產(chǎn)果膠酶菌株的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化

彭潔英，黃琳茹，方堅濠，李昆太*

（1.廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3.廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心，廣東 湛江 524088）

果膠酶是指能夠分解高等植物細胞壁的重要組成部分，果膠類物質(zhì)中半乳糖醛酸長鏈殘基的糖苷鍵的一類酶的總稱，主要包括原果膠酶、果膠酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類，屬于復合酶，廣泛分布于高等植物和微生物中，是全球四大工業(yè)酶制劑之一[1]。研究表明，優(yōu)良的果膠酶產(chǎn)生菌主要為細菌和真菌[2]。AHLAWAT S等[3]使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）生產(chǎn)果膠酶，其所產(chǎn)酶展現(xiàn)出廣泛的pH適應性和熱穩(wěn)定性，為高溫和極端pH下的果膠處理工藝提供了酶學基礎。KHATRI B P等[4]分離出一株能夠產(chǎn)生堿性果膠酶的黑曲霉（Aspergillus oryzae）菌株，能應用于植物纖維脫膠、廢水處理等過程。池彬彬等[5]從鹽井土壤樣品中分離得到一株產(chǎn)果膠酶的中度嗜鹽菌，解決了果膠酶在高濃度鹽溶液下酶活性較低的缺陷。除對產(chǎn)果膠酶菌進行分離鑒定以外，眾多學者對產(chǎn)果膠酶菌的最佳發(fā)酵條件進行了研究[6-8]，KASHYAP D R等[7]從農(nóng)場的土壤中分離出產(chǎn)果膠酶菌株，通過響應面法優(yōu)化了其發(fā)酵產(chǎn)酶條件，即在含有果膠10 g/L和K2HPO40.8 g/L的培養(yǎng)基中，28 ℃下發(fā)酵3 d后的最高酶活力為14.16 U/mL，約是優(yōu)化前的12倍。

果膠酶是重要的商用酶之一，在食品工業(yè)和紡織行業(yè)占有重要地位。以食品工業(yè)為例，微生物果膠酶占全球食品酶銷售總額的25%，年銷售達到100多萬t[9-11]。其在果蔬汁的澄清[12]、果蔬出汁率的提高[13]、改善果酒品質(zhì)[14]、提取天然產(chǎn)物[15]、提取油脂[16]、生產(chǎn)果膠低聚糖[17]以及咖啡和茶葉加工[18]等方面都有應用。由于果膠酶在食品工業(yè)中應用廣泛，使得人們對于果膠酶的來源研究也越來越深入。果膠酶可以從微生物或植物中分離獲得，植物中的果膠酶產(chǎn)量較低、提取成本高且提純方法繁瑣，不利于進行大規(guī)模生產(chǎn)。所以目前果膠酶的生產(chǎn)主要依靠微生物代謝產(chǎn)生，其中黑曲霉（Aspergillus niger）是工業(yè)生產(chǎn)上較為常見的產(chǎn)果膠酶菌株，但其果膠酶的產(chǎn)量與酶活性仍然不能滿足市場發(fā)展的需求[19]。因此，亟需選育新的高產(chǎn)果膠酶菌株，更好地滿足市場發(fā)展與工業(yè)生產(chǎn)的需求。此外，對篩選的果膠酶產(chǎn)生菌進行發(fā)酵工藝優(yōu)化也是提高其產(chǎn)酶經(jīng)濟效益的一個重要方式[20]，響應面法可以在幾次試驗中確定幾個變量之間的相互作用，并在盡可能短的時間內(nèi)獲得最佳結果[21-22]。

菠蘿富含果膠且易分泌果膠膠液，本研究擬從菠蘿種植地靶向分離篩選產(chǎn)果膠酶的微生物菌種，并通過單因素試驗和響應面法對其產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以提高菌株產(chǎn)果膠酶的能力，為該菌的工業(yè)化應用提供源頭資源和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土樣來源

土樣采自廣東省湛江市徐聞縣曲界鎮(zhèn)菠蘿種植地。

1.1.2 試劑

果膠、D+（-）半乳糖醛酸：上海麥克林生化科技有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵、剛果紅、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、檸檬酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、磷酸氫二鈉、氯化鋅、氯化銅、氯化錳、六水合氯化鈷：上海麥克林生化科技有限公司；革蘭氏染液、微生物檢測配套試劑、氯化銨、技術瓊脂粉、酵母浸膏：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：果膠3.0 g/L，NH4C1 0.4 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO41 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.4，瓊脂粉15 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

復篩培養(yǎng)基：果膠20 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO41 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，121 ℃滅菌30 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠30 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；DM500生物顯微鏡：上海Leica顯微系統(tǒng)有限公司；UV-5800PC紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；BPMJ-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫(yī)療器械有限公司；3K-15 SIGMR臺式高速冷凍離心機：揚州離心機有限公司；SSW-420-2S電熱恒溫水槽：上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)果膠酶微生物的分離

稱取土壤樣品10 g加入到盛有90 mL無菌水且?guī)в胁Ａе榈?00 mL錐形瓶中，將土樣充分打散、混勻，即成10-1泥漿稀釋液，然后再按10倍稀釋法依次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5等梯度。吸取10-3、10-4、10-5梯度稀釋液各200 μL分別涂布至分離培養(yǎng)基平板上，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2～3d。分離出能在以果膠為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上生長的微生物。

1.3.2 產(chǎn)果膠酶菌株的初篩

將步驟1.3.1分離得到的菌株接種到分離培養(yǎng)基上，待菌落明顯長出后，將平板倒浸于剛果紅溶液（5 mg/mL水溶液）中靜置15 min。取出平板倒去剛果紅溶液，用氯化鈉溶液（1 mol/L）重新覆蓋平板表面，靜置15 min，觀測菌落旁有無明顯水解圈的出現(xiàn)。挑取平板上水解圈較大的菌落平板劃線于LB固體培養(yǎng)基上，反復純化直至得到純培養(yǎng)物后轉接至LB斜面培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱短時間保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 產(chǎn)果膠酶菌株的復篩

將初篩菌株的新鮮斜面以10 mL無菌水洗下菌體，打散均勻后取1 mL菌懸液接種于裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中160 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，獲得種子液。將種子液以5%（V/V）的接種量接種于裝液量為40 mL/250 mL三角瓶的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。所得發(fā)酵液裝入50 mL離心管中，于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，收集上清液并使用DNS法測定果膠酶的酶活力，復篩出所產(chǎn)果膠酶酶活力高的菌株。

1.3.4 果膠酶酶活力的測定

果膠酶酶活力的測定方法參照谷藝明[23]的方法并稍加改進。吸取0.8 mL果膠溶液加入50 mL的比色管中，50 ℃水浴加熱5 min，加入0.2 mL的稀釋粗酶液，50 ℃水浴30 min，加入3 mL的DNS試劑，沸水浴10 min，流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，混合均勻，10 000 r/min離心10 min，以滅活的粗酶液為對照，用分光光度計在波長540 nm處測溶液的OD540nm值。根據(jù)半乳糖醛酸標準曲線測定果膠酶酶活力。酶活力定義：在50 ℃的條件下，每1 min水解果膠產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸為一個酶活力單位，計算公式如下[23]：

式中：UI表示果膠酶酶活力，U/mL；N表示粗酶液稀釋倍數(shù)；A1表示粗酶液在波長540 nm處的吸光度值（OD540nm值）；1 000表示mg與μg的換算系數(shù)；A2表示滅活的粗酶液在波長540 nm處的吸光度值（OD540nm值）；0.2表示粗酶液添加量，mL；K表示半乳糖醛酸標準曲線斜率；t表示反應時間，min。

1.3.5 產(chǎn)果膠酶菌株的鑒定（1）形態(tài)觀察

將分離篩選得到的菌株劃線于LB平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄單菌落的顏色、形狀、透明度、大小、表面隆起和菌落培養(yǎng)基的顏色等。利用掃描電子顯微鏡[24]，對所篩菌株的微觀形態(tài)和大小進行分析觀察。

（2）生理生化鑒定

菌株的生理生化試驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中菌種鑒定方法對菌株的部分生理生化進行鑒定[25-26]。

（3）分子生物學鑒定

參考楊逸飛等[27]的方法，將純化后的菌種送至上海生工生物工程有限有限公司進行測序，采用細菌通用引物7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和1540R（5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16S rRNA。PCR擴增體系（25 μL）：10×PCR Buffer 2.5 μL（含Mg2+），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）各2.5 mmol/L，TaqPlus脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，引物7F（10 μmol/L）和1540R（10 μmol/L）各0.5 μL，模板（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。對擴增的產(chǎn)物進行測序。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center or biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，在比對結果中下載同源性較高的序列，采用鄰位相連法將目的菌種的16S rDNA與下載的序列一起構建進化樹，利用Bootstrap自舉法檢測序列1 000次后建立系統(tǒng)進化樹。

1.3.6 產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

設置初始發(fā)酵條件：蔗糖30 g/L，蛋白胨20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.0，發(fā)酵溫度30 ℃；裝液量40 mL/250 mL，接種量5%（V/V），發(fā)酵時間24 h。

考察碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果膠、可溶性淀粉、玉米漿干粉）、最佳碳源添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L）、有機氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、黃豆餅粉）、最佳氮源添加量（10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L）、微量元素（Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃）以及pH（3、5、7、9、11、13）對菌株產(chǎn)果膠酶的影響。

1.3.7 響應面法優(yōu)化

根據(jù)上述單因素試驗的結果，利用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計3因素3水平的響應面試驗，探究篩選菌株產(chǎn)果膠酶的最優(yōu)產(chǎn)酶條件，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for enzyme production conditions optimization

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用Origin 2022對數(shù)據(jù)進行作圖分析，使用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計響應面試驗。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)果膠酶微生物的初篩

果膠經(jīng)果膠酶分解后，其多糖水解物可與剛果紅染料形成有紅色透明圈的復合物，由此可判別菌株是否具有產(chǎn)果膠酶的能力[28]。經(jīng)過以果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)基的篩選分離，從采集的土樣中一共初篩到9株能夠產(chǎn)生水解圈的菌株，并分別命名為XW-1、XW-7、XW-12、XW-14、XW-15、XW-18、XW-19、XW-20、XW-23。代表菌株XW-18的水解圈見圖1。

圖1 菌株XW-18降解果膠所產(chǎn)的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain XW-18 by degrading pectin

2.2 產(chǎn)果膠酶微生物的復篩

初篩獲得的9株微生物經(jīng)發(fā)酵后，利用DNS法測定其所產(chǎn)的果膠酶酶活，結果見圖2。由圖2可知，果膠酶活力＞200 U/mL的菌株有XW-1、XW-7、XW-14、XW-15、XW-18、XW-20。其中菌株XW-18所產(chǎn)果膠酶酶活最高，達到（306.22±0.59）U/mL，因此將菌株XW-18作為進一步研究對象。

圖2 篩選菌株的酶活力測定結果Fig.2 Determination results of enzyme activity of re-screening strains

2.3 菌株XW-18的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察結果

將菌株XW-18點接于LB固體培養(yǎng)基上，觀察其菌落形態(tài)特征，結果見圖3。由圖3可知，該菌單菌落為橢圓狀突起，呈現(xiàn)明顯的細菌菌落特征。菌落生長初期為乳白色，表面濕潤，有黏性，培養(yǎng)時間稍長后，菌落表面變干燥，有褶皺。掃描電子顯微鏡觀察結果顯示，菌株呈短桿狀，周生鞭毛。

圖3 菌株XW-18的菌落形態(tài)（a）及細胞形態(tài)（b）Fig.3 Colony morphology(a)and cell morphology(b)of strain XW-18

2.3.2 生理生化試驗結果

菌株的生理生化試驗結果見表2。由表2可知，菌株XW-18的葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、木糖、麥芽糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇發(fā)酵結果以及吲哚、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG）、M.R.、H2S、脂肪酶、淀粉酶、明膠液化試驗結果均為陽性；V.P.、幾丁質(zhì)酶、脲酶試驗結果均為陰性。通過對菌株的形態(tài)觀察、生理生化檢測結果和檢索《伯杰式細菌鑒定手冊》，菌株XW-18與芽孢桿菌生理生化特征較吻合。因此，初步判定菌株XW-18屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株XW-18的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain XW-18

2.3.3 分子生物學鑒定

菌株XW-18的16S rDNA基因序列總長為1 481 bp（GenBank登錄號：OP430540），通過在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST序列比對分析，結果表明，該菌株與枯草芽孢桿菌親源性最近，同源性達到99%。利用MEGA7.0.26軟件構建菌株XW-18的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株XW-18與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilissubsp.subtilis）168的遺傳距離最近，結合該菌株的形態(tài)特征，將菌株XW-18鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于16S rRNA基因序列菌株XW-18的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XW-18 based on 16S rRNA gene sequence

2.4 枯草芽孢桿菌XW-18產(chǎn)果膠酶條件優(yōu)化

2.4.1 碳源及其添加量對菌株的影響

碳源在微生物的培養(yǎng)過程中起著非常重要的作用，為微生物正常生長發(fā)育提供了物質(zhì)基礎。不同的碳源對菌株的生長和產(chǎn)酶能力都會產(chǎn)生影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入30 g/L不同的碳源，探究碳源對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長和產(chǎn)果膠酶的影響，結果見圖5。由圖5可知，當選擇蔗糖為碳源時，所產(chǎn)酶果膠酶活力最高，達到（970.78±7.37）U/mL。而以玉米漿干粉作為碳源時，果膠酶活力最低。此外，以可溶性淀粉作為碳源時，菌體量最高，說明以可溶性淀粉作為碳源有利于菌株的生長，但是會抑制菌株的產(chǎn)酶能力，降低菌株的產(chǎn)酶活性。而以蔗糖為碳源時，不僅能促進菌株生長，還能提高菌株的產(chǎn)酶活性，因此選擇蔗糖作為枯草芽孢桿菌XW-18發(fā)酵產(chǎn)酶的碳源。

圖5 不同碳源對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on growth and pectinaseproducing activity of strain XW-18

不同蔗糖添加量對菌株生長和產(chǎn)酶活性的影響見圖6。由圖6可知，隨著蔗糖添加量的增加，菌株所產(chǎn)果膠酶的活性逐漸升高，在蔗糖添加量為40 g/L時果膠酶酶活達到最高值，為（1 702.43±13.14）U/mL。因此最適蔗糖添加量為40 g/L。

圖6 蔗糖添加量對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.6 Effect of sucrose addition on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.2 氮源及其添加量對菌株的影響

氮源作為營養(yǎng)物質(zhì)廣泛參與到微生物的生長代謝、次生代謝產(chǎn)物合成中，其種類與用量會對微生物發(fā)酵過程產(chǎn)生重要影響[29]。在最優(yōu)碳源以及其添加量的基礎下，探究氮源種類及最佳氮源添加量對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長量和產(chǎn)果膠酶能力的影響，結果見圖7和圖8。

圖7 不同氮源對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

圖8 蛋白胨添加量對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.8 Effect of peptone addition on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

由圖7可知，當發(fā)酵氮源為蛋白胨時，菌體生長量（OD600nm值=4.69±0.09）及所產(chǎn)的果膠酶酶活[（1 406.77±2.36）U/mL]均為最高，因此選擇蛋白胨作為枯草芽孢桿菌XW-18發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的氮源。由圖8可知，隨著蛋白胨添加量的增加，菌株的菌體量和果膠酶酶活也隨著提高。當?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L時，枯草芽孢桿菌XW-18的菌體量（OD600nm值=6.81±0.04）和產(chǎn)酶活性[（1 563.35±4.96）U/mL]達到最高。隨后增加蛋白胨的含量，酶活跟生長量均下降，這可能是蛋白胨含量過高，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中C/N比例不適于菌株生長及產(chǎn)酶，導致菌體含量和酶活都降低。因此最佳蛋白胨添加量為20 g/L。

2.4.3 微量金屬元素對菌株的影響

在最佳碳源、氮源以及其添加量的基礎上，考察了1 mmol/L Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+微量金屬元素的加入對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長量和產(chǎn)果膠酶能力的影響，結果見圖9。由圖9可知，Mn2+能夠有效促進菌體生長，但會抑制菌株的產(chǎn)酶活性，而Zn2+和Co2+會抑制菌株的生長，但Co2+能夠稍微促進菌株產(chǎn)果膠酶。此外，Cu2+對菌體生長和菌株產(chǎn)酶活性均產(chǎn)生嚴重的抑制作用。尤其是Zn2+和Co2+添加下的菌體量受到明顯抑制，但是果膠酶酶活卻未出現(xiàn)明顯下降。因此，選擇不添加微量金屬元素進行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖9 不同微量金屬元素對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.9 Effect of different trace metal elements on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.4 發(fā)酵溫度對菌株的影響

不同發(fā)酵溫度對菌株XW-18菌體生物量及產(chǎn)果膠酶活性的影響見圖10。由圖10可知，隨著溫度的升高，菌株的生物量及產(chǎn)果膠酶活力均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，枯草芽孢桿菌XW-18的菌體量（OD600nm值=5.59±0.03）和產(chǎn)酶最高，果膠酶酶活力達到（1 332.06±3.64）U/mL。當培養(yǎng)溫度高于30 ℃后，菌株的產(chǎn)酶活力開始下降。培養(yǎng)溫度是影響微生物代謝的關鍵因素之一，有研究表明果膠酶產(chǎn)生菌發(fā)酵溫度過高或過低都不利于菌株生長，進而影響果膠酶的產(chǎn)生和釋放[13]。因此，選擇30 ℃作為枯草芽孢桿菌XW-18發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的最適溫度。

圖10 不同發(fā)酵溫度對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.10 Effect of different fermentation temperature on growth and pectinase-producing activity of strain XW-18

2.4.5 初始pH值對菌株的影響

探究了培養(yǎng)基初始pH值對枯草芽孢桿菌XW-18菌體生長和產(chǎn)果膠酶能力的影響，結果見圖11。由圖11可知，隨著初始pH值的不斷升高，菌株的產(chǎn)酶活力先升高后下降，當pH值為7時，菌株產(chǎn)酶能力最高，酶活力達到（1 556.19±2.75）U/mL，說明菌株產(chǎn)果膠酶的最佳初始pH值為7。此外，該菌株在初始pH 5～11之間生長良好，其中，當初始pH為9時，菌體生物量最大，OD600nm值為5.51±0.01，但在初始pH為9時的果膠酶酶活[（1 030.84±4.96）U/mL]要遠低于初始pH為7時的果膠酶酶活[（1 556.19±2.75）U/mL]。而兩者的菌體生物量相差不大（pH 7時的OD600nm值為5.41±0.01）。因此，菌株生長發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳初始pH為7。值得注意的是，除了在最適初始pH下，枯草芽孢桿菌XW-18在初始pH值范圍為3.0～13.0之間均具有產(chǎn)酶活力，說明該菌株的生長和產(chǎn)果膠酶均展現(xiàn)出了廣泛的pH適應性。

圖11 不同初始pH對菌株XW-18生長量和產(chǎn)果膠酶活性的影響Fig.11 Effect of different initial pH on growth and pectinaseproducing activity of strain XW-18

2.5 響應面試驗設計及結果

根據(jù)上述單因素試驗的結果，以蔗糖添加量（A）、蛋白胨添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、初始pH值（D）為評價因素，果膠酶酶活力（Y）作為考察指標，用Design-Expert V12.0.3.0軟件設計4因素3水平的響應面試驗，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 菌株XW-18產(chǎn)酶條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for enzyme production conditions optimization of strain XW-18

續(xù)表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert V12.0.3.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到以酶活性為響應值的回歸方程為：Y=1 804.32+128.29A+18.84B-21.53C-113.19D+6.76AB+13.91AC+111.47AD-47.09BC-58.02BD-7.55CD-253.72A2-187.75B2-79.66C2-134.10D2。

由表4可知，回歸方程的決定系數(shù)R2=0.855 5，表明其擬合度較好；而變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=7.20%表明試驗的重復性較高；模型的P值=0.001 0＜0.05，說明對結果影響極顯著；而失擬項的P值=0.063＞0.05，說明失擬項不顯著。發(fā)酵條件的4個因素對酶活性的影響大小為A＞D＞C＞B，其中因素A和D對結果影響極顯著（P＜0.01），說明蔗糖添加量及培養(yǎng)基初始pH會對枯草芽孢桿菌XW-18產(chǎn)果膠酶產(chǎn)生極顯著的影響，此外，二次項A2、B2、D2對結果影響也極顯著（P＜0.01），其余因素影響不顯著（P＞0.05）。利用Design-Expert V12.0.3.0軟件對蔗糖添加量、蛋白胨添加量、發(fā)酵溫度以及初始pH這4個因素之間的交互作用進行了響應面圖繪制，結果見圖12。

圖12 各因素間交互作用對果膠酶活性影響的響應面和等高線Fig.12 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on pectinase activities

由圖12可知，蛋白胨添加量與蔗糖添加量之間所形成的交互作用最弱，而初始pH與蔗糖添加量所形成的交互作用最強。結合方差分析可知各因素交互作用大小為AD＞BD＞BC＞AC＞CD＞AB。綜合響應面結果，得出枯草芽孢桿菌XW-18產(chǎn)果膠酶的最優(yōu)發(fā)酵條件為：蔗糖添加量41.69 g/L，蛋白胨添加量20.64 g/L，發(fā)酵溫度29.72 ℃，初始pH 6.25，此方程預測的最大酶活可達1 839.07 U/mL。為了操作方便，修正發(fā)酵參數(shù)為：蔗糖添加量40 g/L，蛋白胨添加量20 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 7.0。在此優(yōu)化條件下進行3次重復性試驗，其果膠酶酶活力為（1 804.32±55.28）U/mL，結果與預測值基本符合，表示該模型與實際情況基本吻合，擬合良好。

3 結論

本研究從廣東省湛江市徐聞縣曲界鎮(zhèn)菠蘿種植地里的土壤中分離到一株產(chǎn)果膠酶的菌株XW-18，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），同時對其發(fā)酵產(chǎn)酶工藝進行了優(yōu)化，得到該菌最佳產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件為：蔗糖添加量40 g/L，蛋白胨添加量20 g/L，發(fā)酵溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH 7.0，在此條件下，果膠酶酶活力提高到（1 804.32±55.28）U/mL?？梢姡狙芯坎粌H豐富了產(chǎn)果膠酶的微生物種質(zhì)資源，而且通過發(fā)酵工藝優(yōu)化使其產(chǎn)酶得到大幅提高，為后續(xù)的工業(yè)應用提供了基礎。