臨床常用抗菌藥物組合對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的體外抗菌作用

王元春,張麗華,吳慶榮,楊建林,卓倩

作者單位： 341000 江西省贛州市第五人民醫(yī)院

碳青霉烯類抗菌藥物屬于目前臨床應(yīng)用最廣且抗菌活性最強的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,對肺炎克雷伯菌具有較好的抗菌活性[1],至今仍是臨床治療肺炎克雷伯菌感染的首要抗菌藥物。近年來,碳青霉烯類抗生素臨床應(yīng)用頻率日益增加,逐漸出現(xiàn)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)[2],全球各國存在蔓延形勢,美國、希臘、意大利等地也相繼出現(xiàn)CRKP流行的報道[3]。歐洲抗菌素藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)報道意大利CRKP檢出率由2006—2009年的1%～2%上升到2011年的30%[4]。另外,國內(nèi)CRKP數(shù)量也逐年增加,2017年肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為20.9%、24.0%[5]。另外,中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示,在我國臨床標(biāo)本分離的細(xì)菌中,2021年肺炎克雷伯菌在臨床分離菌株主要菌群分布中排名第二[6],然而CRKP是流行性碳青霉烯耐藥腸桿科細(xì)菌(CRE)感染中最重要的病原體,病死率高達(dá)18%～60%[7-8]。當(dāng)前形式嚴(yán)峻,已成為臨床治療感染的難題之一。因此,CRKP對常見抗菌藥物易產(chǎn)生多重或廣泛耐藥,使得臨床醫(yī)師選擇抗菌藥物的種類有限,單一用藥治療效果甚微,臨床常采用聯(lián)合用藥治療方案。本研究旨在評價多黏菌素B、亞胺培南、米諾環(huán)素、替加環(huán)素、多西環(huán)素聯(lián)合用藥方案治療CRKP感染的體外活性和可行性,以期為有效治療CRKP感染提供理論依據(jù),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2018年6月—2019年10月贛州市第五人民醫(yī)院臨床分離的7株非重復(fù)CRKP菌株,來源于痰液4株、尿液2株、血液1株。

1.2 儀器與試劑 WalkAway-96 plus細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(德國西門子);Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂);DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀;BIO-RAD基因擴增儀(美國伯樂);96孔平底培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司生產(chǎn));核酸染料(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn));瓊脂糖(西班牙Biowest生產(chǎn));Muller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基(美國Difco公司生產(chǎn));Muller-Hinton(MH)肉湯(美國Difco公司生產(chǎn));質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922(購自中國藥品生物制品檢驗所);亞胺培南(大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));替加環(huán)素、氨曲南、慶大霉素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素(均由阿拉丁生物試劑公司生產(chǎn))。

1.3 方法

1.3.1 CRKP菌株確定:使用WalkAway-96 plus細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)對菌株進行篩選,選出對美羅培南或亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌株,并采用微量肉湯稀釋法進一步驗證藥敏結(jié)果。CRKP即肺炎克雷伯菌至少對1種碳青霉烯類藥物美羅培南或亞胺培南耐藥[最低抑菌濃度(MIC)≥2 mg/L]。

1.3.2 CRKP基因組DNA模板提取:采用熱激法制備CRKP的DNA模板,用無菌棉簽將分離純化的細(xì)菌洗脫到200 μl無菌蒸餾水中,并置于-20 ℃冰箱中,1 min后取出,放入預(yù)先備好的100 ℃金屬水浴鍋中靜置10 min,然后置于-20 ℃中保持1 min,后以10 000 r/min離心10 min使被裂解的細(xì)菌沉淀下來,將上清液吸取到新的EP管中,該上清液即為提取的CRKP基因組DNA模板溶液,將樣品儲存在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因的擴增:使用PCR技術(shù)同時擴增肺炎克雷伯菌的5種碳青霉烯酶基因KPC、IMP、OXA、VIM、NDM并鑒定,引物序列見表1。

表1 KPC基因引物序列及預(yù)計片段

1.3.4 KPC基因擴增片段電泳鑒定:用980 ml的去離子水與20 ml的50×TAE原液混合,稀釋至1*TAE緩沖液,以配置2%瓊脂糖凝膠和電泳液。反應(yīng)結(jié)束后,按順序在泳道內(nèi)分別加入10 μl PCR產(chǎn)物,電壓設(shè)置為100 V,由負(fù)極向正極電泳30 min。電泳結(jié)束后,將凝膠放置在紫外光線下,用Gel DOCTMXR+凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照保存。最后,將相關(guān)片段送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.5 聯(lián)合藥敏試驗:采用96孔板棋盤法:在96孔平底培養(yǎng)板上加入50 μl不同濃度的A藥和B藥,并在第一行中僅加入100 μl的A藥,第一列僅加入100 μl的B藥,藥物濃度由低至高,再將濃度為1×106CFU/ml的肺炎克雷伯菌菌液100 μl加入96孔平底培養(yǎng)板的1～11列中,使菌液終濃度約為5×105CFU/ml。設(shè)定生長對照(只加細(xì)菌,無藥物)和無菌對照[只加Muller-Hinton(MH)肉湯,無細(xì)菌]。將96孔平底培養(yǎng)板放置在旋渦混合儀上混合20 s,并置入37 ℃培養(yǎng)箱中,20 h后觀察結(jié)果。記錄96孔平底培養(yǎng)板中兩藥聯(lián)合區(qū)域最佳組合效應(yīng)時各自的MICA聯(lián)合和MICB聯(lián)合,計算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI),兩藥作用判定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 兩藥作用判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

表3 CRKP菌株藥敏結(jié)果

2.2 CRKP耐藥基因檢測結(jié)果 PCR技術(shù)擴增及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,這些菌株均為產(chǎn)KPC(引物序列片段246 bp)的肺炎克雷伯菌,經(jīng)測序后證實為KPC基因,見圖1。

圖1 部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對CRKP的體外抗菌作用 多黏菌素B與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用以相加作用為主,其中相加作用率為57.14%(4/7),無關(guān)作用率為42.86%(3/7)。多黏菌素B與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用時以相加作用為主,其中相加作用率為71.43%(5/7),協(xié)同作用率和無關(guān)作用率均為14.29%(1/7)。多黏菌素B與米諾環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用也以相加作用為主,其中相加作用率為85.71%(6/7),無關(guān)作用率為14.29%(1/7)。多黏菌素B與多西環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用也以相加作用為主,其中相加作用率為57.14%(4/7),無關(guān)作用率為14.29%(1/7),拮抗作用率為28.56%(2/7)。

替加環(huán)素與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用則以拮抗作用為主,其中拮抗作用率為71.43%(5/7),相加作用率和無關(guān)作用率均為14.29%(1/7)。米諾環(huán)素與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用以無關(guān)作用為主,其中無關(guān)作用率為71.43%(5/7),協(xié)同作用率和拮抗作用率均為14.29%(1/7)。多西環(huán)素與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用以拮抗作用為主,其中拮抗作用率為85.71%(6/7),相加作用率為14.29%(1/7),見表4。

表4 抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對CRKP的體外抗菌作用 (株)

3 討 論

肺炎克雷伯菌隸屬腸桿菌科中重要的致病菌,可引起社區(qū)及醫(yī)院獲得性感染,導(dǎo)致肺炎、肝膿腫、泌尿系統(tǒng)感染及血流感染等多種感染性疾病[7]。隨著近年來廣譜抗生素藥物的廣泛應(yīng)用或濫用,耐多藥菌越來越多,給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)[9],抗菌藥物品種選擇有限,特別是耐藥肺炎克雷伯菌,已成為目前廣泛關(guān)注的高耐藥性致病菌[10]。碳青霉烯類藥物被認(rèn)為是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的首選抗生素[11],但臨床頻繁使用導(dǎo)致并加劇了碳青霉烯類耐藥菌株出現(xiàn)。據(jù)文獻報道,替加環(huán)素、黏菌素、磷霉素及其他早期使用的藥物對碳青霉烯耐藥菌株具有抗菌活性[12],然單一用藥也可使病原菌耐藥性增加[13],這無疑給臨床治療CRKP帶來巨大挑戰(zhàn)。有研究表明,聯(lián)合用藥在降低院病死率、細(xì)菌清除失敗率和提高14 d累積生存率方面均優(yōu)于單藥治療[14]。因此,臨床醫(yī)師更傾向于選擇聯(lián)合用藥治療多重耐藥菌感染性疾病。但目前不同藥物組合的抗菌活性并不確切。因此,本研究通過實驗評價臨床上幾種常見抗菌藥物組合對CRKP的體外抗菌活性。

本研究將選取的菌株經(jīng)臨床實驗均證實為產(chǎn)KPC的CRKP,這與研究報道的中國CRKP最常見的產(chǎn)碳青霉烯酶是KPC相符合,同時也表明醫(yī)院CRKP的最主要機制為產(chǎn)KPC,臨床對此應(yīng)給予重點關(guān)注。藥敏試驗結(jié)果顯示,多黏菌素B與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用以相加作用為主,其中相加作用率為57.14%,無關(guān)作用率為42.86%。國外一項回顧性研究表明,多黏菌素B與碳青霉烯藥物聯(lián)合治療CRKP的協(xié)同作用率高達(dá)44%[15],本研究結(jié)果與之接近。此外,多黏菌素B與替加環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用時以相加作用為主,其中相加作用率為71.43%,協(xié)同作用率和無關(guān)作用率均為14.29%,與Ku等[16]研究結(jié)果一致。多黏菌素B與米諾環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用也以相加作用為主,其中相加作用率為85.71%,無關(guān)作用率為14.29%,進一步驗證了Huang等[17]報道的多黏菌素與米諾環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。替加環(huán)素與亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用則以拮抗作用為主,其中拮抗作用率為71.43%,相加作用率和無關(guān)作用率均為14.29%。有報道顯示,替加環(huán)素聯(lián)合亞胺培南有一定的協(xié)同殺菌效應(yīng),但這種聯(lián)合治療方案的臨床療效并不理想[18-19]。但臨床上存在替加環(huán)素聯(lián)合碳青霉烯類藥物成功治療CRKP感染的病例,可能是替加環(huán)素起到主要抗菌活性作用,碳青霉烯類藥物的協(xié)同作用仍不清楚。因此,應(yīng)根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇治療CRKP感染的具體方案。米諾環(huán)素和亞胺培南聯(lián)合應(yīng)用以無關(guān)作用為主,其中無關(guān)作用率為71.43%,協(xié)同作用率和拮抗作用率均為14.29%;多黏菌素B與多西環(huán)素聯(lián)合應(yīng)用也以相加作用為主,其中相加作用率為57.14%,無關(guān)作用率為14.29%,拮抗作用率為28.56%,表明以多黏菌素B為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥(聯(lián)合亞胺培南/替加環(huán)素/米諾環(huán)素/多西環(huán)素)對CRKP具有較好的抗菌活性,而亞胺培南聯(lián)合米諾環(huán)素/多西環(huán)素/替加環(huán)素的抗菌活性未改變或降低。

綜上所述,以多黏菌素B為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥是治療CRKP感染的有效措施,同時也提示臨床在選擇替加環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素治療CRKP感染時,盡量避免與碳青霉烯類藥物聯(lián)合使用,以免降低藥物療效。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。