸來(lái)源是IMP。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),IMP含量先增加并在加速貯藏第10天達(dá)到最大,然后又逐漸降低,說(shuō)明干制南美白對(duì)蝦貯藏前期的鮮味得到提升。Hx是ATP的最終降解產(chǎn)物,這類產(chǎn)物的大量積累會(huì)給水產(chǎn)品帶來(lái)苦味和其他不愉快的味道[24]。由表2可知,Hx的含量在貯藏前期增長(zhǎng),后期無(wú)顯著性變化(P>0.05),這符合ATP的代謝規(guī)律,也反映了貯藏對(duì)干制蝦滋味的負(fù)面影響。通過(guò)計(jì)算貯藏南美白對(duì)蝦中的EUC可知,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),其EUC先升高后降低,說(shuō)明貯藏期間其鮮味先是得到了提升后又逐漸減弱,與上述鮮味游離氨基酸含量變化趨勢(shì)一致。

    表2 干制南美白對(duì)蝦貯藏期間的核苷酸和EUCTable 2 Changes in nucleotide contents and equivalent umami concentration in dried Penaeus vannamei during storage

    表3 干制南美白對(duì)蝦貯藏期間的核苷酸TAVTable 3 Taste active value values of nucleotides in dried Penaeus vannamei during storage

    2.3.4 電子舌表征滋味的結(jié)果

    電子舌傳感器系統(tǒng)由甜味(GL1)、苦味(C00)、咸味(CT0)、鮮味(AAE)、酸味(CA0)5 個(gè)傳感器組成[43]。其中甜味、苦味、咸味、鮮味為綜合味覺(jué)特點(diǎn),而豐富度(即鮮味回味)為持續(xù)性味覺(jué)特點(diǎn)[43]。電子舌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以各個(gè)傳感器的味覺(jué)強(qiáng)度表示,由KCl和酒石酸組成的對(duì)照溶液的味覺(jué)強(qiáng)度為無(wú)味點(diǎn),咸味的無(wú)味點(diǎn)為-6,其他風(fēng)味的無(wú)味點(diǎn)為0[43]。通過(guò)計(jì)算各個(gè)傳感器的味覺(jué)強(qiáng)度,建立不同貯藏時(shí)間干制南美白對(duì)蝦的滋味雷達(dá)圖(樣品的酸味強(qiáng)度均低于無(wú)味點(diǎn),即沒(méi)有酸味)。從圖7中可以看出,干制南美白對(duì)蝦的鮮味和豐富度最為突出,說(shuō)明其具有強(qiáng)烈而持續(xù)的鮮味口感。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),鮮味、甜味強(qiáng)度降低,苦味強(qiáng)度逐漸升高,咸味強(qiáng)度無(wú)明顯變化,這可能是游離氨基酸、核苷酸以及甜菜堿綜合作用的結(jié)果,并且甜味強(qiáng)度與甜菜堿的含量變化趨勢(shì)相同。豐富度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì),與鮮味氨基酸和IMP含量變化趨勢(shì)一致,表明在貯藏前期干制南美白對(duì)蝦的滋味差別不大,而長(zhǎng)時(shí)間貯藏則會(huì)導(dǎo)致滋味劣變。

    圖7 不同貯藏時(shí)間干制南美白對(duì)蝦的電子舌分析雷達(dá)圖Fig.7 Radar plot of electronic tongue data of dried Penaeus vannamei at different storage times

    2.4 相關(guān)性分析

    2.4.1 肌原纖維蛋白氧化與呈味物質(zhì)含量相關(guān)性分析

    總巰基含量越低、羰基含量和表面疏水性越高,表示蛋白氧化程度越高。從圖8A中可以看出,總巰基含量與貯藏時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.97,P<0.05),羰基含量(r=0.99,P<0.05)、表面疏水性(r=0.94)與貯藏時(shí)間呈正相關(guān),說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白氧化程度加深。核苷酸中,僅AMP(r=0.64)和Hx(r=0.77)含量與貯藏時(shí)間呈正相關(guān);鮮味氨基酸含量與貯藏時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05),其他呈味物質(zhì)含量則與貯藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),呈味物質(zhì)含量減少。

    圖8 肌原纖維蛋白氧化與呈味物質(zhì)含量的相關(guān)性熱圖(A)、呈味物質(zhì)含量變化與電子舌分析結(jié)果的相關(guān)性熱圖(B)、呈味物質(zhì)含量與電子舌結(jié)果的OPLS-DA載荷散點(diǎn)圖(C)和肌原纖維蛋白氧化與電子舌分析結(jié)果的相關(guān)性熱圖(D)Fig.8 Heatmap of correlation between myofibrillar protein oxidation and taste substance contents (A),heatmap of correlation between changes in taste substance contents and results of electronic tongue analysis(B),taste substance and electronic tongue results’ loadings scatter plot of OPLS-DA (C) and heatmap of correlation between myofibrillar protein oxidation and results of electronic tongue analysis (D)

    2.4.2 呈味物質(zhì)含量與電子舌分析結(jié)果相關(guān)性分析

    從圖8B可以看出,貯藏時(shí)間和鮮味、甜味、咸味強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.84、-0.97、-0.78),和苦味強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.94)。甜菜堿含量與鮮味、甜味和咸味強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.96、0.98、0.91),與苦味強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.97,P<0.05),表明甜菜堿含量對(duì)干制南美白對(duì)蝦的滋味影響是積極的。IMP、GMP、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均與鮮味、甜味和咸味強(qiáng)度呈正相關(guān),對(duì)干制南美白對(duì)蝦的滋味影響是正向的。而AMP、Hx含量與苦味氨基酸含量呈正相關(guān),與鮮味、甜味和咸味強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān),其對(duì)于樣品滋味會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。鮮味氨基酸含量?jī)H與豐富度呈正相關(guān),這可能是由于干制蝦的滋味體系是眾多不同呈味物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

    采用OPLS-DA分析研究了呈味物質(zhì)含量與電子舌呈味結(jié)果的相關(guān)性。呈味物質(zhì)含量和滋味強(qiáng)度處于同一象限表示其具有正相關(guān)性。如圖8C所示,甜菜堿含量與鮮味、甜味和咸味強(qiáng)度具有正相關(guān)性,苦味強(qiáng)度和AMP、Hx含量呈正相關(guān),而豐富度與甜味氨基酸、苦味氨基酸、IMP、GMP含量具有正相關(guān)關(guān)系。

    2.4.3 肌原纖維蛋白氧化與電子舌結(jié)果相關(guān)性分析

    從圖8D中可知,羰基含量與鮮味強(qiáng)度(r=-0.78)、甜味強(qiáng)度(r=-0.94)、咸味強(qiáng)度(r=-0.71)和豐富度(r=-0.32)呈負(fù)相關(guān),與苦味強(qiáng)度(r=0.89)呈正相關(guān);表面疏水性與鮮味強(qiáng)度(r=-0.73)、甜味強(qiáng)度(r=-0.88)、咸味強(qiáng)度(r=-0.67)和豐富度(r=-0.51)呈負(fù)相關(guān),與苦味強(qiáng)度(r=0.77)呈正相關(guān),表明肌原纖維蛋白氧化程度與干制南美白對(duì)蝦的鮮味、甜味、咸味強(qiáng)度和豐富度呈負(fù)相關(guān),與苦味強(qiáng)度呈正相關(guān)。這說(shuō)明在干制南美白對(duì)蝦中,肌原纖維蛋白氧化對(duì)滋味產(chǎn)生負(fù)面影響,在加速貯藏過(guò)程中,隨著蛋白的不斷氧化,干制南美白對(duì)蝦的滋味逐漸劣變。

    3 結(jié)論

    本研究測(cè)定了干制南美白對(duì)蝦貯藏過(guò)程中的色澤變化、肌原纖維蛋白氧化程度、呈味物質(zhì)含量和電子舌表征的滋味情況,并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)性分析。加工表明,干制蝦在貯藏期間顏色變暗,肌原纖維蛋白氧化程度不斷加深,呈味物質(zhì)含量發(fā)生變化,滋味鮮美度不斷下降(鮮味、甜味強(qiáng)度減弱,苦味強(qiáng)度增強(qiáng),咸味強(qiáng)度無(wú)明顯變化)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,干制南美白對(duì)蝦中肌原纖維蛋白的氧化與干制南美白對(duì)蝦的鮮味、甜味、咸味強(qiáng)度和豐富度呈負(fù)相關(guān),與苦味強(qiáng)度呈正相關(guān),說(shuō)明在貯藏過(guò)程中蛋白氧化會(huì)使干制蝦的滋味劣變。對(duì)于提升干制南美白對(duì)蝦的貯藏品質(zhì)的調(diào)控方法還有待進(jìn)一步研究。

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