基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析消癉片改善胰島素抵抗的機(jī)制

吳躍,陳中,陽婉容,黃淑玲

作者單位： 523000 廣東省東莞市,廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院內(nèi)分泌科

近年來,我國糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢。《中國2型糖尿病防治指南(2020版)》顯示,我國糖尿病發(fā)病率已達(dá)11.2%。胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病的主要特征和重要致病機(jī)制,除此之外,IR還可以導(dǎo)致超重或肥胖、高血壓、高脂血癥、代謝綜合征及多囊卵巢綜合征等多種疾病。中醫(yī)藥治療糖尿病具有獨(dú)特的優(yōu)勢,不僅能夠降低患者的血糖水平,還能改善IR,并且沒有明顯不良反應(yīng)。中醫(yī)學(xué)將IR歸入“消渴”“消癉”“脾癉”等范疇。消癉片是東莞市名中醫(yī)黃淑玲教授經(jīng)驗(yàn)方,主要用于氣滯痰阻血瘀型糖尿病早期患者。臨床研究表明,消癉片可以明顯改善患者IR[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅葘W(xué)科融合的方法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,人與自然界是一個(gè)統(tǒng)一整體,形成了“天人合一”的系統(tǒng)性調(diào)控理論,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“藥物—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò),探討網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)生物功能與疾病的互相作用關(guān)系,這與中醫(yī)的整體觀是一致的[2]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)消癉片的有效成分進(jìn)行篩選,預(yù)測其改善IR的相關(guān)靶點(diǎn)及通路,證實(shí)其臨床療效,并為深入開展有關(guān)研究工作提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 消癉片的活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)對(duì)消癉片的8味藥(萊菔子、郁金、玄參、牡丹皮、大黃、川貝母、桃仁、丹參)進(jìn)行檢索。由于是復(fù)方成分,化合物較多,故以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效成分及對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白,然后利用UniProt在線數(shù)據(jù)庫逐一查找靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因。

1.2 消癉片治療IR潛在靶點(diǎn)的預(yù)測 登錄GeneCards數(shù)據(jù)庫,查找并下載與IR相關(guān)的靶點(diǎn),查找關(guān)鍵詞為“insulin resistance”。將消癉片和IR各自靶點(diǎn)輸入網(wǎng)絡(luò)工具Venny 2.1內(nèi),繪制韋恩圖,取相交靶點(diǎn),獲得消癉片改善IR的潛在靶點(diǎn)。

1.3 消癉片治療IR的關(guān)鍵活性成分預(yù)測 用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物—成分—共同靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,通過Network Analyzer工具對(duì)藥物有效成分進(jìn)行分析,選取連接度(Degree值)較大的作為消癉片改善IR的關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.2項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫,生物種類限定為“Homo Sapiens”,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),數(shù)據(jù)保存為TSV格式,之后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化展示。

1.5 基因富集分析 使用R語言軟件中的數(shù)據(jù)包和相關(guān)函數(shù)將1.2項(xiàng)得到的潛在作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為基因ID,然后進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 消癉片的活性成分及其作用靶點(diǎn) 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)在TCMSP中檢索獲取藥物活性成分,其中萊菔子2種,郁金3種,玄參5種,牡丹皮6種,大黃10種,川貝母10種,桃仁19種,丹參59種,其中共有成分有3種。去重后得到106種活性成分,共作用于266個(gè)靶點(diǎn),見表1。

表1 消癉片的主要活性成分

2.2 交集靶點(diǎn)的確定 GeneCards數(shù)據(jù)庫中,與IR相關(guān)的靶點(diǎn)總共有9 041個(gè),以“Relevance score≥10”作為標(biāo)準(zhǔn),篩選出632個(gè)相關(guān)度高的靶點(diǎn),與消癉片活性成分的靶點(diǎn)在韋恩圖中相交,得到55個(gè)交集靶點(diǎn),見圖1。

圖1 消癉片—IR韋恩圖

2.3 活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件繪制消癉片藥物成分和靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò),見圖2。用Network Analyzer工具分析出Degree值排前8位的主要成分為:β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、木犀草素、丹參酮ⅡA、豆甾醇、柳杉酚、柚皮素。其中β-谷甾醇為川貝母、大黃、桃仁、玄參、郁金的共同成分,豆甾醇為川貝母、萊菔子、牡丹皮、玄參、郁金的共同成分,柳杉酚為丹參、玄參的共同成分。

注:八邊形代表藥物成分,菱形代表靶點(diǎn),圓形代表中藥(TR:桃仁,CBM:川貝母,LFZ:萊菔子,DS:丹參,XS:玄參,MDP:牡丹皮,DH:大黃,YJ:郁金),A、B、C分別對(duì)應(yīng)共有成分β-谷甾醇、豆甾醇、柳杉酚,圖形面積代表作用強(qiáng)度

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將STRING數(shù)據(jù)庫得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò),得到含55個(gè)節(jié)點(diǎn)、544條邊的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖3。Degree值較大的基因有白介素-6(IL-6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP3)、表皮生長因子受體(EGFR)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)轉(zhuǎn)錄因子、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等,表明這些靶點(diǎn)可能是消癉片改善IR的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

注:內(nèi)層菱形為Degree值前10的基因,圖形大小代表Degree值大小

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 將2.2項(xiàng)得到的55個(gè)靶點(diǎn)通過R語言軟件進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析。GO功能富集分析得到消癉片1 221個(gè)生物過程(BP),主要涉及細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、類固醇激素的調(diào)節(jié)、酮的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控及對(duì)電解質(zhì)、體液調(diào)控,見圖4。KEGG通路富集分析得到130條,消癉片主要調(diào)控脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)、多種癌癥(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Chemical carcinogenesis-receptor activation、Colorectal cancer、Prostate cancer、Proteoglycans in cancer、Breast cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物—糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子(TNF signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、酒精性肝病(Alcoholic liver disease)、內(nèi)分泌抗性(Endocrine resistance)、IR(insulin resistance)等信號(hào)通路,見圖5。

注:圖中展示了P值及富集基因數(shù)排前20位的條目

注:圖中展示了P值及富集基因數(shù)排前20位的條目

3 討 論

從“藥物—成分—共同靶點(diǎn)”的互作網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出,槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素均是消癉片有效的活性成分,這些化合物均是黃酮類化合物,均可以有效地清除氧自由基,降低脂質(zhì)過氧化,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,減弱α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,調(diào)節(jié)有關(guān)基因蛋白的表達(dá),提升胰島素敏感性,使其達(dá)到抗IR作用。甾醇類成分中,豆甾醇等植物類甾醇可以通過降低膽固醇和三酰甘油達(dá)到降低血脂的目的,從而改善IR,延緩2型糖尿病的進(jìn)展[3];β-谷甾醇通過調(diào)節(jié)IRS-1/AKT介導(dǎo)的胰島素信號(hào)途徑,發(fā)揮降脂、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)葡萄糖吸收作用,緩解IR。尤一萍[4]通過臨床試驗(yàn)證明,丹參酮ⅡA可降低脂聯(lián)素,減輕炎性反應(yīng),促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能恢復(fù),從而改善患者血循環(huán)及IR。

GO功能富集分析結(jié)果顯示,消癉片與BP相關(guān)的主要集中在細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、類固醇激素的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控及對(duì)電解質(zhì)、體液調(diào)控的反應(yīng)上,表明在肥胖缺氧、高酮、離子紊亂、脫水狀態(tài)下,炎性因子表達(dá)增加,誘導(dǎo)IR,此外,類固醇激素升高,拮抗胰島素,也會(huì)降低胰島素敏感性。

KEGG富集分析結(jié)果顯示,消癉片主要調(diào)控脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、多種癌癥、乙型肝炎、內(nèi)分泌抗性、IR、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、缺氧誘導(dǎo)因子-1、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子、酒精性肝病等信號(hào)通路,大部分通路存在互相關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用的關(guān)系。

KEGG富集分析結(jié)果顯示,消癉片有效活性成分的作用靶標(biāo)與多種癌癥相關(guān)。有研究表明,IR與多種常見癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)[5],可能機(jī)制是通過腫瘤壞死因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1、PI3K-Akt等信號(hào)通路來發(fā)揮改善IR的作用。

肥胖和IR經(jīng)常伴隨著炎性遞質(zhì)的顯著增加,體現(xiàn)了IR和動(dòng)脈粥樣硬化之間存在聯(lián)系。動(dòng)脈粥樣硬化在許多方面類似于炎癥狀態(tài),具有顯著的炎性細(xì)胞浸潤和炎性遞質(zhì)表達(dá),目前已知脂肪組織可以動(dòng)態(tài)產(chǎn)生多種炎性遞質(zhì),如腫瘤壞死因子-α、白介素-1、白介素-6等。大量研究表明,這些炎性遞質(zhì)使IR表型永久化,并對(duì)血管系統(tǒng)造成有害影響[6]。IR中可能與血管疾病臨床相關(guān)的兩個(gè)主要信號(hào)通路涉及核因子-κB(NF-κB)和c-Jun N-末端激酶(JNK)。

有研究表明,糖尿病患者晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)在體內(nèi)積聚所誘發(fā)的炎性反應(yīng)既可以引發(fā)IR,又導(dǎo)致胰島素β細(xì)胞凋亡增加和功能減退。內(nèi)源性AGEs能促進(jìn)體內(nèi)氧化應(yīng)激,刺激炎癥發(fā)生的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)的糖化產(chǎn)物。AGEs-RAGE介導(dǎo)的病理過程的啟動(dòng)涵蓋了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB等多種導(dǎo)致氧化應(yīng)激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPK的活化促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和浸潤,而NF-κB的活化則會(huì)造成大量促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放,如IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等,從而造成慢性細(xì)胞活化效應(yīng)和組織損傷,進(jìn)而參與胰島細(xì)胞功能受損的發(fā)病機(jī)制。馮燕等[7]研究表明,AGEs與IR呈正相關(guān),AGEs是IR的重要危險(xiǎn)因素,表明在2型糖尿病初期,AGEs能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,釋放炎性因子,使體內(nèi)各種應(yīng)激酶活性增加,這些激酶能使蛋白分子在胰島素作用通路上發(fā)生磷酸化改變,從而形成IR。

PI3K-Akt信號(hào)通路參與了負(fù)責(zé)儲(chǔ)存能量的白色脂肪組織向負(fù)責(zé)產(chǎn)熱耗能的褐色脂肪組織的轉(zhuǎn)變過程,產(chǎn)能過程中需要消耗葡萄糖和脂質(zhì)成分,進(jìn)而改善IR。脂肪組織還會(huì)在低氧環(huán)境下釋放IL-6、TNF-α等炎性因子,激活脂肪細(xì)胞內(nèi)HIF-1α以及其調(diào)控的低氧反應(yīng)相關(guān)通路,導(dǎo)致胰島素敏感性下降、血糖升高,進(jìn)而發(fā)生慢性炎癥及IR。

李婷等[8]通過對(duì)代謝綜合征的患者觀察研究發(fā)現(xiàn),HBV感染組的空腹血糖、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)高于非感染組,表明HBV感染可能與IR有關(guān)。長時(shí)間大量飲酒后,乙醇會(huì)對(duì)細(xì)胞中的IRS1/2、PI3K、AKT等蛋白的表達(dá)或磷酸化造成干擾[9],同時(shí),飲酒還能引起體內(nèi)的炎性因子在肝細(xì)胞中激活細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子(SOCSs)的表達(dá),過量的SOCSs可以與胰島素受體或IRS-1結(jié)合[10],抑制IRS-1/PI3K/AKT途徑的激活,減少肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感程度,進(jìn)而產(chǎn)生肝IR。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)分析了消癉片改善IR的作用機(jī)制,結(jié)果顯示其具有多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn),為臨床中使用消癉片改善IR提供了理論依據(jù)。但不可否認(rèn)的是,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)存在一定的局限性,如缺乏中藥在制劑中發(fā)生一系列復(fù)雜變化的研究數(shù)據(jù),忽略了藥物劑量問題,不同的數(shù)據(jù)處理方法對(duì)結(jié)果的影響等。后續(xù)仍需完善試驗(yàn)研究,對(duì)消癉片改善IR的具體作用機(jī)制加以明確。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。