赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒揮發(fā)性風味物質差異分析

曾慶軍，周鴻翔，2*，曾佳佳，邱樹毅，2，劉 凡

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州白酒交易所，貴州 貴陽 550081；4.貴州數(shù)字白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，貴州 貴陽 550081）

醬香型白酒是各大香型白酒中釀造工藝、微生物體系和風味結構最為復雜的，醬香白酒的不同風格特征與不同類型的基酒勾調密切相關，如不同產(chǎn)地基酒中各類風味化合物含量與種類有較大差異。據(jù)初步統(tǒng)計，貴州赤水河流域白酒企業(yè)有400家，白酒產(chǎn)能達到40萬kL，其中醬香型白酒產(chǎn)能約30萬kL，白酒中的風味成分會受到產(chǎn)區(qū)因素的影響，即使是同種工藝類型的白酒，產(chǎn)區(qū)環(huán)境和氣候條件都會造成白酒風味的差異[1]。貴州各地具有獨特的土壤、水分、地勢條件等一系列自然條件，因此不同流域釀造出來的白酒具有不同的口感和風味。對赤水河流域各大醬酒產(chǎn)業(yè)不同空間分布及特征影響進行深入研究分析，對于建立赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒特征模型有重要意義。

近年來，隨著氣相色譜（gas chromatography，GC）分析技術廣泛應用于白酒香氣物質的定性定量分析使得白酒質量、香型、品牌的鑒別結果更加準確[2-4]。統(tǒng)計學分析已經(jīng)逐步滲入到食品科學領域，與儀器檢測相結合展示了較高的優(yōu)越性。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種比較常用的多元統(tǒng)計分析方法，常用于酒類、茶葉和食品等領域[5-8]，正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least-squares-discrimination analysis，OPLS-DA）是在偏最小二乘-判別分析（partial least-squares-discrimination analysis，PLS-DA）的基礎上，進行了正交變換的矯正，判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。李愛蘭等[9]使用吹掃捕集-氣質聯(lián)用方法鑒別不同產(chǎn)地、品牌濃香型白酒?；跐庀阈桶拙频膿]發(fā)性風味成分的差異，通過OPLS-DA可對其產(chǎn)地進行準確區(qū)分，通過變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）值分析篩選出辛酸乙酯、己酸己酯等40種潛在差異性化合物。程平言等[10]對于白酒原產(chǎn)地的鑒定通過偏最小二乘-判別分析法和逐步線性判別分析法篩選出27個重要特征離子，然后用篩選出的27個特征離子構建反向傳播（back propagation，BP）神經(jīng)網(wǎng)絡模型和支持向量機（support vector machine，SVM）模型，其原產(chǎn)地預測準確率分別達96.2%和97.7%。

本研究以赤水河不同產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒為研究對象，采用氣相色譜法對酒樣中的64種揮發(fā)性風味物質進行定量分析及差異分析，采用正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）構建模型，并利用變量投影重要性（VIP）值篩選差異揮發(fā)性風味化合物，并進行聚類分析（cluster analysis，CA）。以期對醬香型地域劃分、企業(yè)品牌標準體系建立提供研究基礎與理論指導，對醬香產(chǎn)區(qū)分類有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

51個醬香白酒樣品，其中包括16個MT產(chǎn)區(qū)系列酒樣（MT1～MT16），9個ZJ產(chǎn)區(qū)系列酒樣（ZJ1～ZJ9），11個XJ產(chǎn)區(qū)系列酒樣（XJ1～XJ11），10個JS產(chǎn)區(qū)系列（JS1～JS10）酒樣，5個LJ產(chǎn)區(qū)系列酒樣（LJ1～LJ5），均由市場采購獲得。

叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（純度均＞98%）、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯等35個標準品（純度≥97.0%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醛（純度≥97.0%）：美國Sigma-Aldrich公司；2-甲基丁酸乙酯（純度≥97.0%）：上海賢鼎生物科技有限公司；異戊酸乙酯、丁二酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯等標準品（純度均≥97.0%）：上海易恩化學技術有限公司；庚酸乙酯、壬酸乙酯、異丁醇、2,3-丁二醇、異戊醛（純度均≥97.0%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；PAL多功能自動進樣器：瑞士斯特分析儀器有限公司；Millipore-Q超純水系統(tǒng)、2 mL進樣瓶：佰奧萃（天津）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣預處理

移取5 mL酒樣過0.22 μL有機濾膜，吸取990 μL過膜后的酒樣于2 mL氣相進樣瓶中，加入體積分數(shù)1%的叔戊醇（內標）溶液10 μL，加蓋密封，備用，每個樣品重復2～3次。

1.3.2 揮發(fā)性風味物質檢測

采用氣相色譜法檢測白酒樣品中的揮發(fā)性風味物質。

GC條件：SH-Rtx-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氮氣（N2）（99.999%）；進樣口溫度250 ℃；分流比30∶1；檢測器溫度250 ℃；氫氣流量30 mL/min，空氣流量300mL/min，升溫程序為初始溫度30℃，保持3min，以3℃/min升溫至180 ℃，再以15 ℃/min升溫至210 ℃，保持8 min。

定性、定量分析：采用保留時間定性，根據(jù)張曉婕等[11]方法對白酒風味進行定量，以待測物與內標物的含量比（X）為橫坐標，峰面積比（Y）為縱坐標，采用內標法定量酒樣中各風味物質。繪制各揮發(fā)性風味物質的標準曲線，獲得其標準曲線回歸方程。

香氣活度值（odor active value，OAV）分析：通過查閱相關文獻確定每個物質閾值計算得到OAV，一般認為OAV＞1則代表該物質具有貢獻作用，計算公式如下：

式中：C為各揮發(fā)性物質質量濃度，mg/L；OT為各揮發(fā)性物質閾值，μg/L。

1.3.3 正交偏最小二乘-判別分析

從146個觀測值中篩選掉異常值后，從每個產(chǎn)區(qū)隨機選取3個樣本作為測試集，共計15個，其余樣本為訓練集，利用正交偏最小二乘-判別分析構建不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒鑒別模型。并利用VIP值篩選不同流域醬香白酒產(chǎn)區(qū)的揮發(fā)性差異物，根據(jù)所選差異物繪制層次聚類熱圖，直觀表達風味化合物的潛在聯(lián)系。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用SIMCA軟件13.0進行主成分分析以及模型構建。采用MetaboAnalyst2.0繪制聚類分析熱圖。

2 結果與分析

2.1 赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒揮發(fā)性風味物質分析

不同產(chǎn)區(qū)各揮發(fā)性風味化合物相對含量見表1，不同產(chǎn)區(qū)醬香型白酒揮發(fā)性風味物質測定結果及OAV見表2。由表1和表2可知，不同酒樣中共檢出揮發(fā)性風味化合物64種，其中，酯類19種，醇類13種，酸類8種，醛酮類7種，吡嗪類2種，呋喃類5種，芳香族類8種，酚類2種，不同產(chǎn)區(qū)酒樣的揮發(fā)性風味物質總含量存在差異，ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣揮發(fā)性風味物質總含量略偏低，為9 125.45 mg/L，其余酒樣總含量較為接近，為11 010.40～11 716.49 mg/L，這與李利利[14]的研究結果一致。不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒風味物質主要為酯類物質，其次是醇類、酸類、醛酮類，吡嗪類物質在白酒中含量極低，但賦予白酒堅果和焙烤香氣，對其他化合物有明顯的烘香作用[11]。酯類物質在白酒中能賦予其花香和果香[15]，對白酒空杯后味具有貢獻，酸類化合物是重要的呈味物質，能夠調和酒體口味、穩(wěn)定香氣[15]，醇類物質沸點低易揮發(fā)，對白酒風味層次具有貢獻作用[16]。XJ和MT產(chǎn)區(qū)酒樣中的酯類物質和酸類物質含量較高，且酯類物質中的乙酸乙酯和酸類物質中的乙酸在醬香型白酒樣品中的含量最高。JS產(chǎn)區(qū)酒樣的酯類物質含量最低，但醇類、呋喃類化合物含量最高，LJ產(chǎn)區(qū)酒樣的酚類化合物和醛酮類化合物明顯高于其他產(chǎn)區(qū)，MT產(chǎn)區(qū)酒樣與LJ產(chǎn)區(qū)酒樣相反，ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣中的芳香族類物質相對含量最高。

表1 不同產(chǎn)區(qū)酒樣各類揮發(fā)性風味化合物相對含量Table 1 Relative contents of various types of volatile flavor compounds in Baijiu samples from different producing areas

表2 不同產(chǎn)區(qū)醬香型白酒揮發(fā)性風味物質測定結果及香氣活度值Table 2 Determination results of volatile flavor compounds and odor active value of sauce-flavor Baijiu from different producing areas

XJ和MT產(chǎn)區(qū)酒樣酯類和酸類化合物含量明顯高于其他產(chǎn)區(qū)的原因主要是乙酸乙酯和乙酸含量高，乙酸乙酯和乙酸是醬香白酒中占比最大的酯類和酸類物質。此外，OAV結果表明，乙酸苯乙酯只對XJ產(chǎn)區(qū)酒樣有香氣貢獻，乙酸苯乙酯在釀造過程中合成率較低，XJ產(chǎn)區(qū)酒樣可能具有更多適宜具有合成乙酸苯乙酯能力的微生物。通過計算OAV可知，正戊醇和2-庚醇對JS和LJ產(chǎn)區(qū)酒樣有香氣貢獻，對XJ和MT產(chǎn)區(qū)酒樣則無香氣貢獻，這可能是造成它們香氣差異的主要物質。辛醇對JS產(chǎn)區(qū)酒樣無香氣貢獻，而對其余酒樣均有貢獻，苯甲醛只對JS產(chǎn)區(qū)酒樣有香氣貢獻。

為進一步分析赤水河五個不同產(chǎn)區(qū)的醬香白酒的香氣特征化合物，以對五種酒樣的香氣具有貢獻的化合物（OAV＞1）做載荷分析，結果見圖1。由表1和圖1可知，碳原子數(shù)＞4的酯類物質對LJ產(chǎn)區(qū)酒樣影響較大，包括辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯，其中己酸乙酯呈水果香和花香，LJ產(chǎn)區(qū)酒樣果香味較濃，己酸乙酯含量明顯高于其他幾個酒樣，分析原因可能是LJ產(chǎn)區(qū)酒樣既生產(chǎn)醬香型白酒又生產(chǎn)濃香型白酒，己酸乙酯是濃香型白酒中酯類物質含量最高的物質，在LJ產(chǎn)區(qū)釀造環(huán)境和釀造工藝中存在一些己酸乙酯的代謝物。乙酸、乙酸乙酯與丙酸、丙酸乙酯之間會發(fā)生水解和酯化反應，該四種化合物與MT產(chǎn)區(qū)酒樣相關性較大，異戊醛、異戊醇、丁酸乙酯、糠醛對JS產(chǎn)區(qū)酒樣貢獻較大，與ZJ和XJ產(chǎn)區(qū)酒樣相關性較大的多為一些酯類化合物，如異丁酸乙酯、癸酸乙酯、壬酸乙酯、異戊酸乙酯、癸酸乙酯、乳酸乙酯。

圖1 基于OAV＞1的特征化合物不同產(chǎn)區(qū)酒樣的主成分分析載荷圖Fig.1 Load diagram of principal component analysis of Baijiu samples from different regions based on characteristic compounds with OAV＞1

2.2 不同產(chǎn)區(qū)醬香型白酒揮發(fā)性風味物質差異分析

2.2.1 主成分分析

對赤水河流域五個不同產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒中的64個揮發(fā)性風味物質含量的數(shù)據(jù)進行處理，PCA散點圖見圖2。由圖2可知，五個產(chǎn)區(qū)白酒樣品大致被分成三類，LJ產(chǎn)區(qū)酒樣位于坐標軸左下方，JS產(chǎn)區(qū)酒樣集中位于坐標軸左上軸。MT產(chǎn)區(qū)酒樣位于坐標軸右上半軸，XJ和ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣基本位于坐標軸下半軸。ZJ、XJ、MT三大產(chǎn)區(qū)酒樣則集中分布在原點附近，聚集度較高。JS產(chǎn)區(qū)酒樣組內分布較為散亂，可能是JS產(chǎn)區(qū)酒樣中存在部分年份白酒，放置一段時間后風味物質含量發(fā)生了改變。據(jù)文獻報道，金沙地區(qū)醬香白酒分布較為集中，茅臺鎮(zhèn)核心地區(qū)、習水地區(qū)分布聚攏，這可能是因為金沙醬酒與其他幾個地區(qū)醬香白酒的礦質含量有差異[17]。由此可見，JS與LJ產(chǎn)區(qū)酒樣組間差異大，與其余三個產(chǎn)區(qū)分布明顯區(qū)分開，XJ、MT和ZJ三個產(chǎn)區(qū)酒樣的風味物質分布較一致的原因可能是地理位置接近，環(huán)境條件以及微生物種類較相似。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)酒樣揮發(fā)性風味物質主成分分析散點圖Fig.2 Scatter plots of principal component analysis of volatile flavor compounds in Baijiu samples from different producing regions

2.2.2 模型構建及驗證

總體來看，雖然五個產(chǎn)區(qū)白酒大致被區(qū)分開，但組間和組內之間分布都較為散亂，為建立一個快速準確的赤水河流域產(chǎn)區(qū)鑒別模型，采用Hotelling's T2和DmodX法排除異常值，主成分分析的異常值篩選見圖3。由圖3可知，排除異常值15個，剩下116個訓練集、15個測試集基于揮發(fā)性風味物質含量結果對不同赤水河流域產(chǎn)區(qū)醬香型白酒構建模型。

圖3 主成分分析的異常值篩選Fig.3 Abnormal value screening of principal component analysis

篩選完異常值后，將剩余訓練集樣品的揮發(fā)性風味化合物定量結果構建OPLS-DA模型，結果見圖4。由圖4可知，MT產(chǎn)區(qū)酒樣基本與XJ和ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣分離開，但XJ和ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣分離效果依然不佳?？傮w來說模型分類良好，且模型的解釋變量（R2Y）和預測能力（Q2Y）分別為0.966和0.945。

圖4 不同酒樣揮發(fā)性風味化合物正交偏最小二乘-判別分析Fig.4 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis of volatile flavor compounds in different Baijiu samples

此外進行了200次的置換檢驗，結果見圖5。由圖5可知，置換檢驗的R2截距為0.926，Q2截距為-0.454，且圖中左側的點均低于右側的點，說明模型對數(shù)據(jù)未過擬合。

圖5 置換檢驗結果Fig.5 Results of the permutation test

將從每個產(chǎn)區(qū)隨機抽取三個觀測值作為測試集代入上述模型中，以評估模型對于不同產(chǎn)區(qū)的識別情況，五個不同產(chǎn)區(qū)的訓練集和測試集在兩個模型中的分布情況見圖6。由圖6可知，大多數(shù)酒樣正確分布到相應的區(qū)域，個別酒樣除外。

圖6 測試集酒樣分布Fig.6 Distribution of test set Baijiu samples

2.3 差異揮發(fā)性風味化合物的篩選

VIP值可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻度[18]，VIP值越大，認為變量在不同產(chǎn)地間差異越顯著[19]，以VIP值＞1為篩選標準，確認了28種對赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)白酒具有貢獻的物質。赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)醬香型白酒風味物質VIP分布圖見圖7。

圖7 基于正交偏最小二乘-判別分析不同酒樣揮發(fā)性風味物質變量投影重要性值Fig.7 Variable importance in the projection values of volatile flavor compounds in different Baijiu samples based on orthogonal partial least squares-discriminant analysis

由圖7可知，28種對赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)白酒具有貢獻的物質為2-丁基呋喃、壬酸乙酯、癸酸、2-壬酮、乳酸乙酯、仲丁醇、乙酸、乙偶姻、肉豆蔻酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪、癸酸乙酯、異戊醛、乙酸乙酯、己醛、2,3,5-三甲基吡嗪、辛酸乙酯、正丙醇、鄰苯二甲酸二丁酯、異戊醇、異丁醛、2-戊醇、苯乙酸乙酯、2-壬醇、庚酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸、糠醛、丁酸。其中，2-丁基呋喃（1.60）、壬酸乙酯（1.40）、癸酸（1.30）對區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)酒樣貢獻度更大。

為進一步探索赤水河流域不同產(chǎn)區(qū)醬酒風味差異物，根據(jù)VIP值篩選出來的28種潛在差異物繪制聚類熱圖，直觀展示了64種揮發(fā)性風味成分在不同產(chǎn)區(qū)間的分布規(guī)律，結果見圖8。由圖8可知，不同產(chǎn)區(qū)的酒樣之間分類效果較好，LJ和JS產(chǎn)區(qū)酒樣明顯區(qū)分于其他三個酒樣，MT、ZJ和XJ產(chǎn)區(qū)酒樣風格類似，其中MT和ZJ產(chǎn)區(qū)酒樣聚類效果更佳。不同產(chǎn)區(qū)醬香白酒中的關鍵差異物是造成不同酒樣品質風格不同的主要原因，五個產(chǎn)區(qū)被分成不同類別，進一步驗證了赤水河流域不同醬香白酒產(chǎn)區(qū)風格差異顯著性。

圖8 不同酒樣揮發(fā)性風味化合物的聚類分析熱圖Fig.8 Heat map of cluster analysis of volatile flavor compounds in different Baijiu samples

其中庚酸乙酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、己酸在LJ和JS產(chǎn)區(qū)酒樣含量明顯高于其他三個產(chǎn)區(qū)，根據(jù)定量結果可知，LJ和JS產(chǎn)區(qū)酒樣的己酸乙酯含量偏高，己酸乙酯是濃香型白酒中酯類物質含量最高的物質，在LJ產(chǎn)區(qū)釀造環(huán)境和釀造工藝中存在一些己酸乙酯的代謝物，這與唐平等[20-21]研究結果一致。JS產(chǎn)區(qū)酒樣的異丁醛、異戊醛、糠醛和異戊醇含量較高，糠醛是醬酒中的主要呋喃類物質，高沸點、不易揮發(fā)，具有空杯留香的特點，其在JS產(chǎn)區(qū)酒樣中的含量遠遠高于其他產(chǎn)區(qū)，JS醬酒濃郁的空杯香很有可能就是高含量、高沸點的糠醛與其他香氣物質形成的復合香氣。這與周靖等[22]對金沙醬酒風味研究研究結果一致，XJ產(chǎn)區(qū)酒樣中的乙酸和乙酸乙酯含量最高，乙酸是白酒中最豐富的酸，具有酸香和醋香氣味，它由酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生[23]，脂肪酸通過酯類水解來促進XJ產(chǎn)區(qū)酒樣的香氣平衡，這對芳香酯含量有重要影響。MT產(chǎn)區(qū)酒樣的吡嗪類物質含量相對于其他產(chǎn)區(qū)而言較高，大部分吡嗪類物質對人體健康有益，吡嗪類物質是醬香白酒焦香風味的主要來源[24]。異戊醛、異戊醇、丁酸乙酯、糠醛對JS產(chǎn)區(qū)酒樣貢獻較大，這與張情亞等[25]研究結果一致。

3 結論

本研究圍繞了赤水河流域中的JS、LJ、ZJ、MT、ZJ五個不同產(chǎn)區(qū)代表性的52個樣品醬香型白酒中的64種揮發(fā)性物質定量結果進行分析。主成分分析結果顯示，JS產(chǎn)區(qū)和LJ產(chǎn)區(qū)酒樣明顯與其他產(chǎn)區(qū)酒樣分開，ZJ、XJ產(chǎn)區(qū)酒樣聚集度較高，MT產(chǎn)區(qū)酒樣靠近ZJ和XJ產(chǎn)區(qū)酒樣，總體來說，五個產(chǎn)區(qū)的醬香白酒風味分布有一定的差異性。利用PCA和OPLS-DA建立赤水河流域不同醬香白酒產(chǎn)區(qū)分類模型，部分酒樣作為驗證模型，模型預測率為100%，基本可以實現(xiàn)不同產(chǎn)區(qū)的醬香白酒鑒別。根據(jù)VIP值篩選出的28種重要差異物做聚類分析熱圖以直觀表達不同流域產(chǎn)區(qū)白酒風味成分分布規(guī)律，結合載荷圖和OAV分析最終確立了19個對貴州不同產(chǎn)區(qū)風味物質差異具有貢獻的物質，包括6種酯類、3種酸類、2種醛類、3種醇類、2種吡嗪類、1種呋喃類、2種芳香族類物質。本研究可對赤水河不同流域產(chǎn)區(qū)白酒風味差異提供一定的數(shù)據(jù)和理論支持，豐富了不同產(chǎn)區(qū)白酒的地理環(huán)境存在差異，為了建立更具實用價值、更穩(wěn)定的白酒判別模型，還需擴大采樣范圍和樣本量進行更深層次的研究。