天然曬露法醬油減鹽工藝條件優(yōu)化

施 思，徐雪姣，施 林

（1.浙江藥科職業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，浙江 寧波 315000；2.浙江樹人學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；3.寧波統(tǒng)一食品有限公司，浙江 寧波 315000）

醬油起源于中國，以大豆、麩皮等為原料釀造而成，是人民餐桌上不可或缺的重要調(diào)味品之一[1]。我國醬油生產(chǎn)工藝常采用高鹽稀態(tài)法和天然曬露法。近年來，高鹽稀態(tài)法被廣泛使用，經(jīng)濟(jì)高效，品質(zhì)穩(wěn)定，但其發(fā)酵周期較長[1]。寧波傳統(tǒng)天然曬露法醬油發(fā)酵工藝已具有上千年的歷史，它采用大豆和小麥粉為原料，混合制曲后下缸，利用自然氣溫變化規(guī)律進(jìn)行露天發(fā)酵[2]。因長時(shí)間日曬夜露，定期打耙，水分蒸發(fā)較多，最終形成濃醪。采用該法釀成的醬油，具有醬香濃厚、滋味醇和、鮮美、體態(tài)濃稠的優(yōu)點(diǎn)，在華東地區(qū)久負(fù)盛名。隨著消費(fèi)觀念的提升，消費(fèi)觀念趨向于“減鹽、健康、傳統(tǒng)、定制化”方向。如何在遵循傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行釀造技術(shù)的升級(jí)，開發(fā)出“高風(fēng)味、減鹽、健康”的醬油產(chǎn)品，是我國傳統(tǒng)釀造企業(yè)亟需解決的現(xiàn)實(shí)問題。目前，針對(duì)減鹽醬油的工藝研究大多基于高鹽稀態(tài)法，很少有通過乙醇代替部分氯化鈉法來降低天然曬露法醬油鹽含量的研究，且對(duì)該傳統(tǒng)發(fā)酵工藝醬油的風(fēng)味和安全性缺少綜合全面的研究。

目前，關(guān)于減鹽醬油的生產(chǎn)尚未出臺(tái)統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)。醬油企業(yè)通常采用膜分離法或食鹽替代法進(jìn)行減鹽處理[3]。減鹽醬油的膜分離技術(shù)主要有電滲析、納濾膜、離子交換等，可以有效降低醬油中的鹽含量，但是風(fēng)味物質(zhì)損失量較大[4]，且該設(shè)備較為昂貴，并不適用于我國的中小型釀造企業(yè)。常見的食鹽替代物主要包括氯化鉀和乙醇等[3]。相較于氯化鉀，使用乙醇作為替代物可以有效控制雜菌污染，醬油苦澀感不突出，并且具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)[5]。除此之外，乙醇作為醬油的重要風(fēng)味物質(zhì)，還可以與酸類物質(zhì)反應(yīng)生成酯類[2]。宋小焱等[6]在乙醇代鹽生產(chǎn)低鹽醬油的研究中發(fā)現(xiàn)，與氯化鈉相比，乙醇對(duì)于蛋白酶活性的抑制作用較弱，濃度過高的乙醇有可能抑制酵母菌的生長，從而對(duì)醬油發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。

因此，本研究在傳統(tǒng)天然曬露法制備醬油的工藝基礎(chǔ)上制備醬油，并采用乙醇代鹽法對(duì)醬油進(jìn)行降鹽處理，分別考察不同乙醇和食鹽比例對(duì)醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、總酸含量、pH值的影響，并對(duì)醬油樣品的NaCl含量及感官品質(zhì)進(jìn)行分析，明確減鹽醬油的最佳配方設(shè)計(jì)，旨在為實(shí)現(xiàn)天然曬露法醬油的減鹽生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步振興傳統(tǒng)釀造工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）（滬釀3.042）：上海迪發(fā)有限公司；大豆、小麥粉、食鹽：市售；氫氧化鈉、甲醛（37%）、鉻酸鉀、酚酞（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銀（分析純）：河南邦潤化工產(chǎn)品有限公司；乙醇（體積分?jǐn)?shù)為95%）（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QL-Y01振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：安萊立思儀器科技（上海）有限公司；8HW-1型恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；320XB電子分析天平：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生醬油的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

大豆、小麥粉→混合→潤水→蒸煮→冷卻→接種、發(fā)酵→加入氯化鈉溶液→制醪→露天發(fā)酵→浸泡醬醅→壓榨→生醬油操作要點(diǎn)：

將大豆和小麥粉以7∶3的質(zhì)量比混合，每1 250 kg混合干料加入700 kg清水進(jìn)行潤水，浸泡7 h。采用旋轉(zhuǎn)蒸罐蒸料，蒸料壓力為0.15～0.20 MPa（蒸汽壓），保壓時(shí)間為5～15 min。熟料冷卻到45 ℃以下，接入米曲霉0.3%，混合均勻，在35～37 ℃條件下發(fā)酵46 h，將上述發(fā)酵后的原料直接倒入露天發(fā)酵大缸中，加入18%的NaCl溶液。常溫日曬夜露發(fā)酵60 d，每5 d打耙一次。發(fā)酵結(jié)束后，用適量90 ℃熱水浸泡醬醅2 h，壓榨醬醅出油，即得到生醬油成品。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在生醬油的加工工藝流程基礎(chǔ)上，配制相應(yīng)濃度的溶液替代NaCl溶液，將發(fā)酵后原料和溶液以5∶8的質(zhì)量比混合，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的乙醇和氯化鈉添加量進(jìn)行試驗(yàn)，具體見表1。乙醇與氯化鈉的添加總量分別保持為17%（1#、4#、7#、10#、13#）、18%（2#、5#、8#、11#、14#）、19%（3#、6#、9#、12#、15#）。同時(shí)設(shè)置高鹽發(fā)酵組（0#）作為對(duì)照。每5 d打耙后，進(jìn)行抽樣。

表1 乙醇和氯化鈉添加量的設(shè)計(jì)Table 1 Design of ethanol and sodium chloride additions

1.3.3 分析檢測(cè)

氯化鈉和氨基酸態(tài)氮的測(cè)定：參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》中的甲醛滴定法和硝酸銀滴定法；總酸的測(cè)定：參照GB/T 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿指示劑滴定法；pH值的測(cè)定：采用酸度計(jì)。

1.3.4 醬油的感官評(píng)價(jià)

采用定量描述分析（quantative descriptive analysis，QDA）法評(píng)價(jià)不同發(fā)酵組醬油的感官特性[7-8]。所有感官分析均在特定的感官品評(píng)室進(jìn)行，以所有小組成員打分的平均值作為最終結(jié)果。感官小組共9名成員（4男5女，年齡23～30歲），每人都有60 h的QDA醬油評(píng)估經(jīng)驗(yàn)。首先，評(píng)估成員確定了減鹽醬油的6個(gè)感官描述屬性（鮮味、咸味、甜味、醬香、酯香、綜合復(fù)雜性）。評(píng)估成員被要求在0～5分的范圍內(nèi)記錄每種屬性的強(qiáng)度（0：不存在，1：剛好可以識(shí)別，2：弱，3：中，4：強(qiáng)，5：很強(qiáng)）。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著；使用Origin 9.0進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

鮮味是醬油最重要的風(fēng)味之一，氨基酸態(tài)氮含量與醬油的鮮味表現(xiàn)緊密相關(guān)，也是醬油國標(biāo)GB 18186—2000《釀造醬油》評(píng)定醬油等級(jí)的重要參數(shù)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～60 d時(shí)，15組樣品的氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～10 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量明顯增長（P＜0.05）；發(fā)酵時(shí)間＞10 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量變化趨于平緩。其原因可能是，發(fā)酵前期，醬醪中微生物生長迅速，中性蛋白酶和酸性蛋白酶的活力較高，原料中的蛋白質(zhì)發(fā)生水解生成各類呈味氨基酸[9]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醬醪的pH不斷下降，蛋白酶活力受到一定抑制，且發(fā)酵中后期，部分氨基酸轉(zhuǎn)化成其他風(fēng)味物質(zhì)，從而使醬醪中的氨基酸態(tài)氮含量升幅變緩[2]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 d時(shí)，1#、2#和3#的氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.93±0.01）g/100 mL、（0.82±0.04）g/100 mL和（0.86±0.02）g/100 mL；4#、5#和6#的氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.91±0.07）g/100 mL、（0.88±0.04）g/100 mL和（0.81±0.04）g/100 mL；7#、8#和9#的氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.89±0.04）g/100 mL、（0.86±0.03）g/100 mL和（0.85±0.03）g/100 mL；10#、11#和12#的氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.91±0.04）g/100 mL、（0.84±0.05）g/100 mL和（0.84±0.04）g/100 mL。當(dāng)氯化鈉含量為7%～9%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量隨著乙醇含量的增加而降低。當(dāng)乙醇含量為10%和11%時(shí)，氯化鈉含量越高，醬油的氨基酸含量越低。乙醇對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的影響主要是通過對(duì)蛋白酶的影響來實(shí)現(xiàn)，尤其是對(duì)堿性蛋白酶的影響最明顯[10]。15組樣品的氨基酸態(tài)氮含量均達(dá)0.8 g/100 mL，均符合國標(biāo)GB/T 18186—2000《釀造醬油》中特級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)，0#的氨基酸態(tài)氮含量為（1.16±0.01）g/100 mL。其中，13#的氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到了（0.97±0.03）g/100 mL，與其他組組間具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，13#能明顯增加發(fā)酵醬油中的氨基酸態(tài)氮含量。

圖1 不同醬油樣品在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.1 Changes of amino acidic nitrogen contents in different soy sauce samples during fermentation

2.2 醬油發(fā)酵過程中總酸含量的變化

在醬油發(fā)酵過程中，總酸含量的高低與醬油的品質(zhì)密切相關(guān)。有機(jī)酸本身是醬油重要的風(fēng)味物質(zhì)，可以帶來清爽的酸味，同時(shí)提高醬油的香氣表現(xiàn)，但過量的有機(jī)酸會(huì)破壞醬油的風(fēng)味，造成醬油咸味的失衡。醬醪中的總酸含量也可以體現(xiàn)微生物在發(fā)酵過程中的生長代謝情況，過高或過低都會(huì)對(duì)微生物生長代謝和各類生化反應(yīng)造成不利影響，從而影響醬油品質(zhì)[11-13]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～60 d時(shí)，15組樣品的總酸含量整體呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間為5～10 d時(shí)，各樣品的總酸含量快速增加，說明原料中的蛋白質(zhì)和脂肪被米曲霉酶系水解生成大量有機(jī)酸、脂肪酸和谷氨酸等酸性物質(zhì)；乳酸菌等微生物在發(fā)酵前期大量繁殖產(chǎn)生有機(jī)酸，造成總酸含量快速增加[14-17]。發(fā)酵時(shí)間＞10 d，總酸含量增長緩慢，可能是由于醬醪中的乙醇與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，造成有機(jī)酸生成含量下降[18-19]。發(fā)酵時(shí)間＞40 d后，可能是芽孢桿菌在發(fā)酵后期發(fā)揮作用，造成有機(jī)酸含量繼續(xù)快速上升[20]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 d時(shí)，對(duì)照樣品（0#）的總酸含量為（2.54±0.03）g/100 mL，1#、2#和3#的總酸含量分別為（2.04±0.04）g/100 mL、（1.79±0.05）g/100 mL和（1.79±0.01）g/100 mL；4#、5#和6#的總酸含量分別為（2.19±0.04）g/100 mL、（2.09±0.04）g/100 mL和（1.59±0.07）g/100 mL；7#、8#和9#的總酸含量分別為（1.84±0.02）g/100 mL、（1.84±0.05）g/100 mL和（1.59±0.06）g/100 mL。其中，13#的總酸含量為（2.34±0.03）g/100 mL，與0#最為接近，有利于兩者產(chǎn)生相似的風(fēng)味物質(zhì)。當(dāng)氯化鈉含量≤8%（1#～9#）時(shí)，總酸含量隨著乙醇含量的增加而降低。過高的乙醇含量可能會(huì)抑制乳酸菌生長，造成總酸含量的降低[6，21]。15組樣品的總酸含量為1.59～2.34 g/100 mL。因此，13#醬油樣品總酸含量最佳。

圖2 不同醬油樣品在發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid contents in different soy sauce during fermentation

2.3 醬油發(fā)酵過程中pH值的變化

pH值是體現(xiàn)醬醪發(fā)酵狀態(tài)的重要指標(biāo)，也與醬油品質(zhì)有關(guān)[22]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～60 d時(shí)，pH值呈現(xiàn)整體下降趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5～10 d時(shí)，pH值基本不變；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為10～35 d時(shí)，pH值緩慢下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞40 d后，pH值降低幅度變大。發(fā)酵過程中pH的變化，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)利用率與雜菌污染控制造成不同影響。尤其是制醪后的pH快速下降，不僅會(huì)抑制堿性蛋白酶和中性蛋白酶的活性，使蛋白質(zhì)水解率降低，直接影響醬油的鮮味，還會(huì)抑制耐鹽性乳酸菌的繁殖，引起不良后果[2，23]。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 d時(shí)，0#樣品的pH值為4.85，15組樣品的pH值下降至4.81～5.53，其中13#的pH為4.81，與0#最為接近。該條件下可以抑制部分非耐酸微生物，有利于醬油的防腐，同時(shí)也促進(jìn)了醬醪中酵母菌的繁殖和酒精發(fā)酵，有利于醬油風(fēng)味物質(zhì)的積累[2]。因此，13#樣品有利于產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)。

圖3 不同醬油樣品在發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.3 Changes of pH values in different soy sauce during fermentation

2.4 醬油氯化鈉含量檢測(cè)結(jié)果

不同醬油樣品氯化鈉含量檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，發(fā)酵時(shí)間為60 d時(shí)，15組醬油樣品中的鹽含量均可降低50%以上，其中1#、2#的氯化鈉含量較低，分別為（5.53±0.02）%、（5.53±0.03）%。結(jié)合氨基酸態(tài)氮、總酸等理化指標(biāo)，13#的氯化鈉含量為（7.74±0.04）%，具有后續(xù)作為減鹽醬油進(jìn)行開發(fā)的潛力。在相同氯化鈉添加量下，由于醬缸露天放置位置差異，水分散發(fā)速度不同等原因，造成發(fā)酵終點(diǎn)的氯化鈉含量略有不同。

表2 不同醬油樣品發(fā)酵完成時(shí)的氯化鈉含量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of sodium chloride contents in different soy sauce samples at the end of fermentation

2.5 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)可以直接反映消費(fèi)者的喜好和接受程度。采用QDA法分析比較15組醬油樣品的風(fēng)味，篩選出了6個(gè)描述減鹽醬油風(fēng)味的詞匯，即鮮味、咸味、甜味、醬香、酯香和綜合復(fù)雜性，同時(shí)設(shè)置了高鹽發(fā)酵組作為對(duì)照組。不同醬油樣品感官評(píng)分見表3。由表3可知，1#～15#的鮮味評(píng)分為2.1～2.8分，0#的鮮味評(píng)分為1.9分，說明采用減鹽工藝條件可以保持甚至提高醬油的鮮味。1#～15#的咸味評(píng)分低于樣品0#，與氯化鈉含量的數(shù)據(jù)結(jié)果相符。與0#的甜味相比，其余15個(gè)生醬油樣品的甜味具有一定差異。從香氣方面看，16組醬油樣品并未顯示明顯差異，減鹽工藝條件并不能使香氣成分得到明顯提升，這可能是由于高鹽環(huán)境可以形成有效的菌種篩選機(jī)制，使與醬油風(fēng)味形成密切相關(guān)的嗜鹽四鏈球菌（Tetragenococcus halophilus）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）及易變球擬酵母（Torulopsis versatilis）成為優(yōu)勢(shì)菌種[24-26]。0#、10#、11#、12#、13#、14#和15#的綜合復(fù)雜性評(píng)分較高，為1.9分。結(jié)合理化指標(biāo)，13#樣品最具有后續(xù)開發(fā)潛力。

表3 不同醬油樣品的感官評(píng)分Table 3 Sensory evaluation score of different soy sauce samples

3 結(jié)論

與傳統(tǒng)天然曬露法相比，減鹽新工藝能降低醬油的鹽含量50%以上。發(fā)酵60 d后，15組均未發(fā)現(xiàn)明顯腐敗現(xiàn)象，說明添加乙醇能有效抑制雜菌污染。發(fā)酵60 d后，13#醬油樣品（制備醬油的鹽水氯化鈉含量10%、乙醇含量7%）的氨基酸態(tài)氮含量最高，達(dá)到了（0.97±0.03）g/100 mL，總酸含量為（2.34±0.03）g/100 mL，pH為4.81，NaCl含量為（7.74±0.04）%。QDA感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該樣品的鮮味評(píng)分為2.8分，咸味評(píng)分為2.6分，甜味評(píng)分為1.4分，醬香評(píng)分為2.9分，酯香評(píng)分為0.9分，綜合復(fù)雜性評(píng)分為1.9分，減鹽新工藝有效提高了醬油的鮮味和整體風(fēng)味，可作為后續(xù)進(jìn)行中試生產(chǎn)的工藝條件，為減鹽天然曬露法醬油的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。