大黃魚腫大細(xì)胞病毒不同毒株的細(xì)胞培養(yǎng)及主要衣殼蛋白基因比較

楊西西，池洪樹，鄭在予，劉曉東，羅潘潘，許斌福，陳秀霞，龔 暉*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

大黃魚(Larimichthys crocea)是中國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的海水魚類[1]，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大黃魚病害問題日益突出，已成為制約大黃魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素[2]。何愛華等[3]通過電鏡從夏季發(fā)病的大黃魚幼魚中發(fā)現(xiàn)了虹彩病毒(Iridovirus)，Chen 等[4]證實(shí)1999—2001 年夏季福建省寧德、羅源等地養(yǎng)殖大黃魚幼魚暴發(fā)性死亡由虹彩病毒感染所致，根據(jù)組織病理學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征分析，確認(rèn)該病毒屬于腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus)，并將其命名為大黃魚虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus,LYCIV)。近年來，養(yǎng)殖大黃魚中常有腫大細(xì)胞病毒檢出[5-6]，但受限于無敏感細(xì)胞系，研究無法深入開展，開展的研究主要集中于病毒檢測方法的建立和部分功能基因的分析[7-10]。已有團(tuán)隊(duì)建立了對ISKNV 型和RSIV 型腫大細(xì)胞病毒高度敏感的鱖(Siniperca chuatsi)仔魚細(xì)胞系(mandarin fish fry cell line-1，MFF-1)，基于MFF-細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)ISKNV 型和RSIV型腫大細(xì)胞病毒持續(xù)、穩(wěn)定地傳代[11-15]。本研究利用MFF-1 細(xì)胞系分離培養(yǎng)大黃魚腫大細(xì)胞病毒，對病毒的主要衣殼蛋白基因(major capsid protein，mcp)進(jìn)行比較分析，以期為大黃魚腫大細(xì)胞病毒病的研究和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

病料 2018—2020 年間所采集，用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 36191—2018[16]中的1F/R 引物PCR 檢測呈陽性的大黃魚肝臟、脾臟、腎臟等內(nèi)臟組織，存于-80 °C。(表1)

表1 實(shí)驗(yàn)所用的大黃魚病料Tab.1 Pathologicalspecimens of L.crocea used in the experiment

細(xì)胞系 鱖仔魚細(xì)胞系MFF-1。

引物 根據(jù)NCBI 上的登錄的LYCIV 的mcp(GenBank: AY779031.1)，利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長mcp的引物，上游引物mcpF：ATGTCTGCGATCTCAGGTGC，下游引物mcpR：TTACAGGATAGGGAAGCCTGC，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 362 bp。

實(shí)驗(yàn)試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、含EDTA 和酚紅的胰酶、青霉素和鏈霉素雙抗(Gibco)，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]。病毒基因組DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 提取試劑盒(Omega Bio-Tek)、2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、瓊脂糖粉末、50×TAE 瓊脂糖電泳緩沖液[生工生物工程(上海)股份有限公司]。DL2000 DNA Marker、pMD-19T 載體克隆試 劑 盒、TB Green?Premix ExTaq? Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa，日本)。Triton X-100 (Sigma-Aldrich，美國)。組織固定液：2.5%戊二醛(Sigma-Aldrich，美國)，取25%戊二醛10 mL，0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4) 50 mL，ddH2O 定容至100 mL，4 °C 保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MFF-1 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)于25 cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2，27 °C，飽和濕度。0.25%胰酶消化、傳代。

1.3 病毒分離、接種與傳代

分別將凍存于-80 °C，采自福鼎和寧德沙澳的大黃魚幼魚病料(FD201807 和SA201808)腎臟組織裝入1.5 mL 離心管中，加入適量的0.1 mol/L PBS (pH 7.4)，在冰浴條件下研磨成漿。4 °C，4 602 ×g離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，取500 μL 濾過液加入已棄去培養(yǎng)液的單層MFF-1 細(xì)胞中，靜置1 h，加入5 mL維持液(含2% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每12 小時(shí)觀察1 次，若7 d 內(nèi)無病變，細(xì)胞與培養(yǎng)液一并收集，凍融3 次后，凍融液于4 °C，2 348 ×g離心10 min，收集上清液，與維持液以1∶10 的比例感染單層MFF-1 細(xì)胞繼續(xù)傳代，每7 天盲傳1 次，直至出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effects，CPE)，80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)將細(xì)胞與培養(yǎng)液一并收集，按以上方法繼續(xù)傳代。

1.4 電鏡觀察

收集病毒感染細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，吹洗一下細(xì)胞，2 348×g離心5 min，棄上清液，加入1 mL 組織固定液重懸沉淀，再次2 348 ×g離心5 min，棄上清液，補(bǔ)充1 mL 組織固定液，4 °C 保存2 d 后，委托中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院電鏡室按董傳甫[12]的方法進(jìn)行漂洗、脫水、包埋、超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，最后通過JEM-1400 透射電鏡觀察。

1.5 病毒全長mcp 的克隆、測序與分析

按病毒基因組DNA 提取試劑盒產(chǎn)品說明書分別提取FD201807 和SA201808 組織勻漿液、15代次的病毒感染細(xì)胞凍融液，以及其他15 個(gè)大黃魚病樣組織勻漿液總DNA 作為模板。以全長mcp引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix (Dye Plus) 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA 模板 2 μL，補(bǔ)充ddH2O 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 °C 變性5 s；94 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min 20 s，共32 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸5 min。

凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒說明書回收目的基因，連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板篩選陽性克隆，隨機(jī)挑取3 個(gè)陽性克隆至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，通過NCBI-BLAST 將FD201807株和SA201808 株mcp與GenBank 數(shù)據(jù)庫中腫大細(xì)胞病毒mcp進(jìn)行比對分析，用MEGA 4 軟件分別對上述2 株病毒的mcp與GenBank 數(shù)據(jù)庫中腫大細(xì)胞病毒以及15 個(gè)大黃魚病料中檢出的腫大細(xì)胞病毒mcp進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒對細(xì)胞的感染

FD201807 和SA201808 的病料組織勻漿液感染MFF-1，盲傳3 代均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，第4 代感染細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，病變的主要表現(xiàn)為細(xì)胞脫壁、變圓，折光率增強(qiáng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，脫壁細(xì)胞逐漸增多，同時(shí)培養(yǎng)液中的顆粒增加，第4 代FD201807 株感染細(xì)胞10 d 的細(xì)胞病變率達(dá)80%，第4 代SA201808 株感染細(xì)胞病變率達(dá)到80%的時(shí)間為12 d。隨著代次的增加，病毒感染細(xì)胞病變周期逐漸縮短，第15 代FD201807 株感染細(xì)胞48 h 時(shí)病變率達(dá)50%以上，72 h 時(shí)細(xì)胞病變率達(dá)80%以 上。第15 代SA201808 株感染細(xì)胞72 h 時(shí)部分細(xì)胞出現(xiàn)病變，168 h 時(shí)細(xì)胞病變率近80%。(圖版Ⅰ)

2.2 病毒結(jié)構(gòu)特征

電鏡觀察病毒感染細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量散在的六邊形病毒粒子和空殼，直徑130～150 nm(圖版Ⅱ)。

2.3 病毒全長mcp 基因的克隆、測序結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的腫大細(xì)胞病毒全長mcp引物對FD201807 和SA201808 的組織勻漿液和15 代病毒的細(xì)胞凍融液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均得到了大小約1 300 bp 的單一目的條帶(圖1)。

圖1 FD201807 株和SA201808 株全長mcp 擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000 DNA Marker；1.FD201807 組織勻漿液；2.SA201808 組織勻漿液；3.第15 代FD201807 株感染的MFF-1 細(xì)胞凍融液；4.第15代SA201808 株感染的MFF-1 細(xì)胞凍融液；5.MFF-1 細(xì)胞凍融液。Fig.1 Completemcp sequences amplification from isolate FD201807 and SA201808M.DL2000 DNA Marker;1.FD201807 tissue homogenate;2.SA201808 tissue homogenate;3.freeze-thawed MFF-1 cells infected with FD201807,passage 15;4.freeze-thawed MFF-1 cells infected with SA201808,passage 15;5.freeze-thawed MFF-1 cells.

圖版Ⅰ 15 代次FD201807 和 SA201808 感染MFF-1 細(xì)胞的病變過程1～3.FD201807 株接種后0、48 和72 h；4～6.SA201808 株接種后0、72 和168 h。Plate Ⅰ Cytopathic effects of MFF-1 infected FD201807 and SA201808 at passage151-3.0,48 and 72 h after FD201807 inoculation,respectively;4-6.0,72 and 168 h after SA201808 inoculation,respectively.

圖版Ⅱ 病毒感染的MFF-1 細(xì)胞電鏡照片1.14 代次FD201807 株感染MFF-1 細(xì)胞72 h 后的電鏡照片(6 000×)；2.第一幀圖片的局部放大(15 000×)；3.14 代次SA201808 株感染MFF-1 細(xì)胞144 h 后的電鏡照片(5 000×)；4.第3 幀圖片的局部放大(15 000×)。Plate Ⅱ Electron micrograph of virus-infected MFF-1 cells1.MFF-1 cell infected with FD201807,passage 14,72 h post inoculation (6 000×);2.local zoom of frame 1 (15000×);3.MFF-1 cell infected with SA201808,passage 14,144 h post inoculation (6 000×);4.local zoom of frame 3 (15 000×).

分別對上述目的條帶進(jìn)行膠回收和克隆測序。結(jié)果顯示FD201807、SA201808 的組織勻漿液和15 代病毒細(xì)胞凍融液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均為1 362 bp。FD201807 株、SA201808 株與其他相關(guān)的腫大細(xì)胞病毒分離株比較分析表明，F(xiàn)D201807 株和SA201808 株屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)腫大細(xì)胞病毒屬(Megalocytivirus)的不同病毒分離株。SA201808 株與 LYCIV-Zhoushan (GenBank:MW139932.1)的mcp核酸序列僅有1 個(gè)堿基差異，與LYCIV (GenBank: AY779031.1)mcp有5 個(gè)堿基差異。FD201807 株與SA201808 的mcp有21 個(gè)堿基差異，與花鱸虹彩病毒(Lateolabrax macu-latusiridovirus,LMIV) (GenBank: MH577517.1)mcp存在1 個(gè)堿基差異(圖2)。

圖2 FD201807 株、SA201808 株、LYCIV、LYCIV-Zhoushan 與LMIV-1 706 的 mcp 序列比對灰色區(qū)域?yàn)? 個(gè)序列中相似度為60%的堿基，黑色區(qū)域?yàn)? 個(gè)序列中相似度為80%的堿基。Fig.2 mcp sequences alignment of FD201807,SA201808,LYCIV,LYCIV-Zhoushan and LMIV-1706Grey area.the bases with 60% similarity among the 5 sequences;black area.the bases with 80% similarity among the 5 sequences.

(圖2 Fig.2)

與已知的腫大細(xì)胞病毒mcp聚類分析結(jié)果顯示，SA201808 株、FD201807 株歸屬腫大細(xì)胞病毒RSIV 基因型，SA201808 株與FD201807 株有一定的遺傳距離(圖3)。

圖3 腫大細(xì)胞病毒mcp 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on mcp of Megalocytivirus

FD201807 株、SA201808 株與其他15 株大黃魚腫大細(xì)胞病毒mcp的聚類分析結(jié)果表明，12 株大黃魚腫大細(xì)胞病毒的mcp序列與SA201808 聚類；另3 株大黃魚腫大細(xì)胞病毒mcp與FD201807以及LMIV(MH577517.1)聚類(圖4)。

圖4 大黃魚腫大細(xì)胞病毒分離株mcp 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on mcp gene of the Megalocytivirus isolated from L.crocea

3 討論

虹彩病毒科可分為α 虹彩病毒亞科(Alphairidovirinae)和β 虹彩病毒亞科(Betairidovirinae)，α 虹彩病毒亞科病毒主要感染硬骨魚類、兩棲類和爬行類等冷血脊椎動(dòng)物，分為淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大細(xì)胞病毒屬和蛙病毒屬(Ranavirus) 3 個(gè)屬[17]。腫大細(xì)胞病毒屬病毒僅感染硬骨魚類，是魚類的主要病原[18]，Inouye 等[19]于1990 年在養(yǎng)殖真鯛(Pagrus major)上首次發(fā)現(xiàn)真鯛虹彩病毒(red sea bream virus,RSIV)。吳淑勤等[20]于1997 年從鱖上發(fā)現(xiàn)一種直徑約為150 nm的病毒，He 等[21]對該病毒開展了研究，將該病毒命名為脾腎壞死病毒(infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)了20余種腫大細(xì)胞病毒，感染對象包括鱸形目(Perciformes)、鰈形目 (Pleuronectiformes)、鱈形目(Gadiformes)和鲀形目(Tetraodontiformes)等近百種魚類[22-24]。適合腫大細(xì)胞病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系較少，在病毒培養(yǎng)過程中常遇到細(xì)胞病變緩慢、病毒滴度低或難以穩(wěn)定傳代的問題[23]。Ao 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚腫大細(xì)胞病毒可在BF-2 細(xì)胞系上增殖，但未見大黃魚腫大細(xì)胞病毒引起細(xì)胞病變的報(bào)道，本研究利用MFF-1 細(xì)胞對大黃魚腫大細(xì)胞病毒進(jìn)行了分離培養(yǎng)，經(jīng)過3 代盲傳后，大黃魚腫大細(xì)胞病毒感染的細(xì)胞表現(xiàn)出典型的腫大細(xì)胞病毒細(xì)胞病變特征，經(jīng)過15 個(gè)代次的傳代，病毒的感染力并未減弱，CPE 的周期縮短，說明MFF-1 細(xì)胞適用于大黃魚腫大細(xì)胞病毒的培養(yǎng)。此外從本研究結(jié)果來看，不同來源的大黃魚腫大細(xì)胞病毒對MFF-1 細(xì)胞的易感性存在差異，這種差異產(chǎn)生的原因還有待進(jìn)一步研究。

虹彩病毒的mcp相對保守，因此常被用于虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析[26-29]，根據(jù)mcp或ATPase可將腫大細(xì)胞病毒分成 RSIV、ISKNV 和 TRBIV三個(gè)基因型[18]。本研究結(jié)果表明，SA201808 株和FD201807 株的mcp與RSIV 基因型病毒的mcp聚類，SA201808 株的mcp與已報(bào)道的大黃魚腫大細(xì)胞病毒同源性高，而FD201807 與花鱸虹彩病毒的mcp(GenBank: MH577517.1)高度一致，同時(shí)從17 株大黃魚腫大細(xì)胞病毒mcp的聚類分析來看，不同的大黃魚腫大細(xì)胞病毒分布與年份、養(yǎng)殖區(qū)域和魚體大小無直接相關(guān)性，同一時(shí)間同一養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)可同時(shí)存在2 種大黃魚腫大細(xì)胞病毒，推測大黃魚腫大細(xì)胞病毒可能有不同來源且可跨物種感染。大黃魚腫大細(xì)胞病毒的傳播途徑和進(jìn)化關(guān)系如何，還需做更大范圍的調(diào)查分析。

本研究實(shí)現(xiàn)了大黃魚腫大細(xì)胞病毒的穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，為該病毒的致病性研究和疫苗研發(fā)提供了條件，通過對大黃魚腫大細(xì)胞病毒的mcp比較分析，為大黃魚腫大細(xì)胞病毒病的流行病學(xué)研究和防控提供了參考。

感謝中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院董傳甫課題組為本研究提供細(xì)胞系。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）