桑葉水提工藝優(yōu)化及水提物的體外抑菌試驗

江素娟，李萬軍,2，張明軍，彭濤，柳亦松※

（1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省耒陽市畜牧水產事務中心，湖南 耒陽 421800）

1 前言

桑葉（Morus folium）是?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥葉。桑為落葉喬木或灌木，其抗逆性強，種植范圍廣泛，是目前最高產的葉用經濟植物之一[1]。桑葉富含黃酮類、多糖、多酚和生物堿等多種活性成分[2]，這些活性物質具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂等功能[3-6]。桑葉廣泛應用于制藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)[1]。有研究結果表明在羅曼灰蛋雞飼料中添加桑葉提取物，改善了腸道組織形態(tài)，提高了抗氧化能力及免疫功能，一定程度上提升了蛋品質[7]。

目前桑葉的活性成分提取方法主要有回流提取法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法等。朱亞偉[8]等采用響應面優(yōu)化酶解-微波輔助法從桑葉中提取桑葉多糖，在最優(yōu)提取工藝下桑葉多糖的提取率為15.23%。蘇偉[9]等采用超聲輔助提取桑葉總黃酮，在最佳工藝條件下，桑葉總黃酮得率為2.7%，經AB-8 大孔樹脂洗脫純化后，總黃酮的純度達33.8%。Vichasilp C[10]等采用超聲波輔助提取法提取桑葉中的脫氧野尻霉素（DeoxyNoJirimycin,DNJ）并通過響應面法進一步優(yōu)化，得到高提取效率及生產率的DNJ 粉末。

為了提高桑葉水提物的產量，本試驗采用單因子試驗和正交試驗法研究桑葉的回流提取最佳工藝；為了探索桑葉水提物改善動物生產性能的初步機理，本試驗采用紙片法研究桑葉水提物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、農桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制能力，以便為桑葉的綜合開發(fā)及利用提供試驗依據。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗藥材

本試驗桑葉購買于湖北等藥材市場。

2.1.2 試驗試劑

植物類黃酮含量檢測試劑盒（AKPL015C）購自北京盒子生工科技有限公司，LB 肉湯（028324）、LB瓊脂（028334）培養(yǎng)基均購自環(huán)凱生物科技有限公司，細菌培養(yǎng)皿（BS-90-D）購自Biosharp。

2.1.3 試驗菌株

試驗中用到的細菌由本院實驗室提供，包括：金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、農桿菌、枯草芽孢桿菌。

2.1.4 試驗儀器

高速離心機（5427R，德國EPPendorf 公司）、萬分之一電子分析天平（ME204E,METTLER TOLEDO）、旋轉蒸發(fā)器（RE-5203，上海亞榮生化儀器廠）、循環(huán)水真空泵（SHZ-Ⅲ，上海亞榮生化儀器廠）、紫外可見分光光度計（UV2400，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）、多功能酶標儀（Infinnte E Plex，天津泰斯特儀器有限公司），超純水制備儀（AWT-TOC-20L，四川優(yōu)普越純科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)震蕩箱（ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司）等。

2.2 方法

2.2.1 單因子試驗

干燥桑葉過40 目篩，稱取過篩后的樣品50g，在其他因素不變的情況下，分別考察提取次數（1～5 次）、提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、溶劑倍數（10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1 mL/g）對桑葉水提浸膏得率的影響，浸膏得率取3 次試驗的平均值。

2.2.2 正交試驗

依據上述優(yōu)化得到的單因子試驗結果，選取提取次數、提取時間、溶劑倍數3 個因素為自變量，以浸膏得率與浸膏中總黃酮含量的綜合評分為考察指標（滿分100 分），采用L9（33）正交試驗分析確定桑葉水提物的最優(yōu)工藝。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計

綜合評分=（浸膏得率/正交試驗中浸膏得率最大值）×50＋（總黃酮含量/正交試驗中總黃酮含量最大值）×50

2.2.3 總黃酮標準曲線的建立

將10 mg/mL 蘆丁標準液稀釋至0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL 即為標準稀釋液。在510 nm處測定其吸光度，得到總黃酮標準曲線回歸方程y= 3.3297x - 0.041，其中y 為溶液吸光值，x 為質量濃度，線性相關系數R2= 0.9986，表明當吸光值在0.04～1.311 時，標準曲線方程線性良好，適用于桑葉水提物總黃酮含量的測定。

總黃酮含量（mg/g）= x ×V提/ W

式中：x 為計算出的濃度（mg/mL）；V提為提取液體積（mL）；W 為樣品質量（g）。

2.2.4 桑葉水提浸膏得率

水提浸膏得率（%）= m2/ m1× 100%

式中：m2為提取得到桑葉水提物的質量（g）；m1為提取桑葉水提物用的原料的質量（g）。

2.2.5 桑葉水提物總黃酮含量測定

稱取100 mg 桑葉水提物，加入1 mL 試劑盒中的提取液，超聲提取至完全溶解（60 ℃、功率300W，超聲5 s，間歇8 s，總時間30 min）；加速度12000 g 常溫離心10 min 后，取上清液為待測樣本。后續(xù)按試劑盒說明步驟操作，測得吸光度代入黃酮標準曲線可得樣本總黃酮含量。

2.2.6 培養(yǎng)基的制備

固體培養(yǎng)基：稱取35.0 g 培養(yǎng)基干粉，加入1 L蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，每個無菌平皿中倒入約15 mL 的培養(yǎng)基，冷卻后備用。

液體培養(yǎng)基：稱取20.0 g 培養(yǎng)基干粉，加入1 L蒸餾水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，分裝于離心管中備用。

2.2.7 供試菌懸液的制備

將供試菌種復蘇后接種于普通瓊脂平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)震蕩箱中培養(yǎng)24 h。分別用接種環(huán)滅菌挑取各個菌落菌于LB 肉湯培養(yǎng)管中，再繼續(xù)37℃培養(yǎng)24 h，制備約1×108～5 ×108CFU/mL 的菌懸液用于抑菌試驗。

2.2.8 抑菌紙片的制備

用打孔機將普通定性濾紙制成直徑為6 mm 圓形紙片，經121 ℃高壓滅菌20 min，60 ℃干燥備用。

2.2.9 桑葉水取物的制備

采用2.2.2 中得出的最優(yōu)提取工藝進行提取物的制備。干燥的桑葉藥材粉碎后過篩，取過篩后的樣品50 g 加入圓底燒瓶中，加入純水，在電子加熱套上回流提取，合并濾液后用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏，放入烘箱中干燥后粉碎，得到桑葉水提物。取100 mg 提取物置于1 mL 純水中，制成待測的水提液用于抑菌試驗。

2.2.10 抑菌圈直徑的測定

在無菌條件下，取100 μL 菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取抑菌紙片緊貼于固態(tài)培養(yǎng)基表面，再取10 μL 桑葉水提物樣品于紙片上，設定水為空白對照，重復3次，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并準確測量透明圈直徑，評價抑菌效果。透明圈直徑＞7 mm，判定為有抑菌效果；透明圈直徑≤7 mm，判定為無抑菌效果[11]。

2.3 數據統(tǒng)計及分析

利用SPSS 25.0 進行數據處理和分析，使用GraphPad Prism 8.0.2 對實驗數據進行繪圖。

3 結果與分析

3.1 單因子試驗結果

3.1.1 提取次數對浸膏得率的影響

在其他條件不變的前提下，提取1、2、3、4、5 次的平均浸膏得率分別為16.32%、25.41%、26.04%、26.42%、27.15%。由圖1 可知隨提取次數的增加，桑葉水提浸膏得率也增加，后趨勢變化趨于平穩(wěn)，考慮到經濟效益等因素，故選定提取次數（1 次、2 次、3 次）進行正交試驗。

圖1 提取次數對桑葉浸膏得率的影響

3.1.2 提取時間對浸膏得率的影響

在其他條件不變的前提下，提取時間0.5、1、1.5、2、2.5 h 的平均浸膏得率分別為14.31%、14.39%、16.59%、15.63%、15.02%。由圖2 可知隨提取時間的增加，桑葉水提浸膏得率在1.5 h 達到峰值，此時浸膏得率的平均值為16.59%，后隨著提取時間的增加，浸膏得率呈下降趨勢，故選定提取時間（1 h、1.5 h、2 h）進行正交試驗。

圖2 提取時間對桑葉浸膏得率的影響

3.1.3 溶劑倍數對浸膏得率的影響

在其他條件不變的前提下，溶劑倍數10∶1、12∶1、14 ∶1、16 ∶1、18 ∶1 mL/g 的平均浸膏得率為14.43%、15.56%、18.35%、19.59%、19.72%。由圖3可知隨溶劑倍數的增加，桑葉水提浸膏得率也增加，后趨勢變化趨于平穩(wěn)，考慮到經濟效益等因素，故選定溶劑倍數（14∶1、16∶1、18∶1 mL/g）進行正交試驗。

圖3 溶劑倍數對桑葉浸膏得率的影響

3.2 正交試驗結果

正交試驗設計以單因子試驗所得提取條件為基礎，選擇提取次數、提取時間、溶劑倍數為影響因子，以浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的綜合評分為考察指標進行3 因素3 水平正交試驗。正交試驗結果與分析如表2 所示。由表2 中極差（R）的大小可知，各因素對浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的影響程度為：提取次數>溶劑倍數>提取時間。方差分析結果如表3 所示，各因素對浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的綜合評分無顯著影響，為節(jié)約工藝成本與能源，選取最佳水提工藝為A3B1C3，即提取次數3次、提取時間1 h、溶劑倍數18∶1 mL/g。

表2 正交試驗結果與分析

表3 方差分析結果

3.3 最佳工藝條件下的浸膏得率及總黃酮含量

在最佳水提工藝參數下，重復試驗3 次進行驗證，得到桑葉水提物浸膏平均得率為31.13%，總黃酮平均含量約為32.12 mg/g，如表4。

表4 最佳工藝條件下的浸膏得率及總黃酮含量

3.4 抑菌試驗結果

由表5 可知桑葉水提物對6 種指示菌中的3種表現(xiàn)出抑制作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、農桿菌的抑制作用明顯，抑菌圈直徑分別為16.14±1.96、8.31±0.21、9.76±0.72（mm），其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最為突出。桑葉水提物在沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌中未出現(xiàn)抑菌圈。

表5 桑葉水提物對6 種菌的抑菌圈直徑

4 討論

有學者使用AB-8 型大孔樹脂對粗提物進行純化，桑葉粗提物總黃酮含量為12.3 mg/mL，純化后總黃酮的含量提高至33.8 mg/mL[9]。齊慧嫻[12]等采用煮沸法所得珠蓼散提取液測的總黃酮含量為4.12 mg/mL，浸膏得率為15.12%，均優(yōu)于加熱法和滲漉法。與上述研究相比較，本研究所用方法對桑葉水提浸膏得率及總黃酮含量也有較為明顯的提高，能夠達到減少工藝步驟、節(jié)約提取成本的效果。

本試驗中影響桑葉水提物浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的3 個因素，其對工藝的影響程度為：提取次數>溶劑倍數>提取時間；最佳工藝參數組合：提取次數3 次、提取時間1 h、溶劑倍數18∶1（mL/g）。正交試驗和方差分析結果顯示，提取次數、提取時間、溶劑倍數對桑葉水提物浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的綜合評分無顯著影響。因此，在不同生產條件和環(huán)境下開展桑葉提取物生產之前，應進行詳細的試驗和論證，以獲得該環(huán)境下的最優(yōu)工藝參數水平，確保獲得最高的產量。

本研究結果顯示，桑葉水提物具有一定的抑菌活性，對6 種指示菌中的3 種均表現(xiàn)出抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌直徑達（16.14±1.96）mm。有學者采用牛津杯法進行抑菌試驗得出，純化后的桑葉多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，桑葉多糖純度越高對細菌的抑制程度越強[13]。還有學者采用紙片法和牛津杯法測定珠蓼散對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果，得出其對大腸桿菌和沙門氏菌均有較好的體外抑制效果[14]。上述研究結果與本研究結果相似，表明桑葉提取物具有一定抑菌效果，在動物保健和抑菌等方面可能均有較好的效果。因此，利用桑葉提取物作為一種天然的抑菌劑具有良好的開發(fā)前景。

5 結論

本試驗以桑葉為研究對象，通過單因子試驗與正交試驗結合，考察提取次數、提取時間、溶劑倍數對桑葉水提物浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的影響，篩選出最佳的桑葉水提工藝組合。各因素對桑葉水提物浸膏得率及浸膏中總黃酮含量的影響秩序為提取次數>溶劑倍數>提取時間；桑葉的最佳水提工藝為：提取次數3 次、提取時間1 h、溶劑倍數18∶1（mL/g）。在此工藝參數下，桑葉水提物浸膏平均得率為31.13%，總黃酮平均含量約為32.12 mg/g。體外抑菌試驗表明，桑葉水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和農桿菌具有一定的抑制能力，特別是對金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，而對沙門氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌無抑菌作用。