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    毛蘭素通過(guò)CCL2-CCR2信號(hào)軸介導(dǎo)的免疫逃避抑制食管癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展

    2023-11-04 03:44:46袁兆林
    河北醫(yī)學(xué) 2023年10期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)試劑盒引物

    王 靜, 袁兆林, 李 偉

    (山東省滕州市中心人民醫(yī)院, 山東 滕州 277500)

    食管癌(EC)是全球最致命的惡性腫瘤之一,近年來(lái)其發(fā)病率在急劇增加[1]。盡管EC患者的管理和治療有所改善,但總體5年生存率依然較低。因此仍需要開(kāi)發(fā)更安全新型藥物,進(jìn)而優(yōu)化現(xiàn)有的治療方法,以改善EC預(yù)后,提高EC患者的生活質(zhì)量。毛蘭素(Erianin)是從傳統(tǒng)中藥石斛中提取出來(lái)的,具有抗癌、抗菌、抗氧化和改善糖尿病腎病等多種藥理活性。大量研究表明,毛蘭素抑制腫瘤遷移,侵襲和血管生成以及誘導(dǎo)炎癥,細(xì)胞凋亡、自噬和G2/M周期停滯來(lái)發(fā)揮其抗癌活性[2-3]。C-C趨化因子配體2(CCL2)又名單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)通過(guò)參與腫瘤免疫耐受調(diào)節(jié),誘導(dǎo)腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與存活、侵襲和轉(zhuǎn)移,從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。CCL2在EC腫瘤中異常高表達(dá),與C-C趨化因子受體2(CCR2)相互作用,與EC患者的預(yù)后密切相關(guān),在EC病變過(guò)程中,CCL2-CCR2軸募集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM),通過(guò)PD-1信號(hào)誘導(dǎo)免疫逃逸[5]。但毛蘭素通過(guò)CCL2-CCR2信號(hào)軸介導(dǎo)的免疫逃避對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響還不甚清楚,因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討毛蘭素對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其作用機(jī)制,以期為臨床治療EC提供一定參考價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1標(biāo)本收集和細(xì)胞來(lái)源:2021年3月至2022年12月期間在本院根治手術(shù)治療的EC患者(40例),收集癌組織及距離癌組織3cm處的癌旁組織。所有患者均未接受化療或放療等形式的治療,且簽署了知情同意書(shū),本研究獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。人正常食管上皮細(xì)胞HEEC及人EC細(xì)胞ECA109、EC9706、TE-1購(gòu)于美國(guó)ATCC。

    1.2主要試劑與儀器:毛蘭素(J13282)上海金穗生物科技有限公司;MTT試劑盒(MH1001)江蘇麥格生物科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(IBIO-C583)、IFN-γ(IB-E10033)、IL-2(IB-E10055)、TNF-α(IB-E10131)ELISA試劑盒江西艾博因生物科技有限公司;兔源一抗PCNA(ab152112)、Bax(ab182733)、PD-L1(ab239749)、CCL2(ab214819)、CCR2(ab223366)、GAPDH(ab9485)以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(ab6721)美國(guó)Abcam公司;多功能酶標(biāo)儀(LD-96A)山東萊恩德智科技有限公司;離心機(jī)(型號(hào):5424)艾本德中國(guó)有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96 Touch)上海艾研生物科技有限公司;光學(xué)顯微鏡(CX31)日本奧林巴斯公司;流式細(xì)胞儀(NOVOCYTE3130)美國(guó)艾森公司。

    1.3方 法

    1.3.1qRT-PCR法檢測(cè)CCL2、CCR2的表達(dá):組織和細(xì)胞的總RNA用Trizol試劑提取。以RNA為模板合成cDNA后,再以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系。CCL2上游引物:5'-TCATAGCTACCACCATCAGTCCTCAG-3'和下游引物:5'-CTGGCTGCTTGTGATTCTCCTGTAG-3';CCR2上游引物:5'-CGCTTCGGCAGCATTACT-3'和下游引物:5'-GTCGAGATGGGATACCCTT-3';GAPDH上游引物:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'和下游引物:5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3';以2-ΔΔCT法計(jì)算組織和細(xì)胞中CCL2、CCR2的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3.2毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞增殖活性的影響:將ECA109細(xì)胞以1×104/孔,接種到96孔板中常規(guī)培養(yǎng),設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24h后,加入含0、10、20、40、60、80、160nmoL/L毛蘭素的培養(yǎng)液48h后加入MTT溶液20μL/孔。再培養(yǎng)4h后,每孔加入二甲基亞砜150μL。在酶標(biāo)儀上于490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度(OD490)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    1.3.3細(xì)胞干預(yù)與分組:將ECA109細(xì)胞分為control組、毛蘭素低、中、高劑量組、pcDNA組、pcDNA-CCL2組,使用轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,毛蘭素低、中、高劑量組用20、40、60nmoL/L毛蘭素進(jìn)行干預(yù)48h,pcDNA組、pcDNA-CCL2組用60nmoL/L毛蘭素干預(yù)48h,隨后qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

    1.3.4細(xì)胞增殖檢測(cè):1.3.2中MTT試劑盒方法檢測(cè)各組ECA109細(xì)胞增殖。另取轉(zhuǎn)染后的各組ECA109細(xì)胞按照800~1000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,連續(xù)培養(yǎng)14d,固定后用0.5%結(jié)晶紫溶液染色觀(guān)察集落形成數(shù)。

    1.3.5細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染后的ECA109細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),使用涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn),遷移實(shí)驗(yàn)未涂有Matrigel基質(zhì)膠,各組細(xì)胞取200μL(2×105)細(xì)胞懸液加入上室,下室加入600μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h,固定染色,顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

    1.3.6細(xì)胞凋亡檢驗(yàn):收集各組細(xì)胞,以預(yù)冷的PBS洗滌2次,添加100μL結(jié)合緩沖液懸浮各組ECA109細(xì)胞,Annexin V-FITC和PI染液避光染色15min,重懸后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

    1.3.7CD8+T細(xì)胞增殖和凋亡及上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平檢測(cè):使用Ficoll試劑盒從健康志愿者全血中分離和純化人類(lèi)外周血單核細(xì)胞,再用流式細(xì)胞儀從外周血單核細(xì)胞中分離出CD8+T細(xì)胞。將CD8+T分為T(mén)細(xì)胞組(CD8+T細(xì)胞)、共培養(yǎng)組(ECA109和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng))、毛蘭素組(ECA109和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+80nmoL/L毛蘭素)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染后ECA109和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+80nmoL/L毛蘭素)、pcDNA-CCL2組(轉(zhuǎn)染后ECA109和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)+80nmoL/L毛蘭素),通過(guò)Transwell小室將ECA109細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共培48h,收集各組細(xì)胞,MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T細(xì)胞增殖和凋亡,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū),檢測(cè)CD8+T細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平。

    1.3.8PCNA、Bax、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白檢測(cè):采用Western blot法檢測(cè)PCNA、Bax、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá),PCNA、Bax、PD-L1、CCL2、CCR2及GAPDH一抗稀釋液按照1∶1500稀釋,HRP標(biāo)記的二抗按照1∶1000稀釋,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件分析各蛋白表達(dá)。

    2 結(jié) 果

    2.1CCL2、CCR2在組織和細(xì)胞中的表達(dá):與癌旁組織比較,EC組織中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1和表1;與HEEC細(xì)胞比較,ECA109、EC9706、TE-1細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05),且ECA109細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表達(dá)水平最低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此,選擇ECA109細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖2和表2。

    表1 CCL2 CCR2在癌旁組織和EC組織中的表達(dá)比較

    表2 不同EC細(xì)胞中CCL2 CCR2的表達(dá)比較

    圖1 癌旁組織和EC組織中CCL2、CCR2蛋白表達(dá)

    圖2 不同EC細(xì)胞中CCL2、CCR2蛋白表達(dá)

    2.2毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞的增殖抑制情況:與0 μmoL/L比較,ECA109細(xì)胞增殖抑制率在0、10、20、40、60、80、160nmoL/L毛蘭素干預(yù)下以劑量依賴(lài)性的方式顯著增加(P<0.05),IC50分別為74.30nmoL/L,本研究選取20、40、60nmoL/L毛蘭素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表3。

    表3 不同濃度的毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞的增殖抑制率

    2.3毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞中CCL2、CCR2表達(dá)的影響:與control組比較,毛蘭素低、中、高劑量組ECA109細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組ECA109細(xì)胞中CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),見(jiàn)表4。

    表4 各組ECA109細(xì)胞中CCL2 CCR2表達(dá)比較

    2.4毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞增殖能力的影響:與control組比較,毛蘭素低、中、高劑量組ECA109細(xì)胞OD490值、集落形成數(shù)顯著降低(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組ECA109細(xì)胞OD490值、集落形成數(shù)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖3和表5。

    表5 各組ECA109細(xì)胞OD490值集落形成數(shù)比較

    圖3 各組細(xì)胞集落形成數(shù)比較

    2.5毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響:與control組比較,毛蘭素低、中、高劑量組ECA109細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組ECA109細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖4和表6。

    表6 各組ECA109細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)比較

    圖4 Transwell小室檢測(cè)ECA109細(xì)胞遷移與侵襲

    2.6毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞凋亡的影響:與control組比較,毛蘭素低、中、高劑量組ECA109細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組ECA109細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖5和表7。

    表7 各組ECA109細(xì)胞凋亡率比較

    圖5 各組ECA109細(xì)胞凋亡情況比較

    2.7毛蘭素對(duì)免疫細(xì)胞及免疫因子的影響:與T細(xì)胞組比較,共培養(yǎng)組CD8+T細(xì)胞OD490值、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低,細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05);與共培養(yǎng)組比較,毛蘭素組CD8+T細(xì)胞OD490值、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高,細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組CD8+T細(xì)胞OD490值、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低,細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05),見(jiàn)圖6和表8。

    表8 各組CD8+T細(xì)胞增殖凋亡和IFN-γ IL-2 TNF-α水平比較

    2.8毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞內(nèi)PCNA、Bax、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)水平的影響:與control組比較,毛蘭素低、中、高劑量組ECA109細(xì)胞內(nèi)PCNA、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與pcDNA組比較,pcDNA-CCL2組ECA109細(xì)胞PCNA、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖7和表9。

    表9 各組ECA109細(xì)胞中PCNA Bax PD-L1 CCL2 CCR2蛋白表達(dá)比較

    圖7 ECA109細(xì)胞內(nèi)中PCNA、Bax、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表達(dá)

    3 討 論

    EC是最具侵襲性的癌癥之一,其病死率較高,嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生活質(zhì)量。因此,揭示EC發(fā)生的關(guān)鍵分子機(jī)制,對(duì)于提高EC患者的治療水平具有重要意義。

    毛蘭素在體內(nèi)和體外因具有良好的抗腫瘤活性而備受關(guān)注。毛蘭素通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡[6]。毛蘭素通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2、ALOX12通路,誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡,從而抑制膀胱癌、腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7-8]。毛蘭素通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡和激活JNK途徑抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn),毛蘭素抑制ECA109細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)其凋亡,由此推測(cè),毛蘭素可作為治療EC的潛在藥物。

    目前發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞具有抑制腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞分泌TNF-α、IL-2和IFN-γ的能力,從而有利于腫瘤細(xì)胞逃逸免疫細(xì)胞的免疫檢查,在惡性腫瘤治療中,調(diào)節(jié)免疫抑制途徑發(fā)揮了重要作用,PD-L1信號(hào)通路是腫瘤免疫抑制的重要組成部分,可抑制T淋巴細(xì)胞活化,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫耐受性,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。此外研究發(fā)現(xiàn),毛蘭素具有免疫調(diào)節(jié)的作用。毛蘭素顯著影響肝癌中免疫相關(guān)細(xì)胞因子(TNF-α、CCL2)水平[10]。CD47通常在腫瘤細(xì)胞中上調(diào)以逃避先天免疫,毛蘭素通過(guò)調(diào)節(jié)CD47啟動(dòng)子上的H3K27乙酰標(biāo)記富集來(lái)降低CD47的表達(dá),增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用,抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。毛蘭素可增加肺癌小鼠的胸腺指數(shù),IL-2和TNF-α水平,降低IL-10水平和脾臟指數(shù),增強(qiáng)肺癌小鼠的免疫功能[12]。毛蘭素抑制PD-L1表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞毒性及T淋巴細(xì)胞活性,增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答,從而抑制宮頸癌細(xì)胞血管生成、增殖、侵襲和遷移。本研究發(fā)現(xiàn),毛蘭素能升高CD8+T細(xì)胞的OD490值及細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平,降低CD8+T細(xì)胞凋亡率及PD-L1蛋白表達(dá)。提示,毛蘭素可通過(guò)促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖及提高免疫因子的水平,抑制免疫細(xì)胞凋亡,抑制ECA109細(xì)胞的惡性行為,從而起到抗EC的作用。

    CCL2是免疫系統(tǒng)中重要調(diào)節(jié)因子,CCL2-CCR2通路的激活可抑制免疫細(xì)胞活化,利于惡性腫瘤的發(fā)展。越來(lái)越多的研究表明,在前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和肝癌等不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭?抑制CCL2可以清除炎性單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,減少腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5-6]。在EC中,研究表明CCL2表達(dá)增加與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤侵襲有關(guān)[6]。本研究發(fā)現(xiàn),毛蘭素能抑制CCL2、CCR2 mRNA及蛋白表達(dá),并且過(guò)表達(dá)CCL2后,升高了CCL2、CCR2 mRNA表達(dá)及免疫因子水平,抑制免疫細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡,從而減輕毛蘭素對(duì)ECA109細(xì)胞惡性行為的抑制作用。提示,毛蘭素可能通過(guò)抑制CCL2-CCR2信號(hào)通路,增強(qiáng)免疫細(xì)胞和免疫因子水平,從而抑制ECA109細(xì)胞的惡性行為。

    綜上所述,毛蘭素可能通過(guò)抑制CCL2-CCR2信號(hào)通路,增強(qiáng)免疫細(xì)胞和免疫因子水平,從而抑制ECA109細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)其凋亡。為治療EC提供了新的參考,但本研究尚有不足之處,僅僅在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了毛蘭素的作用,并未在體內(nèi)水平上進(jìn)行探討,后續(xù)研究將會(huì)在體內(nèi)水平上進(jìn)行進(jìn)一步探索。

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