基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建青鳉突變體

潘啟華，陸 可，羅君志，蔣月雯，夏必琳，陳 磊，王夢(mèng)洋，戴榮貴，陳天圣*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

基因編輯技術(shù)是研究基因功能的重要手段之一，其利用嵌合的核酸酶誘導(dǎo)靶向DNA 雙鏈斷裂來(lái)刺激細(xì)胞啟動(dòng)DNA 修復(fù)機(jī)制，這一機(jī)制包括容易出錯(cuò)的非同源末端連接和同源定向修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)有效且精確的遺傳修飾[1]。作為第三代基因編輯系統(tǒng)，CRISPR/Cas9 是由具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9 蛋白和特異的單鏈導(dǎo)向RNA (single guide RNA,sgRNA)組成的復(fù)合體[2-3]。由于其易于設(shè)計(jì)、使用簡(jiǎn)單以及高效的突變等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)迅速在包括斑馬魚(Danio rerio)和青鳉(Oryzias latipes)在內(nèi)的多種生物體中廣泛運(yùn)用[4-9]，并且成為目前分子育種的重要手段之一。

青鳉隸屬于鳉形目(Cyprinodontiformes)青鳉科(Oryzlatidae)青鳉屬，具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、耐受力強(qiáng)、性成熟時(shí)間短、繁殖能力強(qiáng)、基因組和轉(zhuǎn)錄組信息較為完善等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。此外，細(xì)胞移植技術(shù)、顯微注射技術(shù)、多種分子生物學(xué)技術(shù)在青鳉中的應(yīng)用及其多種干細(xì)胞的建立，使其成為研究基因功能、器官發(fā)生和發(fā)育機(jī)制的良好模型[13-17]。

盡管目前已經(jīng)有很多研究報(bào)道了利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在青鳉中成功構(gòu)建了突變體[18-20]，如Fang 等[4]運(yùn)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成功敲除青鳉tyr基因，導(dǎo)致其眼部黑色素的缺失，快速獲得了白化的突變品系。Sawamura 等[21]采取雙sgRNA的方法成功獲得了青鳉dnd突變的F0，以及非編碼RNA 突變體的構(gòu)建[22]。但是這些文獻(xiàn)中并沒(méi)有構(gòu)建青鳉突變體的完整詳細(xì)方案和步驟，因此本研究結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)室敲除青鳉Olpax6.1 的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了從gRNA 的設(shè)計(jì)到獲得純合突變體的整個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程，為青鳉突變體的構(gòu)建提供技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)為其他魚類突變體的構(gòu)建提供技術(shù)參考，以期對(duì)養(yǎng)殖品種的分子育種有所幫助。

1 材料與方法

1.1 青鳉的飼養(yǎng)及胚胎

青鳉HdrR 品系飼養(yǎng)在光照14 h、黑暗10 h的循環(huán)水系統(tǒng)中，每日投喂豐年蟲(chóng)3 次。收集胚胎時(shí)，先將性成熟雌雄魚提前1 天用透明隔板分開(kāi)，次日取出隔板使雌雄魚自然交配產(chǎn)卵。待雌魚產(chǎn)卵后，小心地將胚胎從雌魚的生殖孔輕輕取下并用鑷子將卵絲和胚胎分離，隨后在28 °C 的恒溫箱中用胚胎培養(yǎng)液(1.00 g NaCl、0.03 g KCl、0.04 g CaCl2·2H2O、0.16 g MgSO4·7H2O，加入 10 mL 0.01%亞甲基藍(lán)溶液充分混勻后定容到1 L)進(jìn)行培養(yǎng)[23]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范，并按照集美大學(xué)倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 gRNA 的設(shè)計(jì)

本研究以青鳉Olpax6.1 基因 (Gene ID：100049356)的敲除為例，首先在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到所需要的基因組序列，用Snapgene 軟件(https://www.snapgene.com/)標(biāo)記好外顯子和內(nèi)含子的位置，確定需要敲除的位置，通常gRNA 的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在靠近翻譯起始位點(diǎn)ATG 的下游。打開(kāi)ChopChop (http://chopchop.cbu.uib.no/)網(wǎng)站，將gene ID 放入Target 框中，也可以點(diǎn)擊“Paste target”將Target 框中的gene ID 模式切換到基因序列模式，將基因的序列復(fù)制到Target 框中；點(diǎn)擊In 框中選擇序列相應(yīng)的物種；在Using 框中選擇敲除的系統(tǒng)，本研究主要基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，因此在Using 框中選擇CRISPR/Cas9；全部填寫完成后點(diǎn)擊“Find Target Sites！”，網(wǎng)頁(yè)設(shè)計(jì)完成后會(huì)顯示出結(jié)果。一般該設(shè)計(jì)網(wǎng)站會(huì)根據(jù)Efficiency 和Off-targets 給出相應(yīng)的Ranking，此時(shí)應(yīng)選擇在基因翻譯起始密碼子下游Ranking 排名較前、Efficiency 高以及Off-targets少的靶位點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)，一般至少選擇3 個(gè)靶點(diǎn)以提高編輯的有效性。gRNA 設(shè)計(jì)完成后，再設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增該靶點(diǎn)的PCR 檢測(cè)引物(圖1)。

圖1 Olpax6.1 gRNA 及檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)黑色方框代表編碼的外顯子，白色方框代表非編碼的外顯子，紅色箭頭代表gRNA 的位置，紅色三角形代表檢測(cè)引物。Fig.1 Design of Olpax6.1 gRNA and detection primersBlack boxes represent coding exons,white boxes represent non-coding exons,the red arrow represents the position of gRNA,the red triangles represent detection primer.

1.3 體外合成gRNA 和Cas9 mRNA

gRNA 模板的擴(kuò)增 將組成gRNA 的scaffold 序列(5′ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT 3′)進(jìn)行人工合成(武漢擎科生物科技有限公司)并連入pMD19-T 載體(TaKaRa，D102A)中形成pMD19-gRNA scaffold 質(zhì)粒備用。用gRNA 的上游引物(T7 啟動(dòng)子+靶位點(diǎn)5′-3′去掉NGG 的N20 個(gè)堿基+scaffold 5′端部分序列，如靶位點(diǎn)為5′ tgcctggtggaatccggcag-CGG 3′，則gRNA 上游引物為gRNAF: 5′ TGTAATACGACTCACTATAGGtgcctggtggaatccggcagGTTTTAGAGCTAGAAAT 3′) (下劃線為T7 啟動(dòng)子序列)和下游通用引物(gRNA-R: 5′ AAA AGCACCGACTCGGTGCC 3 ′)以 pMD19-gRNA scaffold 質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：25 μL 2× Phanta Max Master Mix (Vazyme，P515-01)，2.5 μL gRNA-F+gRNA-R (10 μmol/L)，2.5 μL pMD19-gRNA scaffold 質(zhì)粒(1 ng/μL)，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL，總共擴(kuò)增8 管。擴(kuò)增條件：95 °C 3 min；95 °C 30 s，58 °C 30 s，72 °C 10 s，28 個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min，4 °C ∞。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit (OMEGA，D2500-02)回收，最后加入15 μL RNase-free 水溶解，用NanoDrop 2000 (ThermoFisher)測(cè)定濃度待用。

Cas9 mRNA 模板的制備 先將CMV-T7的序列結(jié)構(gòu)插入pT3TS-nCas9n 質(zhì)粒[24]中Cas9 的上游構(gòu)建pCMV-zCas9 質(zhì)粒[4]，利用XbaⅠ (NEB，#R0145V)將10 μg 的pCMV-zCas9 質(zhì)粒進(jìn)行線性化，反應(yīng)體系為pCMV-zCas9 10 μg，Cutsmart 緩沖液10 μL，XbaⅠ 4 μL，補(bǔ)充雙蒸水至100 μL。37 °C 孵育5 h，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit (OMEGA，D2500-02)回收，再加入15 μL RNase-free 水溶解，用Nano-Drop 2000 (ThermoFisher)測(cè)定濃度待用。

體外轉(zhuǎn)錄與純化RNA 用TranscripAid T7 High Yield Kit (ThermoFisher，#K0441)對(duì)gRNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得gRNA。反應(yīng)體系：gRNA模板1 μg，ATP/CTP/GTP/UTP 各1 μL，5×TranscriptAid Reaction Buffer 2 μL，TranscriptAid Enzyme Mix 1 μL，補(bǔ)充RNase-free 水至10 μL，混合均勻。

用mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Invitrogen，AM1344)對(duì)Cas9 mRNA 模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA。反應(yīng)體系：2×NTP/CAP 10 μL，10×Reaction buffer 2 μL，Cas9 mRNA 模板1 μg，T7 Enzyme Mix 2 μL，補(bǔ)充RNase-free 水到20 μL，混合均勻。

上述兩種體系配制完成后，放入37 °C 水浴鍋中孵育4 h。孵育完成后，取1 μL 轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效果。隨后加入1 μL DNase Ⅰ至轉(zhuǎn)錄體系中，混合均勻，37 °C 孵育15 min。之后，向反應(yīng)體系中加入30 μL 7.5 mol/L 的LiCl 溶液和30 μL RNase-free 水，混合均勻，-20 °C 沉淀過(guò)夜。混合液于4 °C，12 000 r/min 離心20 min，棄上清液。然后加入1 mL 75%乙醇(DEPC 水配制)懸浮沉淀，于4 °C，12 000 r/min 離心10 min 后棄上清液；重復(fù)1 次。吸干水分并自然干燥，加入20 μL RNase-free 水溶解，取1 μL 轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行分裝。gRNA 分裝濃度為250 ng/μL；Cas9 mRNA 分裝時(shí)每管的量為1 500～2 500 ng，體積小于4 μL，-80 °C 長(zhǎng)期保存。

1.4 顯微注射

顯微注射之前需提前制作注射針和注射槽。利用拉針儀(Narishige，PC-100，圖2)對(duì)外徑1.00 mm、內(nèi)徑0.58 mm 的玻璃細(xì)管(Sutter，BF100-58-10)進(jìn)行拉制獲得注射針。拉針儀的程序?yàn)長(zhǎng)v1：86.0，Lv2：52.6，重力模塊調(diào)至5。注射針拉制完成后，在體視顯微鏡(江南，JSZ8) 4×物鏡下，用鑷子輕輕觸碰針尖進(jìn)行斷針處理(圖3-a)。顯微注射凹槽的制作：用無(wú)菌水配制1.5%的瓊脂糖，微波爐融化后冷卻至50～60 °C，倒入90 mm 培養(yǎng)皿中并放置顯微注射凹槽模具(圖3-b，c)，待瓊脂糖凝固后，用鑷子拔出凹槽模具即可(圖3-d)。凹槽模具為有機(jī)玻璃自制。利用微量上樣槍頭(Eppendorf，E270452J)將終濃度為300～500 ng/μL的Cas9 mRNA、終濃度為30～50 ng/μL 的gRNA以及終濃度為0.1%的酚紅注射混合液加入針管中，隨后將針管插入固定在顯微操作器的亞克力夾持器(圖2)上。將前一晚隔離雌雄魚的隔板抽出，使雌雄魚進(jìn)行交配和自然產(chǎn)卵，15～30 min 后將懸掛在雌魚泄殖孔的胚胎輕輕取下，放入盛有胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下用鑷子將黏附在胚胎上的絲狀物剝離，用巴氏吸管將分離的胚胎轉(zhuǎn)移到注射凹槽中，在體視顯微鏡2.5×視野下將細(xì)胞團(tuán)翻轉(zhuǎn)朝上，調(diào)節(jié)顯微注射系統(tǒng)(Warner，PL-100A，圖2)壓力，將注射時(shí)間調(diào)節(jié)為0.2～0.3 s，注射壓調(diào)節(jié)為70 kPa，平衡壓調(diào)節(jié)為20 kPa，用手指調(diào)節(jié)顯微操作器(圖2)以控制針的方向，用腳踩在腳踏板上控制注射開(kāi)關(guān)，將混合液注射到青鳉胚胎的1 細(xì)胞中。注射完成后用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎，并置于28 °C 恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖2 顯微注射操作系統(tǒng)Fig.2 Microinjection operating system

圖3 青鳉顯微注射的針與模具的制備(a)注射針斷與未斷的對(duì)比，比例尺：100 μm；(b)顯微注射凹槽模具的側(cè)視圖；(c)顯微注射凹槽模具的俯視圖；(d)瓊脂糖凝膠制備的顯微注射凹槽。Fig.3 Preparation of needle and mold for microinjection of O.latipes(a) comparison of broken and unbroken injection needles,scale bar: 100 μm;(b) side view of microinjection groove mold;(c) top view of microinjection groove mold;(d) preparation of microinjection groove using agarose gel.

1.5 突變位點(diǎn)的體內(nèi)檢測(cè)

將注射后的胚胎培養(yǎng)至第4 天，隨機(jī)選取8個(gè)胚胎，用堿裂解法分別提取單個(gè)胚胎的基因組DNA，實(shí)驗(yàn)方法：取單個(gè)胚胎，加入50 μL 50 mmol/L 的NaOH 溶液，95 °C 孵育處理30 min，取出冷卻后，加入10 μL 0.5 mol/L 的Tris-HCl 溶液混勻。以基因組DNA 為模板，用檢測(cè)引物對(duì)gRNA 靶點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物為DF：5′ TTT GCTCATTGATACTGTTGTGGGT 3′，DR：5′ ATG TCATGCCTTTGTTGCCC 3′。擴(kuò)增體系為2 μL 粗提基因組DNA，5 μL 2×NG PCR MasterMix (HLingene，NG001S)，0.5 μL DF+DR (10 μmol/L)，2.5 μL 雙蒸水。擴(kuò)增條件為95 °C 3 min；95 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 5 min，4 °C ∞。擴(kuò)增后利用T7 Endonuclease Ⅰ (T7E1，Vazyme，EN3030-01)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切檢測(cè)突變情況，實(shí)驗(yàn)過(guò)程：取5 μL PCR 產(chǎn)物在95 °C PCR 儀變性5 min 后快速取出，在室溫條件下放置10 min，使其從95 °C 緩慢降至室溫。向變性后的PCR 產(chǎn)物加入4 μL 雙蒸水，1 μL 10×T7 Endonuclease Ⅰ Reaction Buffer 以 及0.1 μL T7 Endonuclease Ⅰ，混勻后37 °C 孵育30 min。孵育完成后，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若其顯示出多條帶，則PCR 片段有突變，反之則沒(méi)有突變。進(jìn)一步將陽(yáng)性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(生工生物工程上海股份有限公司)，在靶位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰為突變。檢測(cè)完成后將有突變的同批次胚胎培養(yǎng)至F0成魚。

1.6 純合子突變體的篩選

將F0成魚與野生型成魚進(jìn)行交配，隨機(jī)挑選雜交后的8 個(gè)胚胎進(jìn)行突變檢測(cè)，檢測(cè)步驟同上所述。若有突變則大量收集該組胚胎養(yǎng)至成魚，即為F1。剪F1尾鰭，經(jīng)堿裂解法粗提基因組DNA，利用PCR 和T7E1 酶切對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變的鑒定，若有突變，則將其PCR 產(chǎn)物連接pMD18-T 載體(TaKaRa，D102A)進(jìn)行單克隆測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將突變類型相同的F1成魚進(jìn)行雜交并大量收集該組胚胎養(yǎng)至成魚，即為F2。純合子突變體的篩選過(guò)程如圖4 所示，剪F2成魚尾鰭堿裂解法粗提基因組DNA，利用PCR 和T7E1 酶切對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變的鑒定，此時(shí)PCR 酶切產(chǎn)物中出現(xiàn)多條帶的個(gè)體為雜合突變體，若為單一條帶則是未突變個(gè)體和純合突變體。為了進(jìn)一步區(qū)分未發(fā)生突變個(gè)體和純合突變體，按照1∶1 的比例向單一條帶的PCR 產(chǎn)物中加入野生型的PCR 產(chǎn)物，再用T7E1 酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生多條帶的酶切產(chǎn)物則為純合突變體，其余的為未突變個(gè)體。最后將T7E1 酶切初篩為純合突變體的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以確定缺失的序列，從而確定純合突變品系。

圖4 青鳉純合子突變體的篩選過(guò)程Fig.4 Screening process of O.latipes homozygotes

2 結(jié)果

2.1 gRNA 與Cas9 mRNA 體外合成的結(jié)果

通過(guò)PCR 從pMD19-gRNA scaffold 質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得了gRNA 的模板(圖5-a)，模板純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得gRNA 模板與gRNA 的混合物(圖5-b)，利用DNase Ⅰ對(duì)混合物處理并純化后，獲得了條帶單一且無(wú)明顯降解的gRNA (圖5-c)。將pCMVzCas9 質(zhì)粒酶切后，從電泳圖可以看出質(zhì)粒被完全切開(kāi)，大小為8 029 bp (圖5-d)，進(jìn)一步將其作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。對(duì)比質(zhì)粒酶切后的電泳圖(圖5-d)，轉(zhuǎn)錄后的電泳圖顯示出2 條帶(圖5-e)，其中較大的條帶為質(zhì)粒模板，較小的條帶為Cas9 mRNA。同樣的，利用DNase Ⅰ對(duì)其進(jìn)行處理并純化獲得了Cas9 mRNA，電泳后的目的條帶與預(yù)期的條帶大小基本一致(圖5-f)。

圖5 RNA 的模板及體外轉(zhuǎn)錄(a) PCR 擴(kuò)增的gRNA；(b)體外轉(zhuǎn)錄后的gRNA；(c)純化后的gRNA；(d)線性化的pCMV-zCas9；(e) Cas9 體外轉(zhuǎn)錄后的mRNA；(f) Cas9 mRNA 純化后的檢測(cè)。1.DL100 marker，2.擴(kuò)增的gRNA，3.轉(zhuǎn)錄后的gRNA，4.純化后的gRNA，5.1 kb marker，6.線性化的pCMVzCas9，7.DL500 marker，8.Cas9 體外轉(zhuǎn)錄后的mRNA，9.純化的Cas9 mRNA。Fig.5 Template and in vitro transcription of gRNA(a) amplified gRNA template;(b) in vitro transcripted gRNA;(c) purified gRNA;(d) linearized pCMV-zCas9 vector;(e) in vitro transcripted Cas9 mRNA/DNA mixture;(f) purified Cas9 mRNA.1.DL100 marker,2.amplified gRNA,3.transcripted gRNA,4.purified gRNA,5.1 kb marker,6.linearized pCMV-zCas9,7.DL500 marker,8.transcripted Cas9 mRNA,9.purified Cas9 mRNA.

2.2 酚紅標(biāo)記胚胎顯微注射的位置

青鳉卵子受精后，胚胎中的油球開(kāi)始由動(dòng)物極向植物極移動(dòng)，胚盤向下凹陷被油球環(huán)繞(圖6-a)，此時(shí)將胚盤朝右上方傾斜并將針扎入胚胎的胚盤中進(jìn)行注射(圖6-b)。注射完后，酚紅在向下凹陷的胚盤中而沒(méi)有散開(kāi)，說(shuō)明注射成功(圖6-c)。

圖6 青鳉胚胎的顯微注射(a)注射前；(b)注射中；(c)注射后。Fig.6 Microinjection of medaka embryo(a) before injection;(b) during injection;(c) after injection.

2.3 突變位點(diǎn)的檢測(cè)

收集注射4 d 后的胚胎提取基因組DNA，并對(duì)gRNA 靶位點(diǎn)片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物利用T7E1 進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物能夠被T7E1 切割形成兩種大小不同的片段(圖7)。進(jìn)一步的PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，在靶位點(diǎn)附近出現(xiàn)雙峰(圖7)，這說(shuō)明了gRNA 和Cas9 mRNA 的注射導(dǎo)致了靶位點(diǎn)基因序列的突變。

圖7 突變位點(diǎn)的檢測(cè)M.marker；1～8.注射的胚胎；C.野生型胚胎。在測(cè)序波峰圖中，藍(lán)色方框標(biāo)記gRNA 的序列，黃色高亮標(biāo)記PAM 序列，紅色方框表示突變的序列，紅色箭頭指向重疊峰的位置。Fig.7 Detection of mutation sitesM.marker;1-8.injected embryos;C.wild-type embryos.In the sequencing waveform,the gRNA sequence is marked by the blue box,the PAM sequence is highlighted by yellow color,red boxes represents mutated sequences,and the red arrow points to overlapping peaks.

2.4 F2 純合子的獲得

按照前述方法篩選F2成魚，在21 尾中有12尾的PCR 產(chǎn)物能夠被T7E1 切割，說(shuō)明這些是雜合子(1、4、5、6、8、9、10、11、14、16、18和21)。將其他未被切開(kāi)的PCR 產(chǎn)物加入野生型的PCR 產(chǎn)物后進(jìn)行T7E1 酶切，結(jié)果顯示有3 尾魚的PCR 產(chǎn)物能夠被T7E1 切割，表明這些個(gè)體為純合子(7、17 和20)，其余未被切開(kāi)的為野生個(gè)體(2、3、12、13、15 和19) (圖8-a)。進(jìn)一步的PCR 產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)了7、17 和20 為純合子，從而得到了純合突變品系。該純合子的表型為典型的pax6 突變表型，其眼部發(fā)育不完整(圖8-b)。

圖8 純合F2 的篩選及表型分析(a)純合F2 的篩選過(guò)程。M.marker；1～21：不同個(gè)體；C 代表野生型。黑色數(shù)字代表雜合子，紅色數(shù)字代表非雜合子，藍(lán)色高亮的紅色數(shù)字代表純合子；(b)野生型和純合子測(cè)序波峰圖以及表型對(duì)比，藍(lán)色方框標(biāo)記gRNA 的序列，黃色高亮標(biāo)記PAM 序列，紅色方框表示突變的序列，白色箭頭指向眼部畸形發(fā)育的位置，比例尺為200 μm。Fig.8 Screening and phenotype analysis of F2 homozygous(a) screening process of homozygous F2.M.marker;1-21.different individuals;C.wild type.Black numbers represent heterozygotes,red numbers represent non-heterozygotes,red numbers highlighted in blue represent homozygotes;(b) comparing the sequencing waveform and phenotype between wildtype and homozygotes,where the gRNA sequence is marked by blue box,the PAM sequence is highlighted by yellow color,the red box represents the mutated sequence,and the white arrow points to the location of the eye malformation development.Scale bar: 200 μm.

3 討論

生物特異基因突變體的構(gòu)建是研究基因功能的重要手段之一，本研究詳細(xì)描述了青鳉突變體的構(gòu)建過(guò)程。本研究中，gRNA 的設(shè)計(jì)主要在ChopChop 網(wǎng)站中進(jìn)行，此外還有CCtop (https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/)、CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)以及Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/)等一系列g(shù)RNA 設(shè)計(jì)網(wǎng)站可供選擇[25]。CCTop 網(wǎng)站根據(jù)主頁(yè)中指定的參數(shù)掃描輸入序列以識(shí)別gRNA 目標(biāo)位點(diǎn)，根據(jù)候選的目標(biāo)位點(diǎn)確定潛在的脫靶位點(diǎn)，并根據(jù)潛在脫靶位點(diǎn)匹配到的最接近的外顯子給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)從而進(jìn)行排序[26]。CRISPOR 網(wǎng)站也可以計(jì)算脫靶分?jǐn)?shù)、所有效率分?jǐn)?shù)、CG 含量警告，其改進(jìn)的脫靶和靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)算法可減少篩選脫靶和有效位點(diǎn)序列所花費(fèi)的時(shí)間[27]。Cas-OFFinder 可自行設(shè)定所需的PAM 序列或錯(cuò)配堿基的數(shù)量，對(duì)已測(cè)序基因組中的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行快速搜索[28]。研究者可根據(jù)研究目的選擇合適的方法進(jìn)行g(shù)RNA 的設(shè)計(jì)。

設(shè)計(jì)完成gRNA，實(shí)驗(yàn)以含有g(shù)RNA scaffold 的質(zhì)粒為模板，通過(guò)合成含T7 啟動(dòng)子的上游引物和通用的下游引物對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得gRNA 體外轉(zhuǎn)錄的模板，利用T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得了gRNA。在其他研究中報(bào)道了可通過(guò)合成含T7 啟動(dòng)子、靶位點(diǎn)以及scaffold 的上游引物和下游引物直接退火形成gRNA 體外轉(zhuǎn)錄的模板，再利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄獲得gRNA[29]。

在顯微注射時(shí)，本研究采用了300～500 ng/μL的Cas9 mRNA、30～50 ng/μL 的gRNA 注射濃度。在其他研究中，如Kato-Unoki 等[30]在青鳉中的注射濃度為100 ng/μL 的Cas9 mRNA 和25 ng/μL 的gRNA。Gay 等[18]在青鳉中的注射濃度為100 ng/μL的Cas9 mRNA 和25 ng/μL 的sgRNA。Meneghetti等[31]在斑馬魚中的注射濃度為400 ng/μL 的Cas9 mRNA 和50 ng/μL 的gRNA，同樣能引起生物體基因的突變。而對(duì)于注射Cas9 mRNA 也可用Cas9 蛋白代替，在斑馬魚中注射Cas9 蛋白和gRNA 比注射Cas9 mRNA 和gRNA 所引起的突變率更高[32-33]，這種差異可能是gRNA/Cas9 蛋白復(fù)合物可立即誘導(dǎo)胚胎突變所導(dǎo)致。當(dāng)注射gRNA/Cas9 mRNA 時(shí)，Cas9 mRNA 必須先翻譯成蛋白質(zhì)才能與gRNA 結(jié)合，從而誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂。Cas9 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)以及純化過(guò)程相較于Cas9 mRNA 的體外合成更為復(fù)雜，因此建議合成Cas9 mRNA 或購(gòu)買商品化的Cas9 蛋白。本研究所用注射針的針尖長(zhǎng)度是綜合不同研究后所確定，其與Porazinski 等[17]所制的針尖長(zhǎng)度較為一致，而在方健[34]的研究中，其注射針尖更短，這使得斷針時(shí)需要十分小心，否則針口過(guò)大，更容易對(duì)胚胎造成機(jī)械損傷，從而導(dǎo)致胚胎畸形率的上升，當(dāng)然針尖越短其進(jìn)入卵殼硬的胚胎中更容易。關(guān)于注射部位，由于青鳉卵屬于單一卵黃塊類型的卵，其原生質(zhì)只能從卵黃表面移向動(dòng)物極形成胚盤，而核酸分子無(wú)法通過(guò)卵黃質(zhì)邊界，因此只能將Cas9 mRNA 和gRNA 的混合液注射到胚盤中。類似的魚類還有條斑星鰈(Verasper moseri)等[35]。而如斑馬魚、金魚(Carassius auratus)等魚類的卵屬于含多個(gè)卵黃顆粒的卵，分子能夠隨著胚胎的發(fā)育與原生質(zhì)一起轉(zhuǎn)移到胚盤中，因此可將Cas9 mRNA 和gRNA 的混合液注射到胚盤或者卵黃區(qū)域[35]。盡管青鳉的1 細(xì)胞期持續(xù)時(shí)間為30～45 min，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其卵殼也會(huì)變得越來(lái)越硬而不利于注射，因此推薦在受精后15～30 min 進(jìn)行注射，此時(shí)卵殼較軟，胚盤較為明顯，相關(guān)的操作視頻可參考JOVE 網(wǎng)站[17]。

為了驗(yàn)證靶位點(diǎn)的有效性，本研究主要通過(guò)顯微注射活體后對(duì)靶位點(diǎn)測(cè)序驗(yàn)證。然而在一些顯微注射存在難度的魚類中，需要先在體外驗(yàn)證gRNA 的有效性，再進(jìn)行注射，以提高突變效率[5]。檢測(cè)到胚胎的突變后，將這些胚胎養(yǎng)至成魚形成F0。由于F0中同一尾魚存在不同組織的突變類型可能不一樣，甚至同一組織中仍可能出現(xiàn)多種突變類型，為了獲得純化的可遺傳的突變類型，需要將突變體同野生魚進(jìn)行雜交獲得F1。若從F1中能夠檢測(cè)到突變，則認(rèn)為該F0的突變是可遺傳的。由于從同一親本產(chǎn)生的F1中，仍可以篩選到2 種以上的突變類型，因此在F1篩選過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)單克隆測(cè)序確定發(fā)生無(wú)義突變的相同類型，然后將同種無(wú)義突變類型的F1成魚進(jìn)行自交從而獲得F2。突變體篩選可通過(guò)T7E1 酶切進(jìn)行，也可通過(guò)PCR 的方法進(jìn)行驗(yàn)證。如Iyer 等[5]針對(duì)突變位點(diǎn)序列的擴(kuò)增可一步鑒定出純合子、雜合子以及野生型個(gè)體，此方法對(duì)突變的序列、引物的設(shè)計(jì)及PCR 退火溫度有一定的要求。

本研究以青鳉Olpax6.1 基因的敲除為例，闡述了利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在青鳉中構(gòu)建突變體的詳細(xì)過(guò)程，涵蓋了基因特異gRNA 的設(shè)計(jì)、gRNA 及Cas9 mRNA 的體外合成、顯微注射、突變檢測(cè)以及純合子的篩選過(guò)程，為青鳉突變體的構(gòu)建提供了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作流程，同時(shí)也為其他魚類乃至其他類型動(dòng)物的突變體構(gòu)建提供技術(shù)參考。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）