• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同時點急性腎缺血再灌注損傷大鼠模型的構(gòu)建與評價*

    2023-11-02 10:14:28王光策王鎖剛
    中國病理生理雜志 2023年10期
    關鍵詞:超微結(jié)構(gòu)腎小管腎功能

    李 文, 李 偉, 程 豐, 王光策, 王鎖剛△

    (1河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046;2河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科,河南 鄭州 450003)

    腎缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是引起急性腎小管壞死(acute tubular necrosis,ATN)、急性排斥反應(acute rejection, AR)和急性腎衰竭等嚴重腎臟疾病的重要原因,已成為影響移植受者/腎長期存活的主要障礙,因此,腎IRI 受到廣泛關注[1-3]。然而,目前對于急性腎IRI 動物模型的構(gòu)建尚無明確統(tǒng)一的方法,對于更深入闡明急性腎IRI的發(fā)生機制,尤其是不同時點急性腎IRI引起腎組織病理損傷程度、細胞凋亡的情況和腎小管超細結(jié)構(gòu)的改變等存在阻礙。本研究通過SD 大鼠隨機分組,構(gòu)建不同缺血時間急性腎IRI模型,動態(tài)觀察大鼠腎功能相關指標、腎臟組織病理學、腎小管超微結(jié)構(gòu)改變及細胞凋亡水平的變化,評價大鼠不同時間點急性腎IRI 造模效果,評估并確立合適的大鼠急性腎IRI 模型,為探究大鼠急性腎IRI 的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 實驗動物

    SPF 級健康雄性SD 大鼠30 只,由鄭州市華興實驗動物養(yǎng)殖場[許可證號:SYXK(豫)2016-0002]提供,體重(200±20) g,6~8 周齡,于標準SPF 級動物實驗室飼養(yǎng),自由飲水,飼養(yǎng)于標準IVC 隔離式籠具中,溫度設定為20~25 ℃,相對濕度45%~70%,每天日光燈模擬照射12 h,保持良好的環(huán)境通風,提前一周進行各種適應性動物飼養(yǎng)。

    2 實驗分組

    將30 只雄性SD 大鼠采用隨機數(shù)字法[4]分為對照組(腎缺血0 min 組)和IRI 組(腎缺血5、15、30、45和60 min 組,均再灌注24 h),共6 組,每組5 只。實驗處理:(1)對照組:游離雙側(cè)腎蒂,但不夾閉;(2)IRI 組:游離雙側(cè)腎蒂,根據(jù)不同分組采用無創(chuàng)動脈夾夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂5、15、30、45 和60 min 后取下,恢復血流,觀察腎臟顏色變化;逐層縫合背部傷口,各組大鼠腎臟再灌注時間均為24 h。

    3 大鼠腎IRI模型的構(gòu)建

    根據(jù)課題組前期研究[5-6],應用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg 腹腔注射)麻醉;麻醉后,采取經(jīng)背部入路夾閉雙側(cè)腎蒂方式建立SD 大鼠腎IRI 模型,手術過程如下:將大鼠固定在操作臺,呈俯臥位,用剃毛刀脫毛備皮,碘伏、酒精消毒后鋪巾,從背部脊柱正中位置切開皮膚,切口長約2~3 cm,于背部雙側(cè)肋弓下緣0.5 cm 位置處(雙側(cè)距脊柱中線約0.5~1.0 cm)鈍性分離至肌肉薄弱部位時分別切開一個縱行切口,從腹膜后間隙見腎周脂肪組織,用無菌棉簽小心地鈍性分離腎周脂肪,可見腎蒂及腎臟組織,檢查確認腎動靜脈位置及走形情況后,充分暴露腎蒂;對照組僅游離雙側(cè)腎蒂,但不夾閉腎蒂;IRI 組用無創(chuàng)動脈夾同時夾閉雙側(cè)腎蒂(雙側(cè)夾閉時間差不超過1 min),觀察腎蒂顏色變化,根據(jù)不同分組控制缺血時間(5、15、30、45 和60 min),同時取下雙側(cè)無創(chuàng)血管夾,恢復腎臟血流灌注,肉眼觀察腎臟顏色變化(由紫黑色逐漸變?yōu)榘导t色),提示腎臟血流再灌注良好,手術完畢,向腹腔內(nèi)注射生理鹽水補充體液,然后逐層縫合切口。大鼠腎臟血流再灌注24 h 后取材,進行相關檢測,評估急性腎IRI 模型大鼠腎臟損傷情況。

    4 取材

    30 只大鼠腎缺血再灌注24 h,麻醉成功后,于腹部入路分離腹主動脈和腎臟[7],腹主動脈取血液標本2~3 mL,常溫靜置2 h 于高速離心機1 006.2×g離心10 min 后,移取上層血清儲存于-80 ℃冰箱,待用于檢測腎功能;將切取的大鼠雙側(cè)腎臟分別對半于2.5%戊二醛、4%多聚甲醛固定,留做病理檢測。

    5 主要方法

    5.1 腎功能相關指標測定 恢復血供后24 h 后腹主動脈取血,通過靜置、離心、留取血清后置于低溫冰箱-80 ℃層保存。應用全自動生化檢測儀,測定血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, SCr)和胱抑素C(cystatin C, Cys C)。

    5.2 腎臟組織病理學觀察 將腎組織分批固定于4%多聚甲醛固定液中1~2 d,經(jīng)過脫水(乙醇)、透明(二甲苯)、包埋(石蠟),用切片機切片(6~8 μm),然后再經(jīng)過脫蠟、水化、脫汞后,進行糖原染色(PAS 染色);在光學顯微鏡(200倍)下觀察腎臟切片,并隨機選擇10 個有病變的視野按照Paller 半定量病理評估法標準對腎小管損傷進行病理評分[8-10]。

    5.3 腎小管上皮超微結(jié)構(gòu)觀察 將腎臟分批固定至2.5%戊二醛固定液(4 ℃)48 h,后4 ℃冰箱保存;進行脫水、包埋等程序性處理,后用超薄切片機進行切片,切片厚度約50 nm。再經(jīng)染色、復染后,于透射電鏡(HT7800 HITACHI)下(9 900 倍)觀察腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微絨毛、細胞器及細胞核等)。每組隨機選取1 張切片,選取20 個細胞,進行記錄,計算病變指數(shù)(異常細胞數(shù)÷正常細胞數(shù)×100%)。

    5.4 TUNEL 法檢測大鼠腎小管上皮細胞凋亡 選取合適的大鼠腎組織石蠟標本切片,進行脫蠟復水處理,將蛋白酶K 工作液覆蓋標本,在室溫黑暗環(huán)境下孵育20 min,用PBS 潤洗;再用甲基綠復染,染色30 s 后洗凈,再經(jīng)歷脫水、透明、封片等程序性步驟;在將切片置于光學顯微鏡下觀察,采集圖像。用熒光劑標記顯色,于400 倍光學顯微鏡下觀察見凋亡細胞顯棕色。每張切片至少有代表性的20 個視野,進行記錄,計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)÷視野下總細胞數(shù)×100%。

    6 統(tǒng)計學處理

    計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),多組實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 急性腎IRI模型大鼠腎臟大體形態(tài)變化

    SD大鼠經(jīng)麻醉、消毒鋪巾后,經(jīng)背部入路進入后腹膜分離出腎臟,腎臟呈扁豆狀,腎包膜張力尚可,色紅,鈍性分離雙側(cè)腎蒂,夾閉后肉眼下見腎臟顏色由鮮紅、暗紅、黑紫逐步變化。IRI組不同組間比較,大鼠腎臟缺血時間越長,腎臟顏色變化越顯著(從鮮紅、暗紅到暗紫),質(zhì)軟,張力減小。開放血流后腎臟表面顏色逐漸恢復鮮紅,質(zhì)韌,但腎缺血60 min 組再灌注后顏色改變較緩慢,甚至取材時仍為暗紅色。

    2 不同時點急性腎IRI模型大鼠腎功能的變化

    腎IRI 大鼠再灌注24 h 后,采血行腎功能檢測,結(jié)果顯示腎IRI 組腎功能相關指標(SCr、BUN 和Cys C)均高于對照組,IRI 組與對照組相比較,腎缺血5 min 組大鼠的SCr 和BUN 無顯著差異(P>0.05),而Cys C 有顯著差異(P<0.05);而其余四組(缺血15、30、45 和60 min 組)腎功能相關指標(SCr、BUN 和Cys C)均有顯著差異(P<0.01);且IRI組組間對比顯示腎缺血時間越長,腎功能相關指標(SCr、BUN 和Cys C)均顯著升高(P<0.05),見表1。

    表1 不同時點各組相關指標變化Table 1.Changes of related indexes in acute renal IRI rats at different time points (Mean±SD.n=5)

    3 不同時點急性腎IRI大鼠腎組織病理學變化

    光學顯微鏡下觀察腎組織染色切片,除對照組外,IRI 組均有程度各異的腎小管擴張伴腔內(nèi)壞死,上皮細胞水腫脫落;腎缺血≤30 min(缺血5、15 和30 min組)時,腎臟總體損傷程度較輕;腎缺血時間控制在45 min 時,相對≤30 min,腎小管上皮細胞明顯腫脹,小管擴張明顯,但壞死程度較輕;而腎缺血時間控制在60 min 時,腎臟則出現(xiàn)腎小管上皮細胞腫脹,胞漿淡染,可見空泡,甚至不同程度的壞死(圖1)。Paller 半定量病理評分結(jié)果顯示,與對照組相比,IRI組除了缺血5 min組無顯著差異(P>0.05),其余四組(缺血15、30、45 和60 min 組)均有顯著差異(P<0.05),見表1。

    Figure 1.Renal histopathological changes in rats with renal IRI at different time points(scale bar=20 μm).A: ischemia for 0 min;B, C and D: ischemia for 5, 15 and 30 min,respectively [the overall degree of renal injury was mild (black arrows)]; E:ischemia for 45 min [renal tubule epithelial cells were markedly swollen, and tubules were dilated (green arrows) but less necrotic]; F: ischemia for 60 min [renal tubule epithelial cells swelling, cytoplasmic staining, vacuoles, necrosis, and degeneration of renal tubular epithelial cells with pyknosis or disappearance of nuclei were seen in some areas (red arrows)].圖1 不同時點腎IRI大鼠腎組織病理

    4 不同時點急性腎IRI 大鼠腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

    在透射電鏡下觀察各組大鼠腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu),對照組腎小管細胞核呈卵圓形,結(jié)構(gòu)正常,膜表面微絨毛密集而規(guī)則排列,核糖體無脫落,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見擴張;腎缺血≤30 min(對照組、缺血5 min 組、缺血15 min 組和缺血30 min 組)時,腎小管上皮細胞損傷相對較輕;腎缺血時間控制在45 min 時,腎小管上皮細胞損傷加重,細胞膜表面微絨毛脫落,大量線粒體腫脹及嵴變短、變少,以及大多數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、離斷;而腎缺血時間控制在60 min 時,腎小管上皮細胞損傷越加嚴重,腎小管上皮細胞腔面刷狀緣壞死脫落,部分細胞核發(fā)生變性、濃縮、壞死,線粒體水腫、嵴斷裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹、離斷(圖2)。腎小管細胞超微結(jié)構(gòu)的病變指數(shù)與前述腎臟病理形態(tài)學變化一致,與對照組相比,IRI 組除了腎缺血5 min 組無顯著差異(P>0.05);其余四組(缺血15、30、45 和60 min組)均有顯著差異(P<0.01),見表1。

    Figure 2.Ultrastructural changes of renal tubular epithelial cells in acute renal IRI rats at different time points (scale bar=1 μm).A:ischemia for 0 min (the nuclei of renal tubules were oval with normal structure, the microvilli on the membrane surface were dense and regularly arranged, the ribosomes were not shed, and the endoplasmic reticulum was not dilated); B, C and D: ischemia for 5, 15 and 30 min,respectively (the damage to renal tubular epithelial cells was relatively mild, and mild dilatation of the endoplasmic reticulum could be seen in some areas); E: ischemia for 45 min (the damage to renal tubule epithelial cells was aggregated, microvilli on the cell membrane surface were detached, a large number of mitochondria were swollen, cristae were shorted and reduced, and most of the endoplasmic reticulum was swollen and detached);F: ischemia for 60 min (the damage to renal tubule epithelial cells became increasingly serious, the brush border on the lumen surface of renal tubule epithelial cells was necrotic and exfoliated, some nuclei were degenerated, condensed and necrotic).The endoplasmic reticulum was dilated as shown by black arrows, and mitochondrial damage was accompanied by broken or absent mitochondrial cristae as shown by red arrow.圖2 不同時點急性腎IRI大鼠腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)病變

    5 不同時點腎IRI 模型大鼠腎小管上皮細胞凋亡情況

    腎臟組織TUNEL 染色結(jié)果見圖3。IRI 組腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)與對照組相比,均有顯著差異(P<0.05),并在一定的時間范圍內(nèi)腎缺血時間越長,腎小管上皮凋亡水平越高,見表1。

    Figure 3.Apoptosis of renal tubular epithelial cells in acute renal IRI rats at different time points (TUNEL staining, scale bar=50μm).A: ischemia for 0 min; B: ischemia for 5 min; C: ischemia for 15 min; D: ischemia for 30 min; E: ischemia for 45 min; F: ischemia for 60 min.The apoptotic cells were brownish yellow (red arrows), and the TUNEL positive staining was mainly in the renal tubular epithelial cells.The level of apoptosis was relatively low in A, B, C and D, while the number of apoptotic cells increased significantly in E.The most apoptotic cells were shown in F.圖3 不同時點急性腎IRI大鼠腎小管上皮細胞凋亡

    討 論

    急性IRI 是腎臟外科手術和腎移植中的常見問題,通常造成急性腎功能損害,被認為是ARF與DGF的主要發(fā)病基礎。合適的腎IRI 大鼠模型構(gòu)建是研究急性IRI 發(fā)生機制和防治的前提和基礎。研究不同時間點腎IRI模型大鼠的腎功能狀態(tài)、發(fā)生過程及腎損傷程度,有利于進一步評估預防機體有創(chuàng)性操作或術后腎損傷和保護腎功能狀態(tài)。

    腎缺血后重新獲得血流灌注發(fā)生急性腎IRI,對腎臟造成二次打擊。腎IRI 完整的發(fā)生機制尚不明確,目前已經(jīng)證實其機制和炎癥反應、細胞凋亡、細胞自噬、細胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基損傷、微血管功能障礙有關,且涉及NO 含量變化、免疫損傷、信號通路等多種復雜因素,從而引起腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、功能代謝異常等病變[11-14]。構(gòu)建合適的急性腎IRI 模型是研究急性腎IRI 發(fā)病機制和防治策略的重要保障[15]。目前急性腎IRI 大鼠模型主要通過經(jīng)腹部或背部入路、單側(cè)腎動脈夾閉夾閉并切除對側(cè)腎臟、單側(cè)或雙側(cè)腎動脈和腎靜脈夾閉等方式進行構(gòu)建[16-17];腎缺血時間通??刂圃?0~60 min,當腎缺血時間過短(少于30 min)時,腎臟能夠迅速通過代償恢復其功能,而當腎缺血時間過長(超過60 min)則會導致ATN 和ARF 的發(fā)生[18]。然而,關于不同時間點急性腎IRI 引起腎功能異常、腎組織病理損傷、腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)變化和細胞凋亡等病理生理過程的研究較少。

    腎急性IRI 動物模型的構(gòu)建主要是通過手術利用無創(chuàng)微血管鉗誘發(fā),但是其實驗結(jié)果高度依賴于缺血時間點的設定、細胞外液耗損、溫度控制和術后鎮(zhèn)痛藥的使用[19]。手術的入徑可以選擇動物的腹側(cè)(剖腹)或背側(cè)(腹膜后)進行,本研究參考有關文獻[20-21],對大鼠腎IRI 模型進行改良,采用經(jīng)背側(cè)后腹膜入徑來構(gòu)建急性腎IRI 模型,與前對比,優(yōu)點明顯;首先結(jié)合大鼠匍匐爬行的生活習性,經(jīng)腹部入徑造模的大鼠在蘇醒后傷口感染風險大大增加,影響大鼠體內(nèi)的炎癥與氧化應激狀態(tài);其次經(jīng)背側(cè)后腹膜入徑,不用翻動腸管,大大減小了腸梗阻、腸黏連的發(fā)生率,較好的保護了胃腸道功能[5];而且腹側(cè)入徑IRI顯示,由于延遲恢復,減少了口服液體攝入量,BUN 水平將受到影響,但SCr 水平受水合狀態(tài)的影響較小[22]。雖然對造模方式進行了改良,但本研究仍存在一些不足之處:如研究采用的夾閉雙側(cè)腎蒂的方法與多數(shù)CKD 病人單側(cè)腎移植的狀態(tài)有所不同;而腎蒂中有腎動、靜脈、腎盂、淋巴管和神經(jīng)等結(jié)構(gòu),直接夾閉腎蒂,腎靜脈、淋巴管和神經(jīng)等造成的影響未納入考慮;以及簡單的夾閉腎蒂造成的大鼠免疫狀態(tài)的改變對實驗結(jié)果的影響沒有進行分析。

    值得注意的是,對于再灌注時間的設定,在參考大量國內(nèi)外研究后,在課題組進行的預實驗過程中,我們將再灌注時間設定為24 h 和72 h 進行對照,結(jié)果顯示,進行急性腎缺血再灌注模型的構(gòu)建后,再灌注24 h時,大鼠腎臟損傷組間差異較為顯著;再灌注72 h 后,各組大鼠的腎功能趨于恢復正常。本研究主要觀察不同缺血時點對構(gòu)建急性大鼠腎缺血再灌注模型的影響,故選取控制再灌注時間為24 h。并且后續(xù)將進一步展開研究再灌注不同時間點腎臟損傷的比較。

    實驗設定了大鼠不同的腎缺血時間,評估急性腎IRI 大鼠的腎功能、病理形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)的改變。IRI 組大鼠腎功能指標均明顯升高,腎小管上皮結(jié)構(gòu)損傷更嚴重,且腎臟缺血時間越長,腎功能損害程度和腎小管上皮結(jié)構(gòu)損傷程度越嚴重,而腎臟缺血時間控制在60 min 時大鼠腎功能減退腎小管上皮結(jié)構(gòu)損傷最嚴重。

    本研究顯示,腎缺血在30 min 范圍內(nèi),大鼠腎小管上皮細胞凋亡率相對較低;腎缺血時間超過45 min,凋亡率顯著升高;腎缺血60 min 時,凋亡率最高。上述結(jié)果提示,隨著腎臟缺血時間延長,腎IRI大鼠的腎小管上皮細胞凋亡率也逐漸上升。

    綜合評估不同時間點腎IRI 大鼠模型的實驗研究,揭示了不同的腎缺血時間對大鼠腎功能、腎組織病理形態(tài)學、腎小管上皮細胞超微結(jié)構(gòu)及細胞凋亡水平的影響程度不同。對于缺血時間的控制,研究表明缺血時間超過60 min 可導致急性腎小管壞死和腎功能衰竭,而缺血時間小于30 min 可導致腎小管快速增殖小管上皮細胞可能恢復小管損傷[23];實驗結(jié)果證實了腎缺血45 min 再灌注24 h 為經(jīng)典的大鼠急性IRI模型。驗證了腎IRI是一個多因素參與的復雜的病理生理過程,為探究腎IRI 的多靶點、多途徑保護措施奠定了較為可靠的實驗基礎。

    猜你喜歡
    超微結(jié)構(gòu)腎小管腎功能
    白藜蘆醇對金黃色葡萄球菌標準株抑菌作用及超微結(jié)構(gòu)的影響
    急診輸尿管鏡解除梗阻治療急性腎功能衰竭
    慢性腎功能不全心電圖分析
    電擊死大鼠心臟超微結(jié)構(gòu)及HSP70、HIF-1α表達變化
    依帕司他對早期糖尿病腎病腎小管功能的影響初探
    IgA腎病患者血清胱抑素C對早期腎小管間質(zhì)損害的預測作用
    細胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過程中的作用
    不同波長Q開關激光治療太田痣療效分析及超微結(jié)構(gòu)觀察
    同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關性分析
    iPS細胞治腎功能不全
    av天堂在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲av不卡在线观看| 色吧在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 香蕉av资源在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产三级中文精品| 99热精品在线国产| 禁无遮挡网站| 久久中文看片网| 999久久久精品免费观看国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久精品国产自在天天线| 色5月婷婷丁香| 欧美3d第一页| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成年女人看的毛片在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲精品久久久com| 久久久成人免费电影| 欧美+日韩+精品| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲精华国产精华精| 美女黄网站色视频| 国产av在哪里看| 757午夜福利合集在线观看| x7x7x7水蜜桃| 天天躁日日操中文字幕| 天堂√8在线中文| 村上凉子中文字幕在线| 精品福利观看| 99热精品在线国产| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美在线一区亚洲| 亚洲片人在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 男女那种视频在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 欧美日韩福利视频一区二区| or卡值多少钱| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美精品啪啪一区二区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av女优亚洲男人天堂| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品一及| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜日韩欧美国产| 直男gayav资源| 国产精华一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲欧美98| 啪啪无遮挡十八禁网站| 免费av毛片视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美精品国产亚洲| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产乱人视频| 12—13女人毛片做爰片一| 在线a可以看的网站| 可以在线观看毛片的网站| 人妻久久中文字幕网| 久久久色成人| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲乱码一区二区免费版| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩国内少妇激情av| 九色国产91popny在线| 国产成人欧美在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 88av欧美| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲中文字幕日韩| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品永久免费网站| 欧美3d第一页| av女优亚洲男人天堂| 亚洲五月天丁香| 99国产综合亚洲精品| 变态另类丝袜制服| 亚洲美女视频黄频| 国产av在哪里看| 国产视频一区二区在线看| av国产免费在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产美女午夜福利| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲人成网站高清观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产麻豆成人av免费视频| 69av精品久久久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产免费av片在线观看野外av| 日本与韩国留学比较| 一区二区三区激情视频| 国产精品亚洲美女久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产精品久久视频播放| 露出奶头的视频| 在线免费观看的www视频| 婷婷色综合大香蕉| 久久国产乱子免费精品| 三级国产精品欧美在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 丁香六月欧美| 直男gayav资源| 欧美黄色淫秽网站| 51国产日韩欧美| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 精品人妻1区二区| 亚洲精品在线美女| 黄色一级大片看看| 91九色精品人成在线观看| 免费在线观看日本一区| 精品久久久久久成人av| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 深夜精品福利| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 免费看a级黄色片| 午夜福利高清视频| 国产精品久久久久久久电影| 国产伦一二天堂av在线观看| 看片在线看免费视频| 亚洲午夜理论影院| 赤兔流量卡办理| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲午夜理论影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品人妻久久久久久| 国产伦在线观看视频一区| 一个人看视频在线观看www免费| 日本熟妇午夜| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久久久久久成人| 日本熟妇午夜| 亚洲经典国产精华液单 | 亚洲av.av天堂| 免费电影在线观看免费观看| 国产成年人精品一区二区| 欧美在线一区亚洲| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日韩高清综合在线| a在线观看视频网站| 美女cb高潮喷水在线观看| a在线观看视频网站| 成人无遮挡网站| 久久午夜亚洲精品久久| 久99久视频精品免费| 午夜激情福利司机影院| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲人与动物交配视频| 麻豆成人午夜福利视频| 51国产日韩欧美| 99久久精品国产亚洲精品| 热99re8久久精品国产| 99热6这里只有精品| 国产成人av教育| 亚洲国产色片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 麻豆国产av国片精品| 一本一本综合久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久九九热精品免费| 亚洲最大成人手机在线| 久久久国产成人免费| 51国产日韩欧美| 无人区码免费观看不卡| 在现免费观看毛片| 最近在线观看免费完整版| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲内射少妇av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 最近中文字幕高清免费大全6 | 成年女人看的毛片在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| av在线蜜桃| 男人舔奶头视频| av中文乱码字幕在线| 一a级毛片在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费av毛片视频| 亚洲18禁久久av| 国产一区二区激情短视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日韩乱码在线| 观看美女的网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 90打野战视频偷拍视频| 18禁在线播放成人免费| 精品久久久久久久久av| 亚州av有码| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久99热这里只有精品18| 宅男免费午夜| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品三级大全| 宅男免费午夜| 久久久成人免费电影| 88av欧美| 一个人免费在线观看的高清视频| а√天堂www在线а√下载| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 51国产日韩欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| bbb黄色大片| 婷婷丁香在线五月| 国产av一区在线观看免费| 国产色爽女视频免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 成人三级黄色视频| 午夜a级毛片| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 九色成人免费人妻av| 国产精品女同一区二区软件 | 国产免费av片在线观看野外av| 在线免费观看的www视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 露出奶头的视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精华一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 国产中年淑女户外野战色| 校园春色视频在线观看| 观看免费一级毛片| a级一级毛片免费在线观看| 一本综合久久免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 黄色一级大片看看| a级一级毛片免费在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| netflix在线观看网站| 国产av麻豆久久久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 超碰av人人做人人爽久久| or卡值多少钱| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美三级三区| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品影院久久| 99国产极品粉嫩在线观看| www日本黄色视频网| 88av欧美| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久九九热精品免费| aaaaa片日本免费| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产视频一区二区在线看| 精品人妻视频免费看| 哪里可以看免费的av片| 久久6这里有精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 又爽又黄a免费视频| 成人精品一区二区免费| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色日韩在线| 深夜a级毛片| 久久久久久久午夜电影| 男女视频在线观看网站免费| 午夜激情福利司机影院| 精品久久久久久久久久久久久| 看黄色毛片网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 美女黄网站色视频| 午夜精品在线福利| 窝窝影院91人妻| 国产精品99久久久久久久久| 少妇高潮的动态图| 男人舔奶头视频| 在线免费观看的www视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99riav亚洲国产免费| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 99热精品在线国产| 黄色一级大片看看| 91久久精品电影网| 精华霜和精华液先用哪个| 五月玫瑰六月丁香| 日韩av在线大香蕉| 在线免费观看不下载黄p国产 | 天美传媒精品一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 人妻久久中文字幕网| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线观看66精品国产| 精品久久久久久,| 欧美性猛交黑人性爽| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜激情福利司机影院| 日本一本二区三区精品| 亚洲av五月六月丁香网| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品一及| 制服丝袜大香蕉在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 色播亚洲综合网| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 黄色配什么色好看| 国产男靠女视频免费网站| www.999成人在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 色视频www国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日韩黄片免| 亚洲综合色惰| 国产成人影院久久av| 色尼玛亚洲综合影院| 一个人看的www免费观看视频| 午夜a级毛片| 毛片一级片免费看久久久久 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费在线观看亚洲国产| 人人妻人人看人人澡| 成人毛片a级毛片在线播放| 波多野结衣高清作品| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲三级黄色毛片| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 性色avwww在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产毛片a区久久久久| 丁香欧美五月| 久久久久久久精品吃奶| 国产成人啪精品午夜网站| 天天一区二区日本电影三级| 久久精品国产自在天天线| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品永久免费网站| av天堂中文字幕网| 成人三级黄色视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 特大巨黑吊av在线直播| 国产乱人伦免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 最近最新免费中文字幕在线| 国产在视频线在精品| 熟女电影av网| www.999成人在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩欧美国产一区二区入口| 超碰av人人做人人爽久久| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 高清日韩中文字幕在线| 免费搜索国产男女视频| 直男gayav资源| 一区二区三区激情视频| 久久人人爽人人爽人人片va | 亚洲天堂国产精品一区在线| 999久久久精品免费观看国产| 欧美一区二区国产精品久久精品| 1024手机看黄色片| 中文字幕久久专区| 永久网站在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产亚洲精品久久久com| 中文字幕久久专区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜福利免费观看在线| 在线看三级毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 午夜a级毛片| 欧美成人a在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲第一区二区三区不卡| 长腿黑丝高跟| 亚洲成人久久爱视频| 一本综合久久免费| 美女免费视频网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产久久久一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 欧美潮喷喷水| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 免费看日本二区| 日韩精品中文字幕看吧| 久久亚洲精品不卡| 久久久久国内视频| 脱女人内裤的视频| 91久久精品电影网| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲自拍偷在线| 偷拍熟女少妇极品色| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成人久久爱视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜a级毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 99riav亚洲国产免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 村上凉子中文字幕在线| 嫩草影院入口| 国内精品久久久久精免费| 波多野结衣高清无吗| 亚洲七黄色美女视频| 一本精品99久久精品77| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 成年女人看的毛片在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲精品456在线播放app | 午夜日韩欧美国产| 欧美bdsm另类| 日韩欧美精品免费久久 | 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久久久久中文| 亚洲片人在线观看| 1024手机看黄色片| 国产精品99久久久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲国产色片| 欧美+日韩+精品| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产免费男女视频| 亚洲av.av天堂| 亚洲人成伊人成综合网2020| h日本视频在线播放| 亚洲无线在线观看| 国产久久久一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 国产色爽女视频免费观看| 久久精品人妻少妇| 老鸭窝网址在线观看| 丁香六月欧美| 午夜福利在线在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产三级中文精品| 一级毛片久久久久久久久女| 久久人妻av系列| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久色成人| 91九色精品人成在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲成a人片在线一区二区| 成年版毛片免费区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久99热6这里只有精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品免费一区二区三区在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产黄片美女视频| 国产精品,欧美在线| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一级黄片播放器| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲国产欧美人成| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 午夜免费成人在线视频| 国产精华一区二区三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 精品久久国产蜜桃| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品1区2区在线观看.| 我要看日韩黄色一级片| 午夜久久久久精精品| 美女大奶头视频| 一级作爱视频免费观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费观看人在逋| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久成人免费电影| 国产日本99.免费观看| 国产精品久久久久久久电影| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩欧美精品免费久久 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品久久电影中文字幕| 日本五十路高清| 真人一进一出gif抽搐免费| 看十八女毛片水多多多| 听说在线观看完整版免费高清| 成人美女网站在线观看视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本 欧美在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费高清视频大片| 精品久久久久久久久久久久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 日韩高清综合在线| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人中文字幕在线播放| x7x7x7水蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品亚洲美女久久久| 波多野结衣高清作品| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲国产精品sss在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产一区二区三区视频了| 国模一区二区三区四区视频| 欧美精品国产亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久午夜亚洲精品久久| 在线天堂最新版资源| 久久久久久久精品吃奶| 一个人看视频在线观看www免费| 深爱激情五月婷婷| 亚洲成av人片在线播放无| 深夜精品福利| 午夜久久久久精精品| 久久久成人免费电影| 如何舔出高潮| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产视频内射| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品一区二区三区人妻视频| 男人的好看免费观看在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| 久久亚洲真实| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 搡老岳熟女国产| 国产亚洲欧美98| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久午夜福利片| 又紧又爽又黄一区二区| 一区二区三区免费毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av熟女| 亚洲最大成人中文| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品精品国产色婷婷| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av电影在线进入| 麻豆一二三区av精品| 国产成人福利小说| 一本精品99久久精品77| 成人三级黄色视频| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美成人免费av一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费高清视频大片| 亚洲人成网站在线播| 在线观看av片永久免费下载| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 美女高潮的动态| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲久久久久久中文字幕| 在线观看一区二区三区| 又爽又黄无遮挡网站| 精品久久久久久久久亚洲 | 色视频www国产| 日韩中字成人| 黄色丝袜av网址大全| 国产成年人精品一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲av成人精品一区久久| 变态另类丝袜制服| 亚洲成av人片在线播放无| 天美传媒精品一区二区|