HPLC法測定銀黃甘顆粒中黃芩有效成分黃芩苷的含量*

鄭雪媚，蔣順進(jìn)，黃欽耿，劉宗新

(1 廣東容大生物股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2 清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

豬感冒是一種急性呼吸道器官的疾病，一年四季各種類型的豬都可發(fā)生，多發(fā)于氣候多變的早春和深秋，仔豬、小豬更容易發(fā)生。豬感冒等呼吸道疾病對(duì)現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展有較大影響。目前，豬感冒尚無特效藥物，臨床上主要采用抗菌藥物?？股氐拈L期使用和濫用，易致使病原微生物發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥性，給后期疾病的防控帶來困難，導(dǎo)致一些疾病藥物無法治愈，甚至產(chǎn)生“超級(jí)細(xì)菌”。銀黃甘顆粒由金銀花提取物、黃芩提取物和甘草浸膏組方而成。方中金銀花為君藥，能疏散風(fēng)熱、清熱解毒；黃芩為臣藥，能增強(qiáng)金銀花清熱解毒之功效；甘草為佐使藥，能助金銀花、黃芩清熱解毒，又能祛痰止咳。黃芩過于苦寒，苦寒傷胃，而甘草具有甘緩護(hù)胃功效。三藥合用，共奏清熱、解毒、止咳之功效，主治豬外感發(fā)熱、咳嗽。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芩含有黃芩苷、黃芩素等主要活性成分，具有解熱抗炎[1-3]、抗菌[4-11]、抗病毒[12-16]、抗支原體[17]、清除自由基、抗氧化[18]等藥理作用。

按照中國獸藥典要求[19]，根據(jù)黃芩苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立測定銀黃甘顆粒中黃芩苷含量的HPLC法。該方法具有定量檢測準(zhǔn)確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡單等特點(diǎn)，為銀黃甘顆粒的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和材料

SPD-20A日本島津液相色譜儀、CTO-20AC柱溫箱、UPR-5T超純水儀、KQ-500DE超聲波清洗器、METTLER MS105DU天平、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(含量98.8%)，中國食品藥品檢定研究院；銀黃甘顆粒(水分為1.8%)，廣東容大生物股份有限公司生產(chǎn)；水為超純水；甲醇為色譜純；磷酸為AR級(jí)別。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(50∶50∶0.2)為流動(dòng)相；

色譜柱：菲羅門C185 μm，4.6 mm×250 mm；

檢測波長：274 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：35 ℃；

進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品20 mg，置100 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解，取上述溶液5 mL，置25 mL棕色容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

取銀黃甘顆粒適量，研細(xì)，取約0.4 g，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取上述溶液5 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

1.4 陰性干擾測定

以相同的處方比例，按照銀黃甘顆粒的制備工藝，制得黃芩提取物的陰性制劑。取黃芩提取物的陰性顆粒適量，按1.3.2項(xiàng)下制成黃芩提取物陰性顆粒溶液。進(jìn)樣測試，結(jié)果陰性溶液無干擾。證明本方法用于黃芩苷的含量測定具有專屬性。

圖1 黃芩苷對(duì)照品

圖2 銀黃甘顆粒缺黃芩樣品

圖3 銀黃甘顆粒含黃芩樣品

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取黃芩苷對(duì)照品50.9 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加甲醇使溶解，作為對(duì)照品貯備液；分別移取對(duì)照品貯備液2、5、10、15、20、25 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。對(duì)以上6種對(duì)照品溶液進(jìn)樣測定，記錄峰面積。記錄色譜圖，測定結(jié)果見表1。

以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。結(jié)果表明，在20.12 ～251.45 μg/mL范圍內(nèi)，黃芩苷濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=35 819x-111 380，R2=1。

1.6 精密度試驗(yàn)

精密稱取黃芩苷對(duì)照品24.7 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含48.8 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果見表2。

表2 黃芩苷精密度試驗(yàn)

結(jié)果表明，黃芩苷峰面積RSD為0.1%，證明本方法的精密度良好。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定黃芩苷對(duì)照品26.2 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含51.8 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒適量，研細(xì)，按1.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，平行處理6份，進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表3 黃芩苷含量測定重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果表明，黃芩苷含量RSD為0.8%，證明本測試方法重復(fù)性良好。

1.8 回收率試驗(yàn)

對(duì)照品母液的制備：精密稱取黃芩苷對(duì)照品50.1 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度使溶解，作為黃芩苷對(duì)照品母液。

對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品母液5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，共計(jì)6份，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，再精密加入黃芩苷對(duì)照品母液5 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取上述溶液5 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表4。

表4 黃芩苷含量測定回收率試驗(yàn)

結(jié)果顯示，黃芩苷回收率的平均值為100.4%，RSD值為0.8%，表明本方法回收率較好。

1.9 黃芩苷測定方法的耐用性研究

本試驗(yàn)考察色譜柱溫度、流速、波長、不同品牌色譜柱及流動(dòng)相比例對(duì)銀黃甘顆粒中黃芩苷含量測定的影響。

1.9.1 不同的色譜柱溫度

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定黃芩苷對(duì)照品25.2 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含49.8 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，色譜柱溫度分別設(shè)定為25、30、35 ℃，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表5。

表5 不同色譜柱溫度對(duì)黃芩苷含量的影響

結(jié)果表明，色譜柱溫度的微小變化對(duì)黃芩苷含量無明顯影響。

1.9.2 不同的流速

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定銀黃苷對(duì)照品25.1 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含49.6 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，流動(dòng)相流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表6。

表6 不同流動(dòng)相速度對(duì)黃芩苷含量的影響

結(jié)果表明，流動(dòng)相速度的微小變化對(duì)黃芩苷含量無明顯影響。

1.9.3 不同的色譜柱

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定黃芩苷對(duì)照品24.7 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含48.8 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，使用不同的色譜柱，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表7。

結(jié)果證實(shí)，不同品牌色譜柱對(duì)黃芩苷的含量測定無明顯影響。

1.9.4 不同的測定波長

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定黃芩苷對(duì)照品25.0 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含49.4 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，測定波長分別設(shè)定為271、272、273、274、275、276、277 nm，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表8。

結(jié)果表明，測定波長的微小變化對(duì)黃芩苷含量無明顯影響。

1.9.5 不同的流動(dòng)相比例

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定黃芩苷對(duì)照品25.3 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含50.0 μg黃芩苷對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其他色譜條件不變的情況下，流動(dòng)相甲醇-水-磷酸比例分別設(shè)定為45∶55∶0.2、50∶50∶0.2、55∶45∶0.2，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表9。

表9 不同色譜流動(dòng)相比例對(duì)黃芩苷含量的影響

結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微小變化對(duì)黃芩苷含量無明顯影響。

采用本方法能準(zhǔn)確測定銀黃甘顆粒中的黃芩苷的含量，方法的耐用性較好。

2 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測銀黃甘顆粒中黃芩有效成分黃芩苷的含量。測定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(50∶50∶0.2)；檢測波長為274 nm。該方法定量檢測準(zhǔn)確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡單，為銀黃甘顆粒質(zhì)量控制提供了依據(jù)。