一株禽多殺性巴氏桿菌的分離鑒定

楊宗琛，胡巧云，王昌建，唐小明，王衛(wèi)國，彭志，謝怡靈，張坤，黎滿香，劉武函，唐亞新，范仲鑫※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 410007）

前言

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）在世界各個地區(qū)都有分布，是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的主要代表菌之一。Pm 是一種可以感染多種動物的細(xì)菌性病原體，可感染禽類動物包括雞、鴨、鵝、火雞等，致使產(chǎn)蛋率下降；可感染一些常見的家畜，例如豬、牛等，對這些動物的生命構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。在18 世紀(jì)中后葉，法國學(xué)者Chabert 和Mailer 在對該疾病進(jìn)行研究后，將其命名為“禽霍亂”[1]。禽霍亂的研究歷史已有100 多年，其傳播力、致病力嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[2]。

Pm 為革蘭氏陰性菌，需氧和兼性厭氧。形態(tài)多為短桿狀或球桿狀，芽孢和菌毛均不存在，菌體表面有莢膜。Pm 生長所需要的適宜酸堿度在7.2～7.6，溫度為37℃，可以在血平板、TSA 或者TSB 培養(yǎng)。多殺性巴氏桿菌為條件性致病菌，可存在于健康家禽的呼吸道中，當(dāng)環(huán)境或者其他原因引起家禽發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致其抵抗力下降時，就會引起禽霍亂的發(fā)生。急性型的禽霍亂發(fā)病非常迅速，明顯癥狀出現(xiàn)后在短時間內(nèi)就會死亡并且死亡率極高。慢性型的禽霍亂也會引起雞發(fā)病，并且使母雞的產(chǎn)蛋率大大下降。

目前對于Pm 主要是通過莢膜和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）來進(jìn)行分型，莢膜型可分為A、B、D、E、F 五種，脂多糖型可分為L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 八種[3]。禽霍亂、家兔巴氏桿菌病和牛呼吸系統(tǒng)病等疾病多為莢膜A 型引起；莢膜B型和E 型通常引發(fā)的疾病是牛出血性敗血癥；莢膜D 型和A 型會感染豬發(fā)生豬萎縮性鼻炎[4]。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜重要的組成成分，也是其主要的毒力因子，在感染宿主的過程中發(fā)揮重要的作用。本試驗(yàn)對湖南省某養(yǎng)雞場疑似禽霍亂的雞只進(jìn)行了解剖、病原菌的分離鑒定，通過16S rDNA 序列分析、莢膜和脂多糖PCR 分型研究了病原菌的生物學(xué)特性，以確定其致病病原。

1 材料

1.1 發(fā)病情況

湖南省某養(yǎng)雞場林下養(yǎng)雞500 余只，2023 年2月雞群開始陸續(xù)發(fā)病2 個月余，死亡200 多只。送檢發(fā)病雞3 只、病死雞3 只。

1.2 主要試劑及儀器

病毒DNA/RNA 提取試劑盒購自西安天隆科技有限公司，革蘭氏染色液購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，PCR 反應(yīng)所用HiFi PCR Super Mix、6× DNA loading Buffer、2 × Trans Taq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix I（-dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、接種培養(yǎng)液、全自動微生物鑒定藥敏分析儀（BD PhoenixTM M50）均購自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

在無菌的條件下取肝臟、肺臟和脾臟組織，用接種環(huán)接種在TSA 培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃條件下培養(yǎng)16 h；待長出單個菌落后，在無菌的條件下用接種環(huán)挑取菌落接種于新的TSA 中進(jìn)行純化培養(yǎng)12 h。重新長出菌落后，對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征。

2.2 細(xì)菌分離株的生化鑒定

采用全自動微生物鑒定與藥敏分析儀鑒定了48 項(xiàng)生化指標(biāo)。

2.3 細(xì)菌分離株16S rDNA 擴(kuò)增測序

無菌條件下，將TSA 中單個菌落用接種環(huán)接種到TSB 中，并放入37℃、220 r/min 恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)12 h，收集菌體，提取基因組核酸，將其作為模板，使用通用引物16S rDNA PCR 引物擴(kuò)增，引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增后取PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)，得到目的片段后送北京擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果在GenBank 中用BLAST 進(jìn)行序列比對并利用MEGA 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

表1 16S rDNA 引物序列信息

PCR 擴(kuò)增體系：2 × Trans Taq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板5 μL，ddH2O 5.5 μL。

PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共30 個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

2.4 莢膜與脂多糖分型

參考設(shè)計(jì)的莢膜分型引物（見表2）和脂多糖分型引物（見表3）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 多殺性巴氏桿菌莢膜分型引物

表3 多殺性巴氏桿菌脂多糖分型引物

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn)及剖檢癥狀

送檢的3 只發(fā)病雞表現(xiàn)不愿走動、被毛蓬亂、頭頸下垂、雞冠綿軟、肛門處有黃白色稀糞的癥狀。剖檢后，肝臟和肺臟發(fā)現(xiàn)明顯病變，胸腔中存在泡沫樣積液（見圖1）。

圖1 剖檢病理變化

3.2 細(xì)菌的分離純化及鏡檢

分離純化后的細(xì)菌在TSA 培養(yǎng)基培養(yǎng)12h 后生長出邊緣圓潤，表面光滑的乳白色半透明狀菌落（見圖2），經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，鏡下（×100）呈紅色短桿狀（見圖3）。

圖2 TSA 培養(yǎng)基培養(yǎng)12h

圖3 革蘭氏染色鏡檢（×100）

3.3 生化鑒定培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌鑒定儀鑒定：L -亮氨酸-AMC、多粘菌素E、多粘菌素B、P_BPHOBIS（PNP）磷酸鹽、DEDX－TROSE、蔗糖、ALPHA -酮戊二酸為陽性，其余指標(biāo)均為陰性（見表4），鑒定結(jié)果為多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida），可信值：99%。

表4 巴氏桿菌生化鑒定結(jié)果

3.4 16S rDNA 的鑒定

分離菌用16S 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后得到約1450 bp 的目的片段（見圖4），符合預(yù)期的結(jié)果。經(jīng)測序后得到16S rDNA 序列的長度為1443 bp。在NCBI 參考CCUG 17978、CCUG 17976 和英國株NCTC 10322、NCTC 10204 的16S rDNA 序列進(jìn)行比對并進(jìn)行同源性分析（見圖5）經(jīng)比對與巴氏桿菌美國株CCUG17978 的同源性最高，同源性為100%。因此，分離株為巴氏桿菌屬。

圖4 巴氏桿菌16S rDNA 基因擴(kuò)增

圖5 巴氏桿菌16S rDNA 基因序列同源性分析

3.5 巴氏桿菌莢膜分型

用莢膜分型的引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增后，僅的到莢膜A 型的目的片段，大小約1044 bp，符合預(yù)期的片段長度（見圖6），其他泳道均無條帶，證明HN-A-1 菌株為莢膜A 型，引用中所參考的國內(nèi)外A、B、D、E、F 莢膜型菌株進(jìn)行同源性比對進(jìn)行同源性分析（圖7）并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8），結(jié)果HNA-1 與A 型莢膜參考株的同源性在99%以上，證明該分離株莢膜型為A 型。

圖6 巴氏桿菌莢膜分型擴(kuò)增

圖7 巴氏桿菌莢膜分型核苷酸序列同源性的比較

圖8 巴氏桿菌莢膜分型進(jìn)化樹

3.6 脂多糖分型

用L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 八種脂多糖分型引物擴(kuò)增后，僅L1 型引物擴(kuò)增出約1307 bp 的目的片段（圖9），測序結(jié)果與GenBank 中L1 型巴氏桿菌VP161 的同源性為100%。證明HN-A-1 菌株為脂多糖L1 型。

圖9 脂多糖分型擴(kuò)增

4 治療措施

該養(yǎng)殖場給雞用磺胺類藥物配合小蘇打混用，治療3～5 天后，癥狀明顯好轉(zhuǎn)。

5 討論與結(jié)論

禽霍亂傳播速度非?？?，發(fā)病率較高[8]，特別是急性病癥，會造成大量禽類死亡，母雞產(chǎn)蛋率下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病雞場得到的菌株經(jīng)分離鑒定，為多殺性巴氏桿菌，且為致病力較強(qiáng)莢膜A 型、脂多糖L1 型。這與王林柏[8]等、Li[9]等報(bào)道國內(nèi)部分地區(qū)禽源多殺性巴氏桿菌血清型結(jié)果一致，主要為A：L1 型，也與Peng 等報(bào)道全球不同地區(qū)的流行情況相同。

該雞場養(yǎng)殖三年有余，飼養(yǎng)過程中對于衛(wèi)生環(huán)境等因素的把控存在一定的疏漏，這也是誘發(fā)禽霍亂的關(guān)鍵因素之一。雞場養(yǎng)殖會出現(xiàn)各種各樣的狀況，天氣突變、禽舍通風(fēng)不良、生活環(huán)境過于潮濕、臟亂以及營養(yǎng)缺乏等讓雞群產(chǎn)生應(yīng)激，都可能會導(dǎo)致其免疫力下降而感染禽霍亂[10]。保持禽舍的衛(wèi)生、通風(fēng)、溫度、濕度和合理飼喂，才能更大可能減少禽霍亂的發(fā)生。

由于禽霍亂是細(xì)菌性疾病，所以抗生素例如磺胺類藥物、氟苯尼考等都可以對禽霍亂進(jìn)行有效的防治。本試驗(yàn)所得樣本的雞場飼養(yǎng)方式為林下養(yǎng)雞，平時用藥較少，所以在給雞用磺胺類藥物配合小蘇打進(jìn)行治療后雞群逐漸恢復(fù)正常。近年來，由于市場上抗生素的濫用，導(dǎo)致許多畜禽動物對與抗生素都有了一定的耐藥性[11]，導(dǎo)致藥物原有的有效劑量失效。所以在飼養(yǎng)過程中還要避免為預(yù)防各種疾病濫用抗生素，使其保持一個自然良好的生長狀態(tài)[12]。