代茶冬青不同季節(jié)葉片營(yíng)養(yǎng)成分分析

鄒 薛,扈嘉鑫,袁虎威,章建紅,鄭炳松,閆道良*

1浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 311300;2寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,寧波 315040

代茶冬青(Ilexvomitoria)隸屬于冬青科冬青屬,是一種富含咖啡因和抗氧化成分的常綠灌木,其原產(chǎn)于美國(guó)東南部,其葉和嫩枝傳統(tǒng)上用來制作健康飲料[1,2]?？Х纫蚴遣璧蕊嬃现参镏泻械幕钚晕镔|(zhì),尋找新的富含咖啡因植物資源,以代替茶等常規(guī)飲料植物,是保護(hù)和減輕原料植物壓力的重要途徑。代茶冬青因具有獨(dú)特的活性物質(zhì)咖啡因,近年來成為“茶”替代品的明星之物,具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益,開發(fā)和利用前景廣闊。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)代茶冬青的研究多集中于葉片化學(xué)成分方面[3,4],對(duì)其年生長(zhǎng)周期營(yíng)養(yǎng)成分含量及其變化鮮有報(bào)道。因此,本文以不同季節(jié)代茶冬青新鮮葉片為研究對(duì)象,采用冷凍干燥法,對(duì)其礦質(zhì)元素和主要有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定和分析評(píng)價(jià),以期為代茶冬青的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

凱式定氮儀(KND04A,上海昕瑞儀器儀表有限公司);石墨消解儀(HCA-100,上海葉拓科技有限公司);分光光度計(jì)(UV-1600,蘇州賽力威儀器有限公司);電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Elan DRC-e,賽默飛世爾科技有限公司);千分之一天平(JE1002,上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司);脂肪測(cè)定儀(SZF-06A,上海秋佐科技有限公司);高效液相色譜儀(Agilent 1100,賽默飛世爾科技有限公司);酶標(biāo)儀(800TS-SN,安捷倫科技(中國(guó))有限公司);色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Amethyst C18-H,Sepax);濃硫酸、過氧化氫、高氯酸、鹽酸、濃硝酸(化學(xué)純,揚(yáng)州華富化工有限公司);蒽酮、無水葡萄糖、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、5 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、乙醇、磷酸、正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液、17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);石油醚、乙腈、苯酚、冰醋酸、維生素C、無水乙酸鈉(化學(xué)純,上海泰坦化學(xué)有限公司)。

1.2 植物材料

選取經(jīng)分類專家鑒定、健壯生長(zhǎng)的6年生代茶冬青植株。栽植地位于浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)茶園,土質(zhì)為疏松的有機(jī)黃壤,海拔96 m。以代茶冬青植株當(dāng)年生枝條上的葉為材料,分別采摘春季(4月)嫩葉、夏季(7月)成熟葉和秋季(10月)老葉,置于低溫盒中,并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)低溫冷凍干燥、粉碎后用于檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測(cè)定方法

代茶冬青葉片營(yíng)養(yǎng)元素的測(cè)定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。礦質(zhì)元素中氮含量的測(cè)定采用凱式定氮法,磷含量的測(cè)定采用鉬銻抗比色法,鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、銅含量的測(cè)定參照GB/T 5009.268-2016《食品中多元素的測(cè)定》;可溶性糖的測(cè)定采用蒽酮比色法[5];可溶性蛋白的測(cè)定參照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》;粗脂肪的測(cè)定參照GB/T 5009.6-2016《食品中粗脂肪的測(cè)定》;維生素C的測(cè)定參照GB/T 5009.86-2016《食品中抗壞血酸的測(cè)定》。

氨基酸的測(cè)定采用高效液相色譜法:稱取約1.0 g樣本,加入25 mL0.1%苯酚和5 mol/L鹽酸,進(jìn)行研磨,烘干之后,加入2 mL 0.1 mol/L鹽酸水溶液,過濾膜待衍生,再分別將100 μL上述待衍生的清液和100 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于2 mLEP管中;向每個(gè)離心管中依次加入20 μL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液、100 μL(確保pH>7)三乙胺乙腈溶液、100 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液,混勻后在25 ℃環(huán)境下放置1 h,分別往每個(gè)離心管里面加入1 mL正己烷,混合均勻后放置10 min。取稀釋5倍的下層溶液經(jīng)過濾后上機(jī)檢測(cè);色譜儀:Agilent 1100高效液相色譜儀,紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm,色譜柱:賽分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫:40 ℃,流速:1 mL/min,進(jìn)樣體積:10 μL,流動(dòng)相A:由6.6 g無水乙酸鈉、950 mL蒸餾水、70 mL冰醋酸、70 mL乙腈組成的混合溶液,流動(dòng)相B:80%乙腈水溶液。按下列洗脫梯度洗脫:0～2 min,100%A;2～15 min,100%A→90%A;15～25 min,90%A→70%A;25～33 min,70%A→55%A;33～38 min:55%A→0%A;35～45 min:0%A→100%A。氨基酸計(jì)算方法為各種氨基酸濃度(μg/mL)=F1/F2×C,其中F1為樣本溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積,F2為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液中各氨基酸峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積,C為混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品中各氨基酸濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

1.4.1 適用性檢驗(yàn)

采用相關(guān)系數(shù)矩陣直觀檢驗(yàn),計(jì)算氨基酸之間的Pearson相關(guān)系數(shù),依據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣中相關(guān)系數(shù)的大小得出原始變量之間的線性關(guān)系,以此來進(jìn)行適用性檢驗(yàn)[6]。

1.4.2 主成分分析法

主成分分析,是考察多個(gè)變量之間相關(guān)性的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法,也就是從原始變量中選取少數(shù)幾個(gè)變量盡最大可能保留原始變量的相關(guān)信息[7-10]。本試驗(yàn)采用主成分分析法研究代茶冬青葉片中氨基酸的種類與含量,為代茶冬青葉片的開發(fā)利用及加工提供理論依據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 代茶冬青葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素變化

對(duì)春、夏、秋3個(gè)季節(jié)的葉片主要元素含量測(cè)定與分析表明(見表1),常量元素氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鎂(Mg)、鈣(Ca)和硫(S)含量變化范圍分別為11.892～17.002、0.716～1.886、12.513～14.009、1.753～2.943、3.736～5.466和0.753～1.400 g/kg;微量元素中鐵(Fe)、錳(Mn)、鋅(Zn)和銅(Cu)含量變化范圍分別為66.823～81.090、693.243～1512.076、181.996～276.173和11.270～12.210 mg/kg。

表1 代茶冬青不同季節(jié)葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量

代茶冬青葉片礦質(zhì)元素含量在不同季節(jié)采摘總體表現(xiàn)為春季最高,秋季最低。春季葉片中N、P、Fe、Mn顯著高于夏季與秋季(P< 0.05),其中N含量高達(dá)17.002 g/kg。夏季的S含量顯著高于春季和秋季;秋季的Ca含量顯著高于春季和夏季;春季和秋季K、Mg、Zn、Cu含量差異不顯著;春、夏、秋三個(gè)季節(jié)K、Cu含量差異不顯著。綜上結(jié)果表明,春季采摘的嫩葉具有較為豐富的礦質(zhì)元素。

2.2 代茶冬青葉片主要營(yíng)養(yǎng)成分變化

對(duì)春、夏、秋3季的代茶冬青葉片可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和維生素C的含量測(cè)定與分析表明,不同采摘季節(jié)葉片的營(yíng)養(yǎng)成分差異顯著(見表2)。可溶性糖、可溶性蛋白、粗脂肪和維生素C含量變化范圍分別為269.808～447.786、13.163～28.959、1.986～3.046和17.106～29.101 mg/g。春季可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪含量均最高,分別為447.786、28.959和3.046 mg/g,進(jìn)入夏季后,含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),進(jìn)入秋季這三者的含量又分別提高為324.657、16.175和2.401 mg/g。維生素C含量在秋季最高,為29.101 mg/g,總的來說,在不同采摘季節(jié)這4種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化較為明顯,春季采摘嫩葉是獲取這4種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量最高的最佳時(shí)期。

表2 代茶冬青不同季節(jié)葉片營(yíng)養(yǎng)成分含量

2.3 代茶冬青葉片氨基酸含量變化

如表3所示,在春季,葉片氨基酸含量最高的是精氨酸,為402.807 μg/g,最低的是甲硫氨酸,為21.618 μg/g。在夏季,葉片氨基酸含量最高的是天冬氨酸,為324.169 μg/g,最低的是半胱氨酸,為11.955 μg/g。在秋季,葉片氨基酸含量最高的是異亮氨酸,為116.341 μg/g,含量最低的是組氨酸,為9.281 μg/g。葉片總氨基酸含量最高的是春季,為1 645.139 μg/g,其次是夏季,為1 425.104 μg/g,最低的是秋季,為554.806 μg/g。葉片中人體必需氨基酸含量最高的是春季,為571.620 μg/g,其次是夏季,為394.809 μg/g,最低的是秋季,為225.185 μg/g。綜上,代茶冬青葉片中17種氨基酸含量在春季采摘含量呈現(xiàn)最高,在秋季采摘?jiǎng)t最低,兩者差異顯著(P< 0.05)。

表3 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸含量

2.4 代茶冬青葉片氨基酸相關(guān)性分析

由表4可知,17種氨基酸之間具有不同程度的相關(guān)性,其中Asp與Glu、Ser、His、Lys、Thr之間,Glu與Ser、His,Ser與His之間,Gly與Ala、Ar、Tyr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之間,His與Thr、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Leu之間,Arg與Pro、Val、Cys、Ile之間,Thr與Lys、Leu、Ile、Val之間,Ala與Lys、Leu、Ile、Val之間,Pro與Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe之間,Phe與Ala、Pro、Tyr、Val、Lys、Leu之間,Lys與Phe之間均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。Thr與Gly之間,Ala與His、Arg之間,Pro與Thr之間,Tyr與Arg之間,Met與Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val之間,Cys與His、Arg、Thr、Pro、Val之間,Ile與Ala、Met之間,Leu與Met之間,Phe與Met、Ile之間,Lys與Glu、Tyr、Val、Met、Leu之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05),其他氨基酸之間沒有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。由于不同氨基酸之間相關(guān)性信息復(fù)雜,不能夠直觀評(píng)價(jià)葉片氨基酸營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),因此采用主成分分析,以此來直觀地反映研究對(duì)象并對(duì)其作出客觀的評(píng)價(jià),便于研究代茶冬青葉片的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

2.5 葉片氨基酸主成分分析

對(duì)3個(gè)季節(jié)代茶冬青葉片中17種氨基酸進(jìn)行主成分分析,由圖1、圖2、表5可知第1主成分方差貢獻(xiàn)率占總變異信息的64.490%,第2主成分方差貢獻(xiàn)率占總變異信息34.395%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到98.885%,代表了葉片17種氨基酸的絕大部分信息,可以反映17種氨基酸的綜合性狀,因此選擇前2個(gè)主成分作為綜合指標(biāo)對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

圖1 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸主成分提取碎石圖

圖2 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸主成分圖

表5 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸主成分的初始特征值及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率

由表6可知Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys和Arg在第1主成分上有較大的載荷,載荷系數(shù)分別為0.913、0.996、0.971、0.953、0.998、0.897、0.563、0.975、0.999、0.814、0.889和0.761,說明第1主成分基本代表了這些氨基酸的信息;Asp、Glu、Ser、His和Thr在第2主成分上有較大的載荷,載荷系數(shù)分別為0.903、0.973、0.860、0.976和0.577,說明第2主成分反映了這些氨基酸的信息,因此選擇前2個(gè)主成分作為綜合指標(biāo)對(duì)其氨基酸品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表6 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸主成分載荷矩陣

以特征值的貢獻(xiàn)率大小為分配系數(shù)[11-13],計(jì)算出每個(gè)主成分的特征值與所提取主成分總的特征值之和的比例,以此作為權(quán)重,最后得出主成分綜合得分模型:

F1=0.130Asp+1.823Glu+0.215Ser+0.031Gly+0.045His+0.237Arg+0.051Thr+0.311Ala+0.297Pro+0.311Tyr+0.304Val+0.280Met+0.176Cys+0.254Ile+0.312Leu+0.302Phe+0.277Lys。

F2=0.373Asp+0.402Glu+0.356Ser-0.164Gly+0.404His-0.266Arg+0.239Thr+0.0261Ala-0.121Pro-0.101Tyr-0.088Val+0.169Met-0.321Cys-0.236Ile-0.012Leu+0.097Phe+0.185Lys。

對(duì)其按綜合主成分分值進(jìn)行排序,即可對(duì)不同季節(jié)葉片營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)比較,結(jié)果見表7。

表7 代茶冬青不同季節(jié)葉片氨基酸主成分得分和綜合得分

由表7可以得出,在第1主成分中,3個(gè)季節(jié)葉片得分最高的是春季,最低的是秋季,即春季中Gly、Ala、Phe、Pro、Tyr、Met、Cys、Val、Leu、Ile、Lys、Arg含量較高;第2主成分中,得分最高的是夏季,即夏季Asp、Glu、Ser、His、Thr含量較高。3個(gè)不同季節(jié)代茶冬青葉片所含氨基酸綜合評(píng)價(jià)得分按從高到低排序依次為夏季、春季、秋季。夏季的綜合評(píng)價(jià)得分最高,說明夏季葉片氨基酸綜合品質(zhì)較高,秋季的綜合評(píng)價(jià)得分最低,其氨基酸綜合品質(zhì)較低。

3 討論與結(jié)論

作為飲品的“茶”葉中各生化成分的含量受“茶”樹品種、季節(jié)、自然環(huán)境等影響較大,不同季節(jié)“茶”葉各生化成分存在明顯的差異和一定的變化規(guī)律[14-16]。我們對(duì)代茶冬青葉片各生化成分分析表明,礦質(zhì)元素中N、P、Fe、Mn含量春季最高,因?yàn)榇杭臼菢淙~生長(zhǎng)的時(shí)期,營(yíng)養(yǎng)狀況良好,且營(yíng)養(yǎng)元素向新生葉片轉(zhuǎn)移[17];K元素含量雖然在生長(zhǎng)期內(nèi)逐漸降低,但變化幅度較小,表明代茶冬青葉片K元素受季節(jié)影響不大;其次數(shù)據(jù)分析可得春季和秋季代茶冬青葉片中Zn和Cu含量都高,Zn和Cu是蛋白質(zhì)的組成成分,這可能春季和秋季蛋白質(zhì)含量都高有關(guān)[18]?？扇苄蕴恰被岬群吭诓煌竟?jié)間存在顯著差異,其中可溶性糖、可溶性蛋白春季最高、夏季最低,這與Huang等[19]的研究的結(jié)果一致。這可能是因?yàn)橹参飫傞_始復(fù)蘇生長(zhǎng)的時(shí)候需要更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流向嫩葉。在夏季,植物的新陳代謝加快,營(yíng)養(yǎng)元素被消耗,糖類、蛋白類物質(zhì)被分解轉(zhuǎn)化,所以可溶性糖、可溶性蛋白含量減少。秋季代謝減弱,物質(zhì)開始積累,可溶性蛋白含量增加。同時(shí)春季氨基酸含量最高,這與前人對(duì)“黃金茶”成分研究結(jié)果一致[20],原因可能是春季氣溫適中,浙江雨水充沛,加上茶樹經(jīng)過秋冬季節(jié)較長(zhǎng)時(shí)間的休養(yǎng)生息,內(nèi)在成分及含量較為豐富,特別是氨基酸含量。此外有研究認(rèn)為氨基酸含量高,且含有一定量的咖啡因是適宜制綠茶的品種特征要求[21,22]。氨基酸是茶葉的主要化學(xué)成分之一,其含量與綠茶品質(zhì)呈正相關(guān)[23-25],加上春季芽葉色澤翠綠,香氣濃烈,可以說代茶冬青作為春茶采摘是一年當(dāng)中最優(yōu)質(zhì)的茶,而秋季的氨基酸含量低于春夏季,這與Zhou等[26]對(duì)茶的生化成分研究結(jié)果一致,原因可能是因?yàn)榍锛静铇錃v經(jīng)春夏兩個(gè)季節(jié)的采收,缺乏體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此針對(duì)代茶冬青開發(fā)為茶葉利用時(shí),春季采摘是開發(fā)利用最適宜的季節(jié)。

本文通過對(duì)代茶冬青葉片營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行測(cè)定與分析,研究結(jié)果表明代茶冬青春季葉片中含有較高的礦質(zhì)元素、可溶性糖、可溶性蛋白和粗脂肪。利用主成分分析法對(duì)代茶冬青3個(gè)季節(jié)葉片氨基酸進(jìn)行分析,得到2個(gè)主成分。以方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重,依據(jù)各主成分得分值與方差貢獻(xiàn)率建立綜合評(píng)價(jià)模型,得到不同季節(jié)葉片氨基酸含量的綜合得分,氨基酸含量綜合評(píng)價(jià)得分排序?yàn)橄募?春季>秋季。綜上所述,春季營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量最高,夏季葉片氨基酸較為豐富,秋季代茶冬青葉片中含有較高的維生素C。因此在實(shí)際生產(chǎn)中,可根據(jù)需求選擇不同季節(jié)代茶冬青葉片開發(fā)成多種產(chǎn)品。