鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成和小腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性比較

劉銀媛，王寒梅，逯良忠，沈金華，楊 穎，趙 雪,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中海海洋科技股份有限公司，山東 青島 266000）

腸道不僅具有消化吸收功能，還是機(jī)體最大的“天然免疫器官”[1]。腸黏膜自身的結(jié)構(gòu)和功能以及其內(nèi)部大量的有益微生物[2]構(gòu)成了強(qiáng)大的腸道黏膜屏障系統(tǒng)，它可以維持腸道功能的穩(wěn)定，保護(hù)宿主免受具有致病能力的毒素和微生物的入侵[3]。研究證明，化學(xué)藥物造成腸道黏膜免疫系統(tǒng)損傷后，會(huì)造成腸道炎癥和全身炎癥反應(yīng)[4]，從而引起腹瀉、腸炎和全身免疫低下，這會(huì)導(dǎo)致死亡率升高[5]。環(huán)磷酰胺是一種常用的化療藥物[6]，廣泛用于治療血液惡性腫瘤和各種上皮腫瘤[7]。然而大劑量的環(huán)磷酰胺會(huì)損傷胃腸黏膜，從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫缺陷[8]，并增加繼發(fā)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)安全有效的免疫調(diào)節(jié)劑以減輕環(huán)磷酰胺對(duì)腫瘤患者腸道免疫的損傷具有重要的意義。

目前從大豆、三文魚、小麥、乳清和膠原蛋白中發(fā)現(xiàn)了很多具有免疫調(diào)節(jié)活性的多肽[9]。Li Qiqi等[10]報(bào)道鱈魚肽能夠改善環(huán)磷酰胺造成的腸道免疫抑制，提高腸黏膜免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）以及相關(guān)免疫因子的分泌。Wen Lingrong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白肽能夠很好地保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和腸黏膜免疫功能。此外，大豆蛋白肽還具有很好的降血脂[12]、降血糖[13]和神經(jīng)調(diào)節(jié)[14]等生物活性，因此在功能性食品和特醫(yī)食品中普遍使用。鳀魚（Engraulisjaponicus）是世界上單魚種年產(chǎn)量最高的魚類[15]，但是目前鳀魚大多僅被簡(jiǎn)單加工成低值的魚糜和魚粉[16]。鳀魚中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～20%[17]，其可為蛋白肽的開發(fā)提供豐富、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)資源。有研究發(fā)現(xiàn)，鳀魚蛋白水解物可顯著減輕動(dòng)脈粥樣硬化[18]及巨噬細(xì)胞RAW264.7的氧化應(yīng)激[19]，而鳀魚蛋白肽在腸道免疫調(diào)節(jié)活性方面的研究還鮮有報(bào)道。目前鳀魚蛋白肽在多肽組成和生物活性方面的研究很少，因此限制了其在健康食品方面的應(yīng)用和開發(fā)。

本研究使用超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成差異，然后采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)腸黏膜免疫抑制小鼠模型[20]，以大豆蛋白肽為對(duì)照，分析比較鳀魚蛋白肽與大豆蛋白肽對(duì)腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)的活性，以期為開發(fā)以鳀魚蛋白肽為主要功能成分的健康食品以及改善化療藥物所致的腸黏膜免疫損傷相關(guān)的特醫(yī)食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

6 周齡健康雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量為（20.0±2.0）g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（京）2020-0010。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±1）℃，相對(duì)濕度為40%～50%，實(shí)驗(yàn)期間采用12/12 h明暗交替，小鼠均自由飲食飲水。本研究中所有方案和程序均符合中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定（倫理審查編號(hào)：20100409291）。

鳀魚蛋白肽 中海海洋科技有限公司；大豆蛋白肽山東天驕生物技術(shù)股份有限公司；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺、胸腺肽腸溶片 阿拉丁試劑（上海）有限公司；干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4、IL-13、SIgA、IgA試劑盒 上海泛柯生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）All-In-One 5× RT Master Mix試劑盒、BlastaqTMGreen 2× PCR Master Mix試劑盒 加拿大Applied Biological Materials Inc公司；PCR引物 上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Ultimate 3000超高效液相色譜-Q-Exactive四極桿-軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Powerwave XS酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；Nano-1000微量分光光度計(jì)杭州奧盛儀器有限公司；FQD-96A qPCR儀 杭州博日科技股份有限公司；Ni-E電子熒光顯微鏡 日本尼康公司；KZ-III-F高速低溫組織研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的制備

以鳀魚為原料，采用壓榨脫油、水洗脫鹽、水提取蛋白、中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解，然后分別用100 Da和800 Da超濾膜超濾，收集100～800 Da組分為鳀魚蛋白肽。以大豆為原料，采用水提取蛋白、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解，然后用1 000 Da超濾膜超濾，收集小于1 000 Da組分為大豆蛋白肽。

經(jīng)測(cè)定，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于90%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%，礦物質(zhì)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別約為2.5%和3.4%。

1.3.2 蛋白肽的分子質(zhì)量和氨基酸組成分析

采用高效凝膠排阻色譜儀分析蛋白肽的分子質(zhì)量。色譜條件：色譜柱為TSK gel G2000 swxl（300 mm×7.8 mm，8 μm ）；流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（三氟乙酸）∶V（水）＝300∶1∶700；檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm；流速為0.5 mL/min；溫度為35 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL。使用GPC軟件（美國(guó)安捷倫公司）處理數(shù)據(jù)。

氨基酸組成參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，采用L8900全自動(dòng)氨基酸分析儀分析氨基酸組成。準(zhǔn)確稱量2 g樣品，加入15 mL 6 mol/L鹽酸溶液，110 ℃水解22 h。水解液5 000×g離心15 min，合并上清液，定容至50 mL。移取1 mL濾液至25 mL試管內(nèi)，50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，然后加入2 mL水，再次真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，加入1.0 mL pH 2.2檸檬酸鈉緩沖液溶解，振蕩混勻。吸取溶液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 蛋白肽的多肽組成分析

使用超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜分析蛋白肽產(chǎn)品中多肽的序列和含量。

色譜條件：色譜柱為C18柱（1.0 mm×150 mm，1.7 μm）；柱溫為40 ℃；流速為0.15 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；進(jìn)樣時(shí)間為50 min；流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸-乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相梯度為0～2 min 5% A，2～27 min 5%～10% A，27～37 min 10%～25% A，37～39 min 20%～80% A，39～42 min 80% A，42～43 min 80%～85% A，43～50 min 5% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子（electron spray ionization，ESI＋）模式；噴霧電壓為3.4 kV；在數(shù)據(jù)依賴性采集模式下，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為200～1 500。其他參數(shù)設(shè)置如下：1）一級(jí)質(zhì)譜條件：分辨率70 000；掃描阱容量為1×106；2）二級(jí)質(zhì)譜條件：分辨率17 500；掃描阱容量為1×105；每個(gè)采集循環(huán)中監(jiān)測(cè)的最強(qiáng)離子數(shù)為20；碰撞能量分別為20、35、45 eV；鞘氣（氮?dú)猓┝魉贋?0 Arb；輔助氣體流速為10 Arb；毛細(xì)管溫度為320 ℃；輔助氣體加熱溫度為300 ℃；信號(hào)強(qiáng)度閾值為1.6×105。采用提取離子流質(zhì)譜法分析多肽的相對(duì)含量。

采用Peaks Online 1.7軟件對(duì)超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲取蛋白肽中所有多肽的氨基酸序列。參數(shù)設(shè)置如下：母離子誤差范圍為1×10-5；子離子誤差范圍為0.02 Da；漏切位點(diǎn)為3；數(shù)據(jù)庫(kù)為Glycine max20220325.fasta（560 472 條，下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)）和Clupeiformes20220610.fasta（243 310 條，下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)）；平均局部置信度（average local confidence，ALC）≥50%，控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤1%。

根據(jù)每個(gè)多肽的單同位素峰計(jì)算多肽的實(shí)驗(yàn)分子質(zhì)量（mExp）、理論分子質(zhì)量（mTheor）和誤差。通過(guò)提取離子質(zhì)譜獲得每種多肽的離子強(qiáng)度峰面積，記錄為總離子強(qiáng)度。多肽的相對(duì)含量為每個(gè)多肽的總離子強(qiáng)度占所有多肽總離子強(qiáng)度的比例。采用Venny 2.1 BioinfoGP CNB-CSIC軟件對(duì)兩種蛋白肽產(chǎn)品的多肽組成進(jìn)行維恩分析。

1.3.4 動(dòng)物模型的建立

雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組，分別為：正常組、模型組、胸腺肽組、大豆蛋白肽組和鳀魚蛋白肽組，每組8 只。實(shí)驗(yàn)期間第1～30天正常組和模型組每日灌胃一次蒸餾水，胸腺肽組每日灌胃一次50 mg/kgmb劑量的胸腺肽腸溶片，鳀魚蛋白肽組和大豆蛋白肽組分別給予小鼠100、300 mg/kgmb和500 mg/kgmb的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽。每2 d稱一次小鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)的第31～32天小鼠（除正常組）每天腹腔注射一次50 mg/kgmb劑量的環(huán)磷酰胺，正常組小鼠注射等體積的無(wú)菌生理鹽水。在實(shí)驗(yàn)期間，觀察各組小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、毛色等。第32天夜間禁食不禁水12 h，第33天麻醉后摘眼球取血、脫頸椎處死小鼠；每只小鼠分別取脾臟和胸腺，用濾紙吸去表面水分后稱質(zhì)量。臟器指數(shù)按下式計(jì)算。

取小腸的空腸部分1～2 cm，于4%中性甲醛中固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。取約3 cm空腸段，稱質(zhì)量后置于EP管中，剪碎，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4，含0.01 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）），4 ℃下充分混合，并于4 ℃下5 000 r/min離心5 min，收集上清液為腸道黏膜液，置于-80 ℃保存，用于后續(xù)相關(guān)試劑盒測(cè)定。用錫箔紙將剩余的空腸包裹，置于-80 ℃液氮中保存，用于后續(xù)基因測(cè)定。

1.3.5 小腸組織形態(tài)學(xué)觀察

小腸的空腸部分使用4%多聚甲醛固定24 h后，流水沖洗組織上的多聚甲醛，采用70%～100%梯度乙醇進(jìn)行組織脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋。制備5 μm切片，進(jìn)行HE染色，使用電子熒光顯微鏡觀察其組織形態(tài)。

采用ImageJ軟件測(cè)量小腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度，并計(jì)算絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度比值；小腸絨毛高度為從絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離；小腸隱窩深度為從隱窩開口至隱窩基部的垂直距離。

1.3.6 小腸黏膜免疫因子和免疫球蛋白含量的測(cè)定

取腸道黏膜液，按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）法檢測(cè)小鼠小腸黏膜中免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13和免疫球蛋白IgA、SIgA的含量。

1.3.7 TLRs/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)量的測(cè)定

采用qPCR法檢測(cè)Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)量。使用TRIzol試劑提取小鼠空腸組織總RNA，采用Nano-1000微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。采用All-In-One 5xRT master Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模版進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系20 μL，包括BlastaqTMGreen 2× qPCR Master Mix 10 μL，cDNA樣品3 μL，各基因?qū)?yīng)上游引物與下游引物各0.5 μL，無(wú)酶水（diethypyrocarbonate，DEPC）6 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃沿伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS Statistics 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）進(jìn)行組間差異比較，以P＜0.05表示差異顯著。采用Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白肽多肽組成分析

在前期研究中，為了提高蛋白肽的得率，本課題組對(duì)鳀魚蛋白和大豆蛋白的水解條件進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白使用中性蛋白酶和堿性蛋白酶水解的得率最高，而大豆蛋白肽使用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解的得率最高。因此，以提高蛋白肽得率為目標(biāo)，篩選出降解鳀魚蛋白和大豆蛋白的最佳條件，獲得了兩種不同的蛋白肽產(chǎn)品（文章未發(fā)表）。如圖1和表2所示，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的重均分子質(zhì)量分別為264.150 Da和413.124 Da，鳀魚蛋白肽的重均分子質(zhì)量小于大豆蛋白肽。鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽均含有人體所需的8 種必需氨基酸（賴氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸（Met）、蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和纈氨酸（Val））。鳀魚蛋白肽中谷氨酸（16.95%）、丙氨酸（12.00%）、賴氨酸（9.82%）、色氨酸（6.56%）和谷氨酸（16.95%）相對(duì)含量較高，而大豆蛋白肽中亮氨酸（8.08%）、天冬氨酸（9.40%）、亮氨酸（8.08%）、精氨酸（7.17%）和苯丙氨酸（6.35%）相對(duì)含量較高。大豆蛋白肽中天冬氨酸、酪氨酸和精氨酸相對(duì)含量遠(yuǎn)高于鳀魚蛋白肽，丙氨酸和色氨酸相對(duì)含量遠(yuǎn)低于鳀魚蛋白肽。

圖1 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的凝膠排阻色譜圖Fig.1 Gel exclusion chromatogram of peptides from E.japonicus and Glycine max

表2 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的分子質(zhì)量及氨基酸組成Table 2 Molecular masses and amino acid compositions of peptides from E.japonicus and G.max

采用超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜對(duì)蛋白肽進(jìn)行分析，利用Peaks Online 1.7軟件分析蛋白肽產(chǎn)品中所有多肽的序列和相對(duì)含量。超高效液相色譜能夠?qū)? 000 條多肽進(jìn)行分離，四極桿-軌道阱超高分辨質(zhì)譜可檢測(cè)總離子強(qiáng)度為4.79×103～2.67×108的所有多肽。根據(jù)多肽的二級(jí)質(zhì)譜，本研究從鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中分別解析出5 680 條和7 666 條多肽的準(zhǔn)確序列。根據(jù)維恩分析，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中多肽組成的差異如圖2和表3所示。分析發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白肽總肽段為5 680 條，2～5肽占比為65.05%；大豆蛋白肽總肽段為7 666 條，2～5肽占比（50.69%）低于鳀魚蛋白肽，10肽以上的多肽占比（9.76%）高于鳀魚蛋白肽（4.30%）。兩種蛋白肽產(chǎn)品中相同的肽段為1 325 條（占比為11.0%），其中97.9%為2～5肽。鳀魚蛋白肽中有4 355 條多肽段是其獨(dú)有的，大豆蛋白肽中有6 341 條多肽段是其獨(dú)有的。

圖2 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成維恩圖Fig.2 Venn diagram of peptide compositions of peptides from E.japonicus and G.max

表3 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成比較Table 3 Composition analysis of peptides from E.japonicus and G.max

由表4可知，鳀魚蛋白肽中相對(duì)含量較高的多為2～5肽，還有少量的10肽、11肽。而大豆蛋白肽中相對(duì)含量較高的多為10肽以上的多肽，與分子質(zhì)量分析結(jié)果相印證。本研究結(jié)果說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽種類和相對(duì)含量有很大不同。

表4 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中相對(duì)含量最高的15 個(gè)多肽的序列和質(zhì)譜解析Table 4 Sequence and mass spectral analysis of 15 fractions with the highest relative content in peptides from E.japonicus and G.max

2.2 蛋白肽對(duì)小鼠體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響

分別給予小鼠100、300 mg/kgmb和500 mg/kgmb的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽30 d后，發(fā)現(xiàn)300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽和500 mg/kgmb大豆蛋白肽組小鼠的活動(dòng)量增多，鼠毛光澤較好；而100 mg/kgmb鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽組小鼠的生命力均較差。如圖3所示，通過(guò)觀察HE切片可以發(fā)現(xiàn)，300 mg/kgmb和500 mg/kgmb的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小腸黏膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果都較好，沒有明顯差異。100 mg/kgmb的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽組小鼠的腸黏膜損傷仍比較嚴(yán)重。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用300 mg/kgmb劑量的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽，比較兩種不同蛋白肽的腸黏膜免疫調(diào)節(jié)作用。

圖3 不同劑量的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響（×200）Fig.3 Effects of different doses of peptides from E.japonicus and G.max on small intestinal mucosal histomorphology of mice (× 200)

在注射環(huán)磷酰胺前，各組小鼠均反應(yīng)靈敏、精神狀態(tài)良好、鼠毛光亮。如圖4所示，正常組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)緩慢上升，而注射環(huán)磷酰胺的模型組小鼠體質(zhì)量明顯低于正常組，同時(shí)觀察到小鼠懶惰、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)量減少、鼠毛無(wú)光澤。與正常組小鼠相比，模型組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠機(jī)體和免疫器官造成了損傷。補(bǔ)充300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽/大豆蛋白肽30 d后，雖然小鼠的體質(zhì)量與模型組相比沒有明顯差異，但是其活動(dòng)量增加、鼠毛光澤較好。與模型組相比，大豆蛋白肽可顯著提高小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)（P＜0.05）；鳀魚蛋白肽可顯著提高小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05），但對(duì)胸腺指數(shù)沒有顯著影響，說(shuō)明灌胃鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽可以減輕環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫器官損傷。

圖4 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小鼠體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響（n＝8）Fig.4 Effects of peptides from E.japonicus and G.max on the body mass and immune organ indexes of mice (n=8)

2.3 蛋白肽對(duì)小鼠小腸黏膜組織形態(tài)的影響

如圖5所示，正常組小鼠小腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊且連接緊密。而模型組小鼠小腸絨毛矮短、松散，間隙增大，有些絨毛甚至斷裂、脫落；同時(shí)絨毛長(zhǎng)度和絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度值顯著降低（P＜0.05），而隱窩深度顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。與模型組相比，300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽組與大豆蛋白肽組小鼠的小腸絨毛結(jié)構(gòu)有所改善，絨毛長(zhǎng)度顯著增加而且排列較整齊，絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度顯著增加（P＜0.05），隱窩深度顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明補(bǔ)充鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽可以改善環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)的損傷，維持小腸的正常組織結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能，且鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小腸黏膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)效果并沒有顯著差異。

圖5 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響（n＝8）Fig.5 Effects of peptides from E.japonicus and G.max on small intestinal mucosal histomorphology of mice (n=8)

2.4 蛋白肽對(duì)小鼠小腸黏膜相關(guān)免疫因子表達(dá)的影響

小腸免疫體統(tǒng)中，T細(xì)胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13水平對(duì)腸黏膜的免疫功能非常重要[21]。如圖6所示，與正常組相比，模型組小鼠小腸免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽組和大豆蛋白肽組小鼠小腸免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.05），且與胸腺肽組接近。說(shuō)明環(huán)磷酰胺能顯著抑制T細(xì)胞產(chǎn)生相關(guān)免疫因子，而鳀魚蛋白肽與大豆蛋白肽可以改善環(huán)磷酰胺對(duì)免疫因子分泌的抑制。比較發(fā)現(xiàn)，鳀魚蛋白肽組TNF-α水平顯著高于陽(yáng)性對(duì)照胸腺肽組（P＜0.05），說(shuō)明鳀魚蛋白肽促進(jìn)TNF-α因子表達(dá)的效果更好。

圖6 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小腸黏膜免疫因子表達(dá)的影響（n＝8）Fig.6 Effects of peptides from E. japonicus and G. max on the contents of immune factors in small intestinal mucosa (n=8)

2.5 蛋白肽對(duì)小鼠小腸免疫球蛋白IgA和SIgA表達(dá)的影響

免疫球蛋白IgA和SIgA是腸道中含量最高的免疫球蛋白[22]，其含量可反映小腸黏膜獲得性免疫能力。如圖7所示，相比于正常組，模型組小鼠小腸黏膜中IgA和SIgA的表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽組和大豆蛋白肽組小鼠小腸黏膜中IgA和SIgA的表達(dá)水平均顯著高于模型組（P＜0.05）。說(shuō)明環(huán)磷酰胺會(huì)抑制小腸黏膜免疫球蛋白IgA和SIgA的產(chǎn)生，而鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽能夠改善環(huán)磷酰胺對(duì)IgA和SIgA的抑制。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，鳀魚蛋白肽組SIgA的表達(dá)水平顯著高于大豆蛋白肽組和胸腺肽組（P＜0.05），說(shuō)明鳀魚蛋白肽促進(jìn)腸黏膜免疫球蛋白SIgA表達(dá)的效果優(yōu)于大豆蛋白肽。

圖7 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小腸黏膜免疫蛋白表達(dá)的影響（n＝8）Fig.7 Effects of peptides from E.japonicus and G.max on immune-related protein expression in small intestinal mucosa (n =8)

2.6 蛋白肽對(duì)TLRs/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

TLR是先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的一種模式識(shí)別受體，它會(huì)與指定的分泌蛋白一起刺激下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而激活NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌[23]。如圖8所示，與正常組相比，模型組小腸中TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而大豆蛋白肽組和鳀魚蛋白肽組TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型組（P＜0.05），說(shuō)明補(bǔ)充大豆蛋白肽和鳀魚蛋白肽能夠改善環(huán)磷酰胺對(duì)TLR和NF-κB基因表達(dá)的抑制。比較發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白肽組和鳀魚蛋白肽組小鼠的TLR-4mRNA表達(dá)水平、鳀魚蛋白肽組小鼠的TLR-6mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組小鼠（P＜0.05），說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)TLR基因表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，但是二者對(duì)TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB基因表達(dá)的影響沒有顯著性差異。

圖8 鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)小腸TLRs/NF-κB通路相關(guān)因子基因表達(dá)的影響（n＝8）Fig.8 Effects of peptides from E.japonicus and G.max on the expression of genes associated with intestinal TLRs/NF-κB signaling pathway (n=8)

3 討論

目前市場(chǎng)上的蛋白肽產(chǎn)品種類很多，GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》只規(guī)定了這類產(chǎn)品的分子質(zhì)量和氨基酸組成，但是對(duì)不同蛋白來(lái)源的蛋白肽產(chǎn)品中多肽組成差異的研究還很少。高效液相色譜法是一種比較粗略的分析比較兩種蛋白肽分子質(zhì)量的方法，結(jié)果誤差比較大。而采用高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠準(zhǔn)確解析出兩種蛋白肽產(chǎn)品的多肽序列和每一種多肽占比的差異，其可為蛋白肽產(chǎn)品生物活性和產(chǎn)品質(zhì)量控制的研究提供依據(jù)。高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜技術(shù)是分析復(fù)雜的蛋白肽樣品中多肽組成的有效工具，反相色譜的有效分離和質(zhì)譜的二級(jí)碎裂有助于獲得肽組學(xué)分析核心數(shù)據(jù)[24]。多肽質(zhì)譜分析的難點(diǎn)在于鑒定復(fù)雜的生物樣品中幾千甚至幾萬(wàn)個(gè)長(zhǎng)短肽的序列和含量，而基于人工智能算法的PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái)解決了批量質(zhì)譜數(shù)據(jù)集高通量解析的難題。研究發(fā)現(xiàn)，與目前國(guó)際上其他算法平臺(tái)相比較，PEAKS Online平臺(tái)可以多解析出5%～30%的肽段序列，其將對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴性采集模式（data dependent acquisition，DDA）和數(shù)據(jù)非依賴性采集模式（data independent acquisition，DIA）數(shù)據(jù)的解析和挖掘能力提升到了一個(gè)全新的高度[25]。大豆蛋白肽和鳀魚蛋白肽分別屬于植物蛋白和動(dòng)物蛋白，為了揭示其多肽組成差異及與生物活性之間的關(guān)系，本研究采用超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái)，分析了酶解工藝制備的大豆蛋白肽和鳀魚蛋白肽中所有多肽的相對(duì)含量和序列。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白肽產(chǎn)品雖然分子質(zhì)量接近，但是多肽組成有很大的差異。從鳀魚蛋白肽中發(fā)現(xiàn)了5 680 條肽段，從大豆蛋白肽中發(fā)現(xiàn)了7 666 條肽段。大豆蛋白肽中2～5肽相對(duì)含量（50.69%）比鳀魚蛋白肽（65.05%）低，而10肽以上的多肽含量（9.76%）高于鳀魚蛋白肽（4.30%），說(shuō)明大豆蛋白肽分子質(zhì)量較大。大豆蛋白肽和鳀魚蛋白肽中相同的肽段有1 325 條，鳀魚蛋白肽中有4 355 條獨(dú)有的多肽，而大豆蛋白肽中有6 341 條獨(dú)有的多肽。比較相對(duì)含量最高的15 個(gè)多肽的序列和相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白肽中相對(duì)含量較高的多為2～5肽，而大豆蛋白肽中相對(duì)含量較高的多為10肽以上的多肽。說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽序列和組成比例也有很大的不同，本研究結(jié)果為鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽生物活性研究提供了依據(jù)，也為生產(chǎn)出高活性蛋白肽產(chǎn)品提供了可靠的質(zhì)量分析技術(shù)。

免疫調(diào)節(jié)肽中最常見的氨基酸殘基是疏水性氨基酸（包括Gly、Val、Leu、Pro和Phe）、Glu和Tyr[26]。文獻(xiàn)[27]結(jié)果表明，疏水性氨基酸與一個(gè)或多個(gè)Glu、Gln、Tyr、Trp、Cys、Asp和Asn的組合是免疫調(diào)節(jié)肽的優(yōu)選序列。根據(jù)這一原理將本研究中鑒定出的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)均為免疫調(diào)節(jié)肽。這一結(jié)果表明，免疫調(diào)節(jié)肽在本研究獲得的鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中占主導(dǎo)地位。它們的存在解釋了鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的腸黏膜免疫抑制小鼠的影響。

腸道是機(jī)體重要的防御屏障，腸黏膜是機(jī)體抵御病原微生物的第一道防線[28]。環(huán)磷酰胺易損傷自我更新的細(xì)胞（例如腸黏膜上皮細(xì)胞）[29]，因此快速生長(zhǎng)的腸絨毛最容易受到攻擊和損傷。而補(bǔ)充鳀魚蛋白肽與大豆蛋白肽（300 mg/kgmb）30 d均可以改善腸黏膜免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及環(huán)磷酰胺造成的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，使小腸絨毛排列更加整齊，與模型組相比絨毛長(zhǎng)度顯著增加，隱窩深度顯著降低，說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽可以改善環(huán)磷酰胺造成的小腸機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)的損傷，維持小腸的正常組織結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。

腸道黏膜免疫是腸道重要的防御屏障，免疫細(xì)胞（主要為T 細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子在維持腸黏膜系統(tǒng)的平衡中也起著重要作用[30]。輔助性T 細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α作為標(biāo)志性的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵[31]。Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-13可保護(hù)宿主免受細(xì)胞外病原體的侵襲[32]。Th1和Th2細(xì)胞互相協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)腸黏膜平衡，維持機(jī)體正常的黏膜免疫功能[33]。補(bǔ)充鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽可以很好地改善環(huán)磷酰胺對(duì)Th1和Th2細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-13的抑制，其中鳀魚蛋白肽組TNF-α的含量高于胸腺肽組，說(shuō)明鳀魚蛋白肽與大豆蛋白肽可以減輕環(huán)磷酰胺對(duì)Th1和Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)功能的抑制，促進(jìn)腸黏膜中免疫因子的產(chǎn)生。

SIgA 由多聚免疫球蛋白受體（polymeric immunoglobulin receptor，pIgR）、J-鏈和α-鏈組成，其由腸道上皮細(xì)胞分泌，是腸黏膜行使免疫屏障功能的主要因素[34]，其可在黏膜表面形成保護(hù)層，抵抗細(xì)菌、病毒和其他病原體的黏附，防止腸道感染的發(fā)生。免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IgA是腸道中含量最高的免疫球蛋白，其在內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)化成SIgA，也是腸道黏膜SIgA的主要組成成分[35]。本研究結(jié)果表明，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽改善了環(huán)磷酰胺對(duì)上皮細(xì)胞分泌免疫球蛋白IgA和SIgA的抑制，從而保護(hù)腸黏膜的獲得性免疫功能。Li Qiqi等[10]也發(fā)現(xiàn)鱈魚蛋白肽能夠改善環(huán)磷酰胺對(duì)免疫球蛋白的抑制。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，鳀魚蛋白肽促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞分泌SIgA的效果要優(yōu)于大豆蛋白肽，說(shuō)明不同的蛋白肽產(chǎn)品對(duì)免疫球蛋白表達(dá)量的影響有所不同。

TLR作為機(jī)體先天免疫的“哨兵”，其對(duì)應(yīng)的配體被識(shí)別時(shí)會(huì)觸發(fā)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和共刺激分子的轉(zhuǎn)錄激活，隨后啟動(dòng)對(duì)宿主存活至關(guān)重要的防御機(jī)制[36]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽組中TLR-4、TLR-6、TLR-9和NF-κB的基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，改善了環(huán)磷酰胺對(duì)TLRs/NF-κB信號(hào)通路的抑制作用，與免疫因子和免疫球蛋白IgA、SIgA表達(dá)量上調(diào)的結(jié)果相印證，說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽可以通過(guò)影響TLRs/NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)小腸中免疫因子和免疫球蛋白的分泌，從而保護(hù)小腸的免疫功能。

本研究發(fā)現(xiàn)鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽都有一定的腸道黏膜免疫保護(hù)活性，說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中都含有提高免疫力的多肽。但值得重視的是，兩種蛋白肽在調(diào)節(jié)腸免疫方面的活性和機(jī)制沒有明顯差異，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酶解物中多肽種類高達(dá)5 000～7 000 種，結(jié)合每種免疫多肽活性和含量綜合考慮，由多肽組成的混合物在保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)小鼠黏膜免疫活性方面并沒有明顯差異。本研究基于超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用的肽組成分析技術(shù)，為蛋白肽中免疫多肽的進(jìn)一步挖掘提供了有效的技術(shù)和方法，為發(fā)現(xiàn)更多不同的免疫活性肽提供了可能性，為生產(chǎn)出具有高免疫活性的蛋白肽產(chǎn)品提供指導(dǎo)。

目前大豆蛋白肽已經(jīng)廣泛應(yīng)用于健康食品和保健食品中，而鳀魚蛋白肽的研究和應(yīng)用較少。比較發(fā)現(xiàn)，鳀魚蛋白肽與大豆蛋白肽在調(diào)節(jié)腸免疫活性方面效果相似，說(shuō)明鳀魚蛋白肽在健康食品方面也具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景。

4 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-高分辨多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái)，研究鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽中多肽的序列和比例。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充300 mg/kgmb鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽30 d能夠減少環(huán)磷酰胺造成的小鼠體質(zhì)量下降，提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，保護(hù)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，上調(diào)小腸免疫因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-13和免疫球蛋白SIgA、IgA的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)TLRs/NF-κB信號(hào)通路中TLR（TLR-4、TLR-6、TLR-9）和NF-κB基因的表達(dá)，說(shuō)明鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽改善環(huán)磷酰胺引起腸黏膜損傷的作用機(jī)制與TLR介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。雖然鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽的多肽組成存在較大差異，但是活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鳀魚蛋白肽僅在促進(jìn)腸黏膜SIgA表達(dá)方面優(yōu)于大豆蛋白肽，鳀魚蛋白肽和大豆蛋白肽在改善環(huán)磷酰胺造成的腸黏膜損傷、免疫因子的表達(dá)、TLRs/NF-κB信號(hào)通路重要因子表達(dá)等方面并沒有明顯差異。