從海馬區(qū)膠質(zhì)細胞CD137L途徑探討電針治療神經(jīng)痛的作用機制

鄭昌岳，蘭艷艷，黃秋玲，江孟鴻，王志福*

1 福建省級機關(guān)醫(yī)院，福建 福州 350003；

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；

3 福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122

神經(jīng)病理性疼痛（簡稱神經(jīng)痛）是軀體感覺系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛，臨床表現(xiàn)為痛覺過敏、痛覺超敏等癥狀，并常伴隨記憶障礙［1-3］。海馬作為大腦內(nèi)側(cè)顳葉的一部分，在傷害性刺激的感受以及疼痛信號的處理過程中發(fā)揮重要作用［4］。神經(jīng)痛發(fā)生時，海馬功能呈現(xiàn)出不同尋常的表現(xiàn)，如記憶缺陷、膠質(zhì)細胞激活和細胞因子釋放等［5-7］。CA1區(qū)作為海馬重要的功能分區(qū)之一，在痛覺調(diào)制和突觸可塑性過程中同樣扮演著重要角色［8］，疼痛信息可誘導(dǎo)CA1 區(qū)蛋白表達和細胞功能的改變，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放等［9-11］。

大量研究證實，電針環(huán)跳、陽陵泉穴可顯著抑制神經(jīng)痛，在海馬CA1 區(qū)觀察發(fā)現(xiàn)，電針可以減少神經(jīng)痛大鼠疼痛相關(guān)神經(jīng)元電生理活動的異常［12］。前期研究通過蛋白組學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，電針可抑制海馬關(guān)鍵蛋白TMEM126A 的表達，減輕神經(jīng)痛敏反應(yīng)，改善相關(guān)學(xué)習(xí)記憶障礙，而CD137L 是TMEM126A的重要結(jié)合蛋白［13-15］。通過文獻進一步梳理分析，CD137屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體家族的成員，由腫瘤壞死因子受體超家族成員9（tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9）基因編碼。CD137 是在活化的CD4+和CD8+T 細胞、NK 細胞、DC、巨噬細胞、肥大細胞等細胞上表達的誘導(dǎo)型共刺激受體，其配體為CD137L，表達于巨噬細胞、B細胞等。

在神經(jīng)痛研究中發(fā)現(xiàn)，敲除CD137L 基因的小鼠疼痛閾值升高，并且早期使用CD137L 抗體能夠有效改善痛敏反應(yīng)；脊髓節(jié)段CD137L 可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活化和細胞因子的釋放，促進神經(jīng)痛的發(fā)生和發(fā)展［16］。然而，目前關(guān)于CD137 及配體CD137L中樞神經(jīng)表達及電針鎮(zhèn)痛的作用機制不清?；诖耍瑪M探討海馬CD137 及CD137L 在電針改善神經(jīng)痛及學(xué)習(xí)記憶中的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

24 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院［許可證號：SCXK（浙）2019-0002］，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心［許可證號：SYXK（閩）2019-0007］。飼養(yǎng)環(huán)境保持適宜的溫度、濕度、12 h光照明暗交替。本實驗操作過程嚴格按照我國相關(guān)實驗動物的規(guī)定及福建中醫(yī)藥大學(xué)動物管理制度，符合實驗動物倫理要求（審批號：FJTCMIACUC2021006）。

1.2 儀器設(shè)備和試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備 Von-Frey 測痛儀（美國IITC公司，型號：NC12775）；電子針療儀（型號：SDZ-Ⅱ）、一次性針灸針（規(guī)格：1寸，0.30 mm×25 mm）均購自于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；LEICA 冰凍切片機（德國徠卡公司，型號：CM1950）；LEICA 顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DFC425 C）。

1.2.2 主要試劑 5-0 非吸收性外科縫線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）；CD137/CD137L抗體、小膠質(zhì)細胞標記物（Ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba-1）抗體、星形膠質(zhì)細胞標記物（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）抗體（美國Thermo 試劑公司）；GFAP、Iba-1、CD137L、TNF-α 等ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

24 只SPF 級雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組8只。

2.2 動物模型制備

參考DECOSTERD 的造模方法建立坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（spared nerve injury，SNI）模型［17］。大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，剃除皮毛，75%乙醇消毒，切開右后肢皮膚，鈍性分離肌肉，充分暴露坐骨神經(jīng)主干及其遠端分支，鈍性分離脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，5-0 絲線結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)并剪斷，保留腓腸神經(jīng)，造模后逐層縫合，切口處覆蓋青霉素粉末預(yù)防感染。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎不剪斷坐骨神經(jīng)及分支。

2.3 干預(yù)方法

造模后第7 天開始，電針組參照《實驗針灸學(xué)》及前期研究方法［18］確定大鼠右側(cè)環(huán)跳、陽陵泉穴位置，采用常規(guī)一次性針灸針（1寸，0.30 mm×25 mm）分別刺入10 mm、5 mm，連接電子針療儀，電針頻率為2 Hz，強度為1 mA，連續(xù)波，每天干預(yù)1 次，每次30 min，連續(xù)電針21 d。假手術(shù)組和模型組大鼠同等條件下進行抓取、固定，但不給予電針干預(yù)。

2.4 行為學(xué)檢測

2.4.1 機械痛閾值檢測 參考前期研究方法［18］進行機械痛閾值測試以及數(shù)值計算。在造模前及造模后第7 天（干預(yù)前）、造模后第28 天（干預(yù)后）檢測3 組機械痛閾值。每次刺激后待大鼠重新安靜后再開始下一次刺激，測量3 次得出的平均值記錄為測試結(jié)果，代入up-and-down方法的公式計算，最終所得數(shù)值即為大鼠縮足閾值（paw withdrawal threshold，PWT），以此反映大鼠的機械痛行為學(xué)。

2.4.2 新物體識別實驗 根據(jù)嚙齒類動物具備對新的物體有探索的偏好本能，在造模后第28 天進行新物體識別實驗，以反映大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。① 適應(yīng)階段：將動物依次放入測試箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境。每只大鼠放置在測試箱內(nèi)10 min 任其自由探索，然后取出放回原籠內(nèi)休息10 min，再放入測試箱10 min，最后歸回原籠位。注意每次更換動物測試前必須清除測試箱內(nèi)殘留的糞便和尿液等，并用75%乙醇噴灑、擦拭、通風以消除氣味。② 訓(xùn)練階段：準備2個完全相同的圓柱體（物體A 和物體B），1 個長方體（物體C）。3 個物體和大鼠的體積匹配并具備一定體質(zhì)量，以避免在實驗過程中因大鼠攀爬而傾倒。先將物體A 和物體B放置在測試箱的左下角和右下角，調(diào)試視頻分析系統(tǒng)并定義物體和環(huán)境的區(qū)域范圍，打開錄像設(shè)備。將大鼠背對2個物體放入測試箱中。實驗人員離開測試房間以避免干擾。大鼠在測試箱內(nèi)自由探索10 min 后，取出放回原籠內(nèi)，間隔10 min后進行下一階段。③ 測試階段：將左下角的物體A 取出，換為物體C。打開錄像設(shè)備，同樣放置大鼠進入測試箱。實驗人員離開房間，通過錄像觀察大鼠探索情況，物體識別測試時間為10 min。測試完成后將大鼠歸回原籠內(nèi)。通過視頻分析系統(tǒng)采集錄像，分析記錄大鼠相關(guān)指標。

2.5 樣本采集

造模后第28天進行樣本采集。用1%濃度異氟烷麻醉大鼠后，新鮮快速取腦，分離海馬CA1 區(qū)，置入EP 管液氮凍存待取。灌注取材快速灌入低溫生理鹽水，緩慢灌入低溫4%多聚甲醛，取大腦制作冰凍切片。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法

① 標準品稀釋：根據(jù)說明書，對標準品進行梯度稀釋，混勻備用。② 加樣：分別設(shè)空白孔、標準品孔、待測樣本孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣本孔中先加樣品稀釋液25 μL，再加待測樣本25 μL，輕輕晃動混勻。③ 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。④ 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用。⑤ 洗滌：小心揭去封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此反復(fù)5 次，拍干。⑥ 加酶：加入酶標試劑50 μL。⑦ 溫育、洗滌：操作同前。⑧ 顯色：每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min。用450 nm 波長分別測量每個孔的吸光值（A值）。整個測定的過程應(yīng)在加入終止液后的15 min 內(nèi)完成。通過Excel繪制標準曲線可以計算出樣品濃度值，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.7 免疫熒光組織化學(xué)

實驗結(jié)束后取材腰段脊髓包埋，在恒冷凍切片機內(nèi)進行切片，厚度為16 μm，將切好的組織片貼附在載玻片上；將切片PBS洗5 min×3次，用基因筆畫圈，滴加封閉液，置于37 ℃恒溫箱1 h；甩掉封閉液，分別滴加一抗（小鼠抗Iba-1、小鼠抗GFAP、小鼠抗神經(jīng)元標記物（Neuronal Nuclei，NeuN）、兔抗CD137、兔抗CD137L），濕盒4 ℃過夜；次日，PBS洗5 min×3次，再避光加入二抗，置于37 ℃箱1 h；PBS 洗10 min×3 次，擦去組織周圍的水分后，滴加含DAPI 的封片劑，蓋上載玻片。使用熒光顯微鏡拍攝每只大鼠海馬CA1區(qū)，每只至少隨機選取5個視野拍片，并統(tǒng)計分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 25.0 統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用方差分析。不符合正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3組機械痛閾值、新物體識別能力比較

3 組機械痛閾值采用重復(fù)測量方差分析進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)滿足球形檢驗（P＜0.001），3 組主體內(nèi)時間效應(yīng)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝32.54，P＜0.001），3組主體間的組別效應(yīng)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝31.92，P＜0.001），隨后進行兩兩比較。造模后第7 天，與假手術(shù)組比較，模型組和電針組機械痛閾值均顯著下降（P＜0.01）。電針干預(yù)21 d 后，與模型組相比，電針組可顯著提高大鼠機械痛閾值（P＜0.01）。見表1。3 組新物體識別指數(shù)采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，造模后第28天，與假手術(shù)組比較，模型組新物體識別指數(shù)顯著降低（P＜0.01），提示大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降；與模型組比較，電針組新物體識別指數(shù)顯著升高（P＜0.01），提示大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善。見圖1。

圖1 3組大鼠新物體識別指數(shù)比較（±s）Figure 1 Comparison of new object recognition in dex in three groups (±s)

表1 3組大鼠機械痛閾值變化（±s）Table 1 Changes of mechanical pain threshold of rats in three groups （±s）

表1 3組大鼠機械痛閾值變化（±s）Table 1 Changes of mechanical pain threshold of rats in three groups （±s）

注：與假手術(shù)組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。Note: Compared with the sham group, 1) P＜0.01; compared with the model group, 2) P＜0.01.

組別假手術(shù)組模型組電針組n888造模后第28天8.78±2.45 2.10±0.431）9.80±2.632）造模前10.13±1.77 9.51±1.32 9.32±1.48造模后第7天9.50±1.87 3.34±1.401）3.77±1.191）

3.2 3 組大鼠海馬CA1 區(qū)CD137、CD137L 與神經(jīng)細胞共表達情況

免疫熒光檢測表明，海馬CA1 區(qū)CD137 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)與Iba-1、GFAP 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)共標記，而與NeuN 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)未共標記。見圖2。同樣，在海馬CA1 區(qū)，CD137L 免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)與Iba-1、GFAP 共標記，而與NeuN 未共標記。見圖3。

圖2 3組海馬CA1區(qū)CD137和Iba-1、GFAP、NeuN免疫熒光共標情況（×400）Figure 2 Co-labeling of CD137 with Iba-1, GFAP and NeuN immunofluorescence in hippocampal CA1 region of three groups (×400)

圖3 3組海馬CA1區(qū)CD137L和Iba-1、GFAP、NeuN免疫熒光共標情況（×400）Figure 3 Co-labeling of CD137L with Iba-1,GFAP and NeuN immunofluorescence in hippocampal CA1 region of three groups (×400)

3.3 3組海馬CA1區(qū)CD137L濃度的比較

造模后第28 天，采用ELISA 檢測大鼠海馬CA1區(qū)CD137L 濃度。與假手術(shù)組比較，模型組CD137L濃度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組CD137L濃度顯著下降（P＜0.01），見圖4。

圖4 3組大鼠海馬CA1區(qū)CD137L濃度比較Figure 4 Comparison of CD137L concentration in hippocampal CA1 region in three groups

3.4 3組海馬CA1區(qū)Iba-1、GFAP蛋白表達的比較

造模后第28 天，采用免疫熒光和ELISA 測定3 組海馬CA1 區(qū)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞激活標記物的表達。與假手術(shù)組比較，模型組Iba-1 免疫反應(yīng)陽性細胞個數(shù)和濃度均明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組Iba-1 細胞個數(shù)和濃度均明顯減少（P＜0.01）。見圖5和圖6。與假手術(shù)組比較，模型組GFAP免疫反應(yīng)陽性細胞個數(shù)和濃度均明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，電針組GFAP細胞個數(shù)和濃度均明顯減少（P＜0.01）。見圖7和圖8。

圖5 3組大鼠海馬CA1區(qū)小膠質(zhì)細胞標記物Iba-1表達情況（×200）Figure 5 Expression of microglia marker Iba-1 in hippocampal CA1 and the number of immunoreactive cells in three groups (×200)

圖6 3組大鼠海馬CA1區(qū)Iba-1含量變化比較Figure 6 Comparison of Iba-1 content in hippocampal CA1 region of three groups

圖7 3組大鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP表達情況（×200）Figure 7 Expression of astrocyte marker GFAP in hippocampal CA1 region of three groups (×200)

圖8 3組大鼠海馬CA1區(qū)GFAP含量變化比較Figure 8 Comparison of GFAP content of hippocampal CA1 region in three groups

3.5 3組大鼠海馬CA1區(qū)TNF-α釋放濃度比較

造模后第28 天，采用ELISA 檢測大鼠海馬CA1區(qū)TNF-α濃度。與假手術(shù)組比較，模型組TNF-α濃度顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，電針組TNF-α濃度顯著下降（P＜0.05）。見圖9。

圖9 3組大鼠海馬CA1區(qū)TNF-α濃度比較Figure 9 Comparison of TNF-α concentration in hippocampal CA1 region of three groups

4 討 論

近年研究表明，海馬作為疼痛矩陣腦區(qū)的組成之一，是疼痛等傷害性信息加工及修飾的關(guān)鍵腦區(qū)，在整合疼痛信息、認知記憶等方面發(fā)揮著重要的作用［19］。神經(jīng)痛發(fā)生時，海馬區(qū)長時程增強（longterm potentiation，LTP）減弱，小膠質(zhì)細胞活化及TNFα 釋放增多，導(dǎo)致疼痛發(fā)生和記憶障礙；抑制海馬區(qū)膠質(zhì)細胞活化，降低TNF-α釋放，可緩解神經(jīng)痛［20-22］。

坐骨神經(jīng)痛歸屬中醫(yī)“痛痹證”范疇，應(yīng)用足少陽經(jīng)穴環(huán)跳、陽陵泉等進行電針，善治諸痛痹不仁，臨床康復(fù)效果顯著。我們前期實驗研究同樣表明，電針環(huán)跳、陽陵泉可顯著抑制坐骨神經(jīng)痛，但關(guān)于海馬中樞的調(diào)控機制仍有待深入明晰［23-25］。

課題組前期蛋白組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)，電針可顯著提高神經(jīng)痛海馬區(qū)TMEM126A 表達。進一步文獻梳理發(fā)現(xiàn)，TMEM126A 可能結(jié)合CD137L 結(jié)合，在神經(jīng)痛及電針干預(yù)中扮演重要角色［14］?；诖?，本研究將CD137L 及其受體CD137 作為電針干預(yù)神經(jīng)痛的可能作用靶點［26］。實驗研究表明，海馬CA1 區(qū)CD137L 及其受體主要表達于膠質(zhì)細胞，電針可顯著抑制神經(jīng)痛海馬區(qū)CD137L 表達和膠質(zhì)細胞活化，降低炎癥因子TNF-α的釋放。

CD137 又稱4-1BB，是一種有效的T 細胞共刺激分子，在活化T 細胞、NK 細胞和血管內(nèi)皮細胞上表達。其配體CD137L 是一種跨膜蛋白，在活化的抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）上與CD137結(jié)合，并將激活信號傳遞到APC中［27］。CD137-CD137L 的主要功能是調(diào)節(jié)細胞存活，抑制二者結(jié)合可阻止腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptors，TNFRs）下游信號通路的激活，降低免疫炎癥反應(yīng)［28-29］。

然而，CD137 和CD137L 在疼痛疾病中的探索尚屬于起步階段。WAKLEY 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除CD137L 的神經(jīng)痛小鼠表現(xiàn)出顯著的痛敏反應(yīng)，早期鞘內(nèi)注射CD137L 抗體提高機械痛閾值，抑制脊髓小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞與CD137L 共表達，激活小膠質(zhì)細胞，誘導(dǎo)炎癥因子如TNF-α 等的釋放［30］。在炎癥狀態(tài)下，CD137L是巨噬細胞持續(xù)產(chǎn)生TNF-α 所必需的關(guān)鍵蛋白；巨噬細胞表達CD137L，與Toll 樣受體相互作用，維持TNF-α產(chǎn)生［31］。

綜上所述，電針可能是通過海馬CA1區(qū)CD137L調(diào)節(jié)途徑，抑制膠質(zhì)細胞的激活和TNF-α 的釋放，改善神經(jīng)痛大鼠疼痛及其學(xué)習(xí)記憶障礙，今后將通過CD137L 及受體病毒干擾、基因敲除等技術(shù)，進一步深入驗證CD137L/CD137在電針抗炎鎮(zhèn)痛中的中樞作用機制。