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    三百棒通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞極化的影響*

    2023-11-02 10:14:26張宗星劉道忠李瑋怡包卓瑪萬兆逸
    中國病理生理雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:極化批號(hào)通路

    張宗星, 劉道忠, 江 露, 李瑋怡, 包卓瑪, 萬兆逸,向 珊, 陳 丹, 袁 林,3△

    (1湖北民族大學(xué)風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 恩施 445000;2湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部,湖北恩施 445000;3湖北省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湖北 恩施 445000;4湖北恩施學(xué)院,湖北 恩施 445000)

    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性自身免疫性疾病,以侵犯關(guān)節(jié)及周圍組織為主,主要特征為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用[1-2],最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示RA的患病率為0.4%~1.3%[3],是目前臨床上致殘率最高的關(guān)節(jié)疾?。?]。巨噬細(xì)胞廣泛存在于關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨中,其作為炎癥性疾病最主要的免疫防御細(xì)胞,可以釋放促炎介質(zhì)促進(jìn)炎癥因子的形成,引起骨和軟骨的病理性吸收和破壞[5]。巨噬細(xì)胞極化失衡與RA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),巨噬細(xì)胞可根據(jù)周圍微環(huán)境的變化極化為促炎的M1 型和抗炎的M2 型,介導(dǎo)免疫/炎癥反應(yīng)和修復(fù),脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞是經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞也稱為選擇性激活巨噬細(xì)胞,在免疫中主要表現(xiàn)出抗炎作用,抑制炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞在炎癥極化的過程中能通過分泌大量促炎細(xì)胞因子,激活成纖維細(xì)胞和促炎性破骨細(xì)胞,加速炎癥反應(yīng),造成組織和關(guān)節(jié)的破壞。因此,靶向巨噬細(xì)胞極化可能是治療RA 的新策略,對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥極化進(jìn)行更為深入的研究具有重大意義。

    三百棒來源于蕓香科Toddalia屬植物飛龍掌血的根,在湖北恩施土家族地區(qū)被廣泛用于治療風(fēng)濕性疾病。《土家族藥物志》記載其可以祛風(fēng)除濕、活血舒筋、消腫止痛,主治風(fēng)寒濕痹癥[6]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí),三百棒提取物具有多種生物活性,包括抗風(fēng)濕[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]、抗腫瘤[10]等作用。

    Toll樣受體4(Toll-like factor 4, TLR4)/核因子κB(nuclaer factor-κB, NF-κB)信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路,對(duì)人體內(nèi)關(guān)節(jié)細(xì)胞從增殖分化到代謝凋亡的進(jìn)程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。本課題組前期研究表明三百棒具有很好的抗炎作用[12-13]。張譽(yù)丹[14]的體外實(shí)驗(yàn)研究表明,三百棒醇提物(Toddalia asiaticaalcohol extract, TAAE)可通過TLR/NF-κB 通路成功誘導(dǎo)RA中成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞凋亡。南奕陽[6]通過建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)一步表明TAAE 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的炎癥放大效應(yīng),減輕炎癥反應(yīng)。三百棒還可通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞自噬并抑制炎癥反應(yīng)[15]。目前關(guān)于三百棒抗關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究并不完整,因此本研究通過RA 體外炎癥模型探討TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化、炎癥反應(yīng)及TLR4/NFκB信號(hào)通路的影響,旨在闡明TAAE 治療RA 的可能機(jī)制,為臨床治療RA提供理論依據(jù),同時(shí)也為土家族藥物三百棒的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 細(xì)胞株

    小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW264.7(貨號(hào):CL-0190)購自武漢普諾塞生命科技有限公司。

    2 主要試劑

    無水乙醇(武漢市中天化工有限公司,批號(hào):20220228);甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):20220112);結(jié)晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):G1062);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(新貝生物公司,批號(hào)分別為F2997 和F2967);胎牛血清(上海逍鵬生物科技有限公司,批號(hào):2110053);青-鏈霉素溶液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,批號(hào):1712180106);DMEM 培養(yǎng)液、PBS、PMSF 蛋白酶抑制劑和CCK-8 試劑盒(大連美侖有限公司,批號(hào)分別為MA0212-Jun-08H、MA0016-Apr-09E、101321211021 和MA0218-5);0.25%胰酶+0.2%EDTA(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司,批號(hào):2208190517);RIPA 裂解液(中國碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):P0013B);BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒和ECL超敏發(fā)光液(武漢科瑞生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為20000311 和2021120617);SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):071222220721);Goat Anti-Rabbit IgG,Goat Anti-Mouse IgG,以及TLR4、iNOS、COX-2、NF-κB、p-NFκB、IκBα 和p-IκBα 抗 體(ABclonal,批 號(hào) 分 別 為20000311、20000275、A5258、A3774、A3560、A2547、AP0123、A19714和AP0707)。

    3 主要方法

    3.1 TAAE 的制備 三百棒采于湖北省恩施州咸豐縣,經(jīng)湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院制劑室張國安主任藥師鑒定為飛龍掌血Toddalia asiatica(L.) Lam。藥材標(biāo)本(No.20200809)現(xiàn)保存于湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部。本研究主要使用三百棒的根皮。參照本課題組前期處理方法[6,14]:取100 g 粉碎過后的三百棒根皮,加入5 倍體積的70%乙醇浸泡充分浸泡數(shù)小時(shí)后,85 ℃恒溫加熱,反復(fù)提取5 次,合并藥液并旋蒸濃縮藥液,使終濃度為1 g/mL。將濃縮過后的藥液平鋪分裝至多個(gè)底面平整的容器內(nèi),并用保鮮膜封口,放入-20 ℃冰箱過夜。然后-80 ℃真空冷凍干燥24 h,裝袋、稱重、標(biāo)記,保存在干燥處防止受潮。

    3.2 藥物處理

    3.2.1 TAAE溶液的配制 稱取1.5 g TAAE凍干粉放入50 mL 的離心管中,用1× PBS 溶解,定容至15 mL 封口,超聲1 h,在超凈工作臺(tái)中打開,用0.22 μm的微孔濾膜過濾3次,EP管分裝,放入4 ℃冰箱備用。

    3.2.2 LPS溶液的配制 無菌環(huán)境下,取10 mL無菌PBS溶解10 mg LPS粉末,配成1 g/L LPS母液,1.5 mL離心管分裝,-20 ℃保存,使用時(shí)稀釋至所需濃度。

    3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 RAW264.7 細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)中培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,每24 h 換一次液,當(dāng)細(xì)胞生長至80%~90%時(shí),輕輕吹打細(xì)胞,使貼壁細(xì)胞脫落或使用細(xì)胞刮順著一個(gè)方向輕輕將細(xì)胞刮下,按1∶3 的比例進(jìn)行傳代,傳2~3 代之后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常對(duì)照(control)組、LPS(1 mg/L)組和TAAE(0.25、0.5、1 和2 g/L)組;Western blot 和免疫熒光實(shí)驗(yàn)增加TAK-242(TLR4 抑制劑,0.2 mmol/L)組。除對(duì)照組外,其余組均用1 mg/L LPS 刺激以誘導(dǎo)細(xì)胞極化和炎癥。藥物作用24 h后,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    3.4 CCK-8 法檢測(cè)TAAE 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 用TAAE(0、0.25、0.5、1 和2 g/L)加或不加LPS(1 mg/L)干預(yù)24 h 后,將含有10% CCK-8 試劑(0.5 g/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液加入每個(gè)孔中,避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度(A),再計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞相對(duì)活力=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)。

    3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化性的影響 按3.3 分組及藥物干預(yù)后,將RAW264.7 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到Transwell 上室24 孔板中。細(xì)胞遷移可以由血清驅(qū)動(dòng),因此將細(xì)胞在無血清DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h,以消除血清的影響。為了測(cè)試遷移能力,將補(bǔ)充10%胎牛血清的500 μL DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)液添加到Transwell 下室中。為了研究趨化性,將含有1 mg/L LPS 的500 μL 無血清DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)液添加到Transwell 下室中。然后,將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h,棄去腔室中的培養(yǎng)液,用PBS 洗滌2次。將小室用甲醇固定30 min,擦去上室中的細(xì)胞。將腔室風(fēng)干后,在0.1%結(jié)晶紫溶液中染色15 min,隨后將其洗掉。風(fēng)干后,在顯微鏡下觀察腔室。每個(gè)腔室隨機(jī)選擇5個(gè)視野,并以200倍的放大倍率拍攝圖像。計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量用于評(píng)估細(xì)胞的遷移和趨化性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    3.6 Griess 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液一氧化氮(nitric oxide, NO)水平 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,以每孔2×105個(gè)的密度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后,按3.3 分組及藥物干預(yù)24 h 后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照NO試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

    3.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子水平RAW264.7 細(xì)胞分組同3.3,藥物干預(yù)24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,用TNF-α、IL-1β 和IL-10 ELISA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子含量。設(shè)置7 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品,將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)樣本每孔100 μL 加入到96 孔板中,37 ℃孵育60 min,洗滌5 次,每次震蕩或靜置40 s。每孔加入100 μL抗體工作液,37 ℃孵育30 min,洗滌5 次。每孔再加入100 μL 酶結(jié)合物工作液,37 ℃孵育30 min,洗滌5 次。最后每孔加入100 μL 顯色底物工作液,37 ℃孵育15 min 后加入100 μL 終止液混勻。使用酶標(biāo)儀測(cè)量A值,通過樣本的A值計(jì)算炎癥因子濃度。

    3.8 熒光染色雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞極化狀態(tài) 收集對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,按照8×107L-1密度將細(xì)胞接種到6 孔板中,每孔2 mL。6 孔板底放入細(xì)胞爬片;貼壁后,按3.3 分組及藥物干預(yù)24 h 后加入2 mL 4%多聚甲醛,室溫固定30 min;100 μL 破膜工作液破膜20 min;3%牛血清白蛋白封閉30 min;滴加Ⅰ抗(大鼠抗小鼠CD68 抗體和兔抗小鼠CD163 抗體),濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜;滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min;DAPI復(fù)染細(xì)胞核;抗熒光淬滅封片劑封片,鏡檢拍照。結(jié)果判讀:CD68+呈紅色熒光,CD163+呈綠色熒光,用ImageJ 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算CD163+/CD68+RAW264.7 細(xì)胞所占比例以反映RAW264.7細(xì)胞極化情況。

    3.9 免疫熒光檢測(cè)NF-κB 核移位 細(xì)胞處理同熒光染色雙標(biāo)法。3%牛血清白蛋白封閉30 min后滴加兔抗小鼠NF-κB 抗體,濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜;滴加Ⅱ抗室溫孵育50 min;DAPI復(fù)染細(xì)胞核;抗熒光淬滅封片劑封片,鏡檢拍照。用ImageJ軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    3.10 Western blot 檢測(cè)相關(guān)因子表達(dá) 按3.3 進(jìn)行分組與藥物干預(yù)后,離心收集細(xì)胞;加入RIPA 細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min 后,離心收集上清,提取細(xì)胞蛋白,BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。各孔取相應(yīng)的蛋白上樣,于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離(濃縮膠電壓70 V,30 min;分離膠電壓110 V,60 min)。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移(280 mA,90 min)至PVDF 膜。加入封閉液于搖床上室溫封閉2 h;TBST洗膜3 次,每次5 min;分別加入Ⅰ抗(均1∶1 000 稀釋),4 ℃反應(yīng)過夜;次日先以TBST 洗膜3 次,每次10 min;后加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶20 000 稀釋),室溫反應(yīng)2 h;再用TBST 洗膜3 次,每次10 min。按ECL試劑盒說明進(jìn)行曝光顯影。采用ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

    3.11 RT-qPCR 檢測(cè)相關(guān)因子的mRNA 水平 取出-80 ℃冰箱中保存的含有Trizol 的新鮮冰凍滑膜組織,自然溶解,用Roche 勻漿儀研磨成漿,移至無RNase 的1.5 mL EP 管中,充分裂解,根據(jù)RNA 提取試劑盒的步驟,提取總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 選用10 μL 反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40 個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線,最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

    表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 TAAE或TAAE+LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響

    用TAAE 或TAAE+LPS(1 mg/L)干預(yù)RAW264.7細(xì)胞24 h,TAAE 在2 g/L 濃度以下對(duì)細(xì)胞不存在毒性作用,而1 mg/L LPS 干預(yù)24 h 對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響,見圖1。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-16],選取0.25、0.5 和1 g/L TAAE及1 mg/L LPS用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    Figure 1.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) and lipopolysaccharide (LPS) on the viability of RAW264.7 cells.A:the cells were treated with different concentrations (0.25, 0.5, 1 and 2 g/L) of TAAE for 24 h, and the cell viability was detected by CCK-8 assay; B: the cells were treated with TAAE (0.25, 0.5, 1 and 2 g/L) and LPS (1 mg/L) for 24 h, and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs control group(without TAAE or LPS treatment).圖1 三百棒醇提物和脂多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

    2 TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

    如圖2 所示,control 組RAW264.7 細(xì)胞為圓形;LPS 處理誘導(dǎo)細(xì)胞分化,細(xì)胞長出觸角變?yōu)榧忓N形;與LPS 組相比,TAAE 干預(yù)抑制了細(xì)胞形態(tài)的變化,高劑量(1 g/L)TAAE組更明顯。

    Figure 2.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) on the morphological changes of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS) was observed by microscopy (×200).圖2 三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響

    3 TAAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化性的影響

    為研究TAAE 如何影響胎牛血清或LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的遷移和趨化性,進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。如圖3A 所示,血清誘導(dǎo)的細(xì)胞成功跨膜(遷移),但0.5 和1 g/L 的TAAE 顯著減少跨膜細(xì)胞數(shù)量,分別為control組的33%和50%(P<0.01)。同樣,LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞成功跨膜(趨化性),但0.5 和1 g/L的TAAE顯著減少跨膜細(xì)胞數(shù)量,分別為control組的30%和48%(P<0.01),見圖3B。

    Figure 3.Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) inhibited migration (A) and chemotaxis (B) of RAW264.7 cells treated with fetal bovine serum or lipopolysaccharide(LPS).The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group (without TAAE or LPS treatment).圖3 三百棒醇提物抑制胎牛血清或脂多糖處理的RAW264.7細(xì)胞遷移和趨化

    4 TAAE 對(duì)LPS 干預(yù)后RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6和NO含量的影響

    如圖4 所示,與control 組相比,LPS 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β 和NO 含量顯著升高,IL-10 含量顯著降低(P<0.01);與LPS 組相比,各劑量TAAE 均可顯著降低上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β和NO含量,升高IL-10含量(P<0.05)。

    Figure 4.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) on the levels of inflammatory cytokines and nitric oxide(NO) in culture supernatants RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS).A: IL-10; B: IL-1β; C: IL-6; D: TNF-α; E:NO.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.圖4 三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子及NO含量的影響

    5 TAAE 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞CD163+/CD68+比值的影響

    采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài),CD163+為紅色熒光,CD68+為綠色熒光。與control組比較,LPS 組CD163+/CD68+比值降低(P<0.01);與LPS 組比較,TAAE 組和TAK-24(TLR4 抑制劑)組CD163+/CD68+比值升高,見圖5。這表明LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1型極化為主,TAAE可以降低M1型巨噬細(xì)胞極化的比例,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化,且與TAK-242效果相當(dāng)。

    Figure 5.Effect of Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) on the phenotype transformation of RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS) was detected by fluorescence staining with double labeling (scale bar=50 μm).Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs LPS group.圖5 熒光染色雙標(biāo)檢測(cè)三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

    6 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 活化的影響

    與control組比較,LPS顯著誘導(dǎo)NF-κB從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位;與LPS 組比較,TAAE 組和TAK-24組NF-κB 的核轉(zhuǎn)移明顯受到抑制,見圖6。這表明TAAE 可以抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB核易位,且與TAK-242效果相當(dāng)。

    7 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白及TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與control 組比較,LPS 組細(xì)胞中iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平顯著升高,IκBα 蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.01);與LPS 組相比,各劑量TAAE 和TAK-24 均能降低LPS 誘導(dǎo)的iNOS、COX-2、p-NF-κB、TLR4 和p-IκBα 蛋白水平,升高IκBα(P<0.05),而總NF-κB 無變化,見圖7。這表明TAAE 能抑制炎癥相關(guān)蛋白表達(dá),抑制IκBα 蛋白的磷酸化降解,從而抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化。

    8 TAAE 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

    與control 組比較,LPS 組中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6,以及NF-κB、TLR4 的mRNA 水平顯著升高,抑炎因子IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平顯著降低(P<0.01);與LPS 組相比,各劑量TAAE 均能降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB和TLR4 的mRNA 水平,升高IL-10 和Arg-1 的mRNA 水平(P<0.05或P<0.01),見圖8。

    Figure 8.Effects of Toddalia asiatica alcohol extract (TAAE) on the mRNA levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, Arg-1, NF-κB and TLR4 in RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS) were determined by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.圖8 RT-qPCR 檢測(cè)三百棒醇提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1、NF-κB 和TLR4 mRNA水平的影響

    討 論

    RA 是一種以滑膜增生和關(guān)節(jié)組織進(jìn)行性破壞為特征的慢性疾病,其病理學(xué)變化主要涉及促炎細(xì)胞因子釋放,滑膜中持續(xù)炎癥細(xì)胞浸潤和軟骨中活化的巨噬細(xì)胞侵蝕[17]。RA 的起始原因尚未完全明了,但已證實(shí)巨噬細(xì)胞在RA 疾病過程中起關(guān)鍵作用,它們能夠協(xié)調(diào)免疫反應(yīng),釋放參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞因子和酶,進(jìn)而激活破骨細(xì)胞和成纖維滑膜細(xì)胞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和疾病延續(xù)[18]。RAW264.7 細(xì)胞被認(rèn)為是晚期分化階段的破骨前身細(xì)胞,因此較適合用于以炎癥和骨吸收為主的如RA 等關(guān)節(jié)疾病研究。在RA 炎癥刺激下它可以極化為促炎M1 表型,釋放大量促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等。因此,在RA 發(fā)作期間靶向巨噬細(xì)胞極化,將促炎M1 型巨噬細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為抗炎M2 表型,可能成為一種有效的治療方法[19]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種重要組成成分,能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng),是巨噬細(xì)胞強(qiáng)有力的活化劑[20]。LPS的刺激可誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞,M1 激活的生物標(biāo)志物包括TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2、NO、iNOS、CD68 等,炎癥因子的上調(diào)形成強(qiáng)烈的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)滑膜增生并增強(qiáng)RA 的組織病理學(xué)變化,從而導(dǎo)致RA 中的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞[21]。研究發(fā)現(xiàn)在RA 炎癥滑膜和血管翳處存在大量活化巨噬細(xì)胞,而活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)促炎因子、趨化因子、生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等多種效應(yīng)分子,參與炎癥的啟動(dòng)和維持,具有廣泛的促炎作用和組織破壞能力。因此調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡是RA治療的潛在策略[22]。

    本研究通過免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后,與control 組相比可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 表型標(biāo)志物iNOS 和CD68 的表達(dá),抑制M2 表型標(biāo)志物清道夫受體(CD163)的表達(dá),使CD163+/CD68+比值降低,說明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞以M1 型極化為主。然而,TAAE 治療使CD163+/CD68+比值升高,降低M1 型巨噬細(xì)胞極化的比例,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化,且效果與TAK-242 效果相當(dāng)。經(jīng)LPS 誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β 含量明顯增多,抑炎因子IL-10和Arg-1含量減少,上清液中NO 含量升高,細(xì)胞由正常的圓形變?yōu)榧忓N形;在給予TAAE 干預(yù)后,促炎細(xì)胞因子含量均有顯著下降,抑炎細(xì)胞因子含量上升,具有分化形狀的RAW264.7 細(xì)胞數(shù)量減少,同時(shí)TAAE 能抑制RAW264.7 細(xì)胞遷移和趨化,降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞iNOS、COX-2、TLR4、p-NF-κB 和p-IκBα 蛋白水平,降低TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB 和TLR4 mRNA 水平,升高IL-10 和Arg-1 mRNA 水平。這提示TAAE 對(duì)炎癥損傷具有一定的治療作用,可能是通過抑制RAW264.7 遷移和趨化,使其向抗炎M2型分化,從而發(fā)揮抗炎作用。

    三百棒是土家族常用的一種天然抗炎藥物,湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院以其為主要藥物研制的土家抗風(fēng)濕復(fù)方三百棒藥酒和金邊祛風(fēng)飲臨床用于治療類風(fēng)濕十余年,療效確切。本課題組前期研究表明,三百棒醇提物通過TLR4/NF-κB 信號(hào)通路降低炎癥反應(yīng),對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠有明顯的改善作用[6],還可通過抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),抑制滑膜細(xì)胞的增殖[14]。

    目前,許多調(diào)節(jié)機(jī)制參與了RA 的發(fā)病機(jī)制,其中包括TLR4/NF-κB“細(xì)胞炎癥”途徑。已有研究表明TLR4/NF-κB 通路在炎癥調(diào)節(jié)方面有重要作用[23],TLR4/NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)已被提出作為治療免疫介導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的潛在療法,TLR4/NF-κB 還參與M2 型巨噬細(xì)胞極化,其在限制LPS 刺激的巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[24]。NF-κB 由5 種重要蛋白質(zhì)形成,它們通過與其抑制蛋白IκB 結(jié)合,作為無活性的異二聚體復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中。P65是NF-κB 調(diào)節(jié)和功能最具代表性的蛋白質(zhì)。在被各種炎癥刺激(如LPS)激活后,IκB 激酶的激活會(huì)引發(fā)IκBα 的磷酸化和降解。NF-κB 磷酸化之后使NF-κB發(fā)生核易位,進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合并激活促炎基因的表達(dá),包括細(xì)胞因子、粘附分子和誘導(dǎo)性酶(如iNOS和COX-2)[25]。本研究證實(shí)了TLR4/NF-κB途徑在RAW264.7 細(xì)胞炎癥與極化中的關(guān)鍵作用,活化的RAW264.7 細(xì)胞中的細(xì)胞因子導(dǎo)致TLR4/NF-κB途徑的激活,促炎M1 細(xì)胞增多。TAAE 可抑制NFκB 的核易位抑制TLR4/NF-κB 途徑的激活,使M1 型細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化。另外,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抑制劑TAK-242阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子及炎癥相關(guān)蛋白含量減少,且TAAE 治療效果與其相當(dāng)。因此,這也表明TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了炎癥與細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)。目前,通過基因干預(yù)方法敲除或小分子藥物(TLR4 抑制劑TAK-242)抑制TLR4/NF-κB 通路,阻斷其對(duì)下游多種效應(yīng)分子的活化已經(jīng)成為RA 治療研究的新靶點(diǎn)[26]。本研究中,TAAE通過抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并抑制其遷移和趨化,調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡,其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。同時(shí),本研究為開發(fā)三百棒治療RA提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

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