中國(guó)不同地區(qū)連翹精油成分比較分析

邱智軍,原江鋒,龔明貴

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心,洛陽 471023

連翹是一種傳統(tǒng)大宗藥材,是指植物連翹(Forsythiasuspensa)[1]的干果。連翹常用于中醫(yī)治療,具有抗菌、抗炎、抗癌等藥理功效[2-4]。根據(jù)果實(shí)的成熟度和采收時(shí)間,連翹可分為青翹(green Forsythiae Fructus,GF)和老翹(ripe Forsythiae Fructus,RF)。根據(jù)氣候條件,GF通常在7月下旬至9月上旬收獲,此時(shí)果實(shí)幾乎成熟,但仍呈綠色,大多數(shù)GF果實(shí)尚未有裂痕。RF通常在10月收獲,此時(shí)果實(shí)完全成熟,呈黃色且開裂。參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020版[5],GF和RF在應(yīng)用中都被稱為連翹。

連翹在中國(guó)分布十分廣泛。根據(jù)連翹資源的歷史獲取情況,山西、河南和陜西三省分別占總供應(yīng)量的40%、30%和20%,連翹的資源也分布在安徽和湖北省[6]。連翹多為野生資源,當(dāng)?shù)厝藭?huì)在合理的時(shí)間段(7月下旬至9月上旬)采摘連翹為搶青,這一現(xiàn)象導(dǎo)致市面上的GF數(shù)量要高于RF。近些年來,連翹精油受到了相當(dāng)大的關(guān)注[7],Jiao等[8]在連翹中發(fā)現(xiàn)了21種精油化合物,精油表現(xiàn)出相對(duì)良好的抗菌活性。烯烴、醇和酯是連翹精油中發(fā)揮藥理作用的主要成分[9,10]。但是,關(guān)于連翹生長(zhǎng)環(huán)境和采收時(shí)間差異的影響,尚未對(duì)主產(chǎn)區(qū)的連翹精油進(jìn)行定量系統(tǒng)評(píng)價(jià),利用GC-MS技術(shù)對(duì)不同地區(qū)的連翹精油成分進(jìn)行分析仍值得研究,以促進(jìn)連翹綜合利用。

本研究從中國(guó)五個(gè)省(主要產(chǎn)區(qū))采集了13批連翹,采用GC-MS結(jié)合主成分分析(PCA)和聚類分析(CA)對(duì)其精油成分進(jìn)行了分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)。其中,基于PCA的質(zhì)量評(píng)價(jià)模型用于不同批次連翹的綜合質(zhì)量評(píng)估[11],CA則用于不同批次連翹的無監(jiān)督分類分析[12]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2018年,共從五個(gè)省份采集了13批次連翹(S1～S13),包括9批次GF和4批次RF(見表1)。經(jīng)河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院張巧明副教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythiasuspensa的干燥果實(shí)。所有材料在室溫下在干燥器中避光保存,使用前用粉碎機(jī)(40目)粉碎。

表1 樣品采集信息

1.2 方法

1.2.1 精油提取

參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020版[5]的揮發(fā)油測(cè)定法,連翹精油通過水蒸汽蒸餾方法獲得。將粉碎后的25 g連翹樣品浸泡在300 mL蒸餾水中,使用加熱套加熱至沸,保持微沸5 h,直到精油體積不再增加,結(jié)束加熱,獲得黃色精油,4 ℃避光保存?zhèn)溆?。重?fù)三次,所得精油的產(chǎn)率以百分比(V/W)表示。

1.2.2 GC-MS分析

使用配備DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm;膜厚0.25 μm)的GC/MS-Trace-DSQ系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific,America)分析來自不同地區(qū)的連翹精油。流速為1 mL/min的高純度氦氣作為載氣。吹掃流速為3.0 mL/min。溫度編程如下:從60 ℃(保持2 min)到130 ℃,速率為4 ℃/min,然后從130 ℃到260 ℃(維持20 min),速率為5 ℃/min。進(jìn)樣體積1 μL(分流比1/50),進(jìn)樣口溫度250 ℃。MS在220 ℃的界面溫度下以電子轟擊模式(70 eV)運(yùn)行;離子源溫度為200 ℃,溶劑延遲時(shí)間為4 min,質(zhì)量范圍為40～600 amu,掃描速率為6次/s。通過將其質(zhì)譜與NIST質(zhì)譜庫相匹配,確定了精油的化學(xué)成分。單個(gè)組分的相對(duì)面積(relative area,RA)表示為鑒定化合物的百分比。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件版本25.0進(jìn)行基于精油化學(xué)成分的PCA和CA分析。散點(diǎn)圖由Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 連翹精油產(chǎn)量

來自不同地區(qū)的連翹樣品的精油產(chǎn)量不同。GF精油的產(chǎn)率范圍為1.13%～2.34%,而RF精油的產(chǎn)率在1.42%～1.82%之間(見表2)。其中,S1河南盧氏GF(2.34%)和S13河南盧氏RF(1.82%)的精油產(chǎn)量最高,S9山西太原GF和S11湖北武漢RF(1.13%)的精油產(chǎn)量最低。從藥用植物中提取的精油具有廣泛的藥理應(yīng)用,如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病和抗衰老功效[13-15]。有報(bào)道,來自陜西楊凌的鼠尾草中精油產(chǎn)量在0.91%～1.62%之間[16];紅花中精油的產(chǎn)量為1.60%[17]。與這些藥材相比,連翹樣品的精油產(chǎn)率(1.13%～2.34%)相對(duì)較高,值得進(jìn)一步研究。對(duì)于不同地區(qū)的藥用植物,不同的精油產(chǎn)量被認(rèn)為與環(huán)境條件有關(guān),如降水、溫度、太陽輻射、土壤條件和連翹物種的基因型[18];另一方面,對(duì)于同一地區(qū)的GF和RF,精油產(chǎn)量可能在采收期、發(fā)育階段和連翹物種上表現(xiàn)出差異[19]。

表2 連翹樣品精油中的化合物

2.2 連翹精油成分

通過GC-MS鑒定的精油的詳細(xì)成分在樣品中表現(xiàn)出顯著的化學(xué)多態(tài)性。在所有樣品提取的精油中總共有54種化合物被鑒定識(shí)別,占總成分的比例在80.76%至91.08%之間(見表2)。在這些樣品中,烯烴是精油中最豐富的成分,其次是醇類。

隨著尋求自然本源療法的興起,基于精油的芳香療法已在國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用。連翹精油被證明能夠通過促進(jìn)生物活性成分透皮吸收,從而實(shí)現(xiàn)緩解外部綜合征的功能[2,20]。同時(shí),連翹精油中的化合物還具有諸多用途,比如:用作化妝品香料(3-蒈烯、α-蒎烯和β-蒎烯);鎮(zhèn)咳和抑菌(檸檬烯)[21];抗炎和退熱(桉葉油醇、綠花白千層醇和香芹酮)[22];抗慢性支氣管炎(香葉醇)[16];香水和除臭劑制備(β-月桂烯)[23];醫(yī)藥和肥皂工業(yè)(α-松油醇)[24];作為合成維生素E和維生素A的原料(芳樟醇和檸檬醛)[25]。從表2可以看出,α-蒎烯和β-蒎烯是連翹精油的主要成分,占比較高,其他的研究在連翹中也觀察到了這種現(xiàn)象[8]。

2.3 主成分分析

對(duì)連翹精油中12種常見化合物的主成分分析(PCA)表明,特征值大于1的3個(gè)主成分對(duì)于總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到77.24%,所以,這3個(gè)主成分(PC1、PC2和PC3)被用于綜合評(píng)價(jià)樣品的精油成分(見表3)。β-月桂烯、3-蒎烯、α-松油醇、芳樟醇、β-蒎烯和檸檬烯對(duì)PC1均有較高的載荷,說明PC1主要反映了這些化合物的信息。另外,綠花白千層醇、α-蒎烷、香芹酮對(duì)PC2具有較高的載荷,檸檬醛、香葉醇和桉葉油醇對(duì)PC3具有較高的載荷,也可以得出類似的結(jié)論。基于PC1和PC2評(píng)分的散點(diǎn)圖中連翹樣品被劃分成3個(gè)象限組(見圖1),第一象限組包括S13、S12、S2、S11和S10,第三象限組只有一個(gè)S8,第四象限組包括S1、S3、S9、S7、S6、S5和S4。其中,第一象限組中樣品主要是RF(除了S2),第四象限組則都是GF。顯然,樣品中的GF和RF是不同的,連翹果實(shí)中的精油成分受到了收獲期和發(fā)育程度的很大影響。針對(duì)每個(gè)樣品,PCA計(jì)算得到其三個(gè)方差貢獻(xiàn)率最大的主成分,以它們的成分得分為自變量,其相應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重系數(shù),構(gòu)建基于線性加權(quán)的連翹質(zhì)量評(píng)價(jià)函數(shù):H=0.39425*PC1+0.24478*PC2+0.13336*PC3,從而得到它的綜合得分H(見表4)。得分越高,評(píng)價(jià)質(zhì)量越好[26]。由表4可知,得分最高三個(gè)樣品分別是湖北武漢RF(S11)、陜西洛南RF(S12)和安徽六安RF(S10)。有研究表明[27],在連翹苷、連翹酯苷A、齊墩果酸、熊果酸、蘆丁等諸多活性成分方面,GF要優(yōu)于RF。然而,對(duì)于精油成分而言,如上所述,連翹中RF的綜合得分優(yōu)于GF。Feng等[28]在連翹果精油成分的PCA研究中也發(fā)現(xiàn)不同采收時(shí)期連翹藥材揮發(fā)油類成分間存在差異。因此,基于精油成分的觀點(diǎn),可優(yōu)選RF的開發(fā)和利用。

圖1 PCA二維散點(diǎn)圖

表3 PCA組分矩陣

表4 樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)排序

2.4 聚類分析

聚類分析(CA)是僅基于樣品自身特征,依據(jù)相似性實(shí)現(xiàn)樣品聚集的過程[29]。為了研究連翹精油成分與區(qū)域之間的相關(guān)性,用歐幾里得距離測(cè)量了樣品間的相似度,采用Ward方法對(duì)連翹精油中的54種化合物進(jìn)行了聚類分析。13批樣品按CA分成了4類(見圖2)。第一類由S4和S5組成,都是GF;第二類由S1、S2、S3、S6、S7、S9組成,也都是GF;第三類包含了S10、S11、S12和S13,都屬于RF;S8(山西長(zhǎng)治GF)則是一個(gè)單獨(dú)的類別,即第四類。CA能夠區(qū)分樣品中的GF和RF。除S2河南信陽GF外,CA的結(jié)果與PCA基本一致。所以,連翹樣品中的GF和RF通過12種常見化合物和精油中的54種化合物都能夠進(jìn)行有效區(qū)分。

圖2 連翹樣品聚類分析圖

復(fù)雜的環(huán)境因素會(huì)影響精油的理化性質(zhì)[30],PCA和CA分析中,S8山西長(zhǎng)治GF作為單獨(dú)分類的存在也表明這一點(diǎn)。CA沒有識(shí)別出更多明確的區(qū)域特征,其原因可能是收獲期因素對(duì)精油理化性質(zhì)的影響更大。上述結(jié)果分析表明,將精油的特征用作連翹收獲期和發(fā)育階段的化學(xué)分類標(biāo)記是可行的。

3 結(jié)論

本研究以精油成分為研究對(duì)象,系統(tǒng)比較分析了不同產(chǎn)地和采收期連翹果實(shí)的精油成分組成和含量,結(jié)果表明區(qū)域環(huán)境和采收期兩方面因素共同影響著連翹的精油組成狀況。本研究提供了連翹精油化學(xué)成分變化的初步數(shù)據(jù),而連翹精油組成直接決定著其諸多生物活性,因此,為了進(jìn)一步確定連翹精油組成的變化規(guī)律,從而指導(dǎo)連翹精油資源在醫(yī)療保健和食品工業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)利用,還需要進(jìn)行多年采樣,在規(guī)模更大、采樣條件更準(zhǔn)確的樣本上開展廣泛、深入的實(shí)驗(yàn)研究。