γ-聚谷氨酸的制備及其酪氨酸酶抑制活性研究

李 想,吳金芳,韓冠英*

1錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,錦州 121000;2山東豐金生物醫(yī)藥有限公司,煙臺(tái) 264000

均聚氨基酸一類的高分子聚合物具有生物學(xué)功能廣泛、生物相容性和分子量分布分散等特性。目前通過(guò)微生物得到的均聚氨基酸主要包括三種:聚谷氨酸(聚-γ-谷氨酸,poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)、ε-聚賴氨酸(ε-poly lysine,ε-PL)和藻青素(cyanophycin)[1]。γ-PGA作為其中的一種,同樣具有其優(yōu)良的生物學(xué)特性。從1913年起,研究人員相繼從納豆食品的黏液中和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)以及炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)等的發(fā)酵培養(yǎng)基中分離得到了γ-PGA[2,3]。γ-PGA的構(gòu)象結(jié)構(gòu)隨溶液的pH值、濃度和離子強(qiáng)度變化而顯著變化。由枯草芽孢桿菌生產(chǎn)γ-PGA在酸性溶液中具有平行的β-折疊結(jié)構(gòu),在接近中性時(shí)具有無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),在堿性環(huán)境中具有伸展的隨機(jī)結(jié)構(gòu)[4]。

γ-PGA成品為白色無(wú)味粉末狀物質(zhì),其分子量在100～10 000 kDa之間,相當(dāng)于50～50 000個(gè)左右的谷氨酸單體[5]。γ-PGA及其衍生物在諸多領(lǐng)域具廣泛的研究及應(yīng)用前景。如作為食品保鮮劑[6]、化妝品補(bǔ)水保濕成分[7]、藥物緩釋載體[8]、重金屬吸附劑及用于水處理的絮凝劑[9]等。2013年,有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),γ-PGA通過(guò)降低B16細(xì)胞內(nèi)活性氧和一氧化氮水平,提高過(guò)氧化氫酶活性,抑制Forsklin誘導(dǎo)的酪氨酸酶活性和黑素生成。這是首次報(bào)道γ-PGA的抗黑素化作用。

分子量是聚合物的重要特征參數(shù),分子量的大小決定其應(yīng)用領(lǐng)域和應(yīng)用效果[10]。因此,為了擴(kuò)展γ-PGA的應(yīng)用范圍制備不同分子量γ-PGA,并研究不同分子量之間的活性差異具有重要意義。目前,微生物發(fā)酵法是常用的γ-PGA發(fā)酵方法。采用該法制備所得的γ-PGA分子量及產(chǎn)量受產(chǎn)生菌的影響。根據(jù)發(fā)酵過(guò)程中是否添加谷氨酸,將γ-PGA的生產(chǎn)菌株分為谷氨酸依賴性菌株和非谷氨酸依賴性菌株兩類。有研究表明采用谷氨酸依賴型菌株作為產(chǎn)生菌,γ-PGA產(chǎn)量更高[11]。因此,本文以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株,通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA。結(jié)合化學(xué)降解手段制備了五組不同分子量的γ-PGA,并對(duì)其胞內(nèi)胞外抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了研究。為不同分子量的γ-PGA作為美白劑在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),山東豐金生物醫(yī)藥有限公司提供;酵母提取物(yeast extract,YE,100%,批號(hào)4345161-02,OXIOD);谷氨酸鈉(純度99%,批號(hào)C13501406,上海Macklin公司);MgSO4·7H2O(AR,批號(hào)20200827,天津市永大化學(xué)試劑制造有限公司);K2HPO4(AR,批號(hào)B2109241,西隴科學(xué)股份有限公司);瓊脂粉(BR,批號(hào)20190706,青島海博生物技術(shù)有限公司);氯霉素(純度99%,批號(hào)No.821G046,北京Solarbio公司);酪氨酸酶(500 units/mg,批號(hào)C14384601,上海Macklin公司);Na2SO4(純度99%,批號(hào)L2117166,上海Aladdin公司);左旋多巴(純度99%,批號(hào)C14100281,上海Macklin公司);L-酪氨酸(純度99%,批號(hào)C13364528,上海Macklin公司);B16-F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);胎牛血清(批號(hào)P2104403,上海泰坦科技股份有限公司);DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)2428676,美國(guó)Gibco公司);青霉素-鏈霉素雙抗(批號(hào)2441834,美國(guó)Gibco公司);PBS磷酸鹽緩沖液(AR,批號(hào)No.20220728,北京Solarbio公司);0.25%胰蛋白酶(批號(hào)No.20221009,北京Solarbio公司);MTT(純度99%,批號(hào)NO.530R058,美國(guó)Gibco公司);Triton X-100(純度98%,批號(hào)No.404R022JH,北京Solarbio公司);曲酸(純度99%,批號(hào)RH328769,北京Solarbio公司); 葡萄糖(AR,批號(hào)20150630,國(guó)藥集團(tuán));NaOH(AR,批號(hào)20211102,國(guó)藥集團(tuán));DMSO(AR,批號(hào)20220614,國(guó)藥集團(tuán));無(wú)水乙醇(AR,批號(hào)20210518,國(guó)藥集團(tuán))。

Vi-CELL XR型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Beckman Coulter公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular-Devices公司);HPLC(美國(guó)Waters公司);凝膠滲透色譜儀(英國(guó)Malvern公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1γ-PGA發(fā)酵工藝

以枯草芽孢桿菌為產(chǎn)生菌,以一定比例配制固體、種子及發(fā)酵培養(yǎng)基,通過(guò)菌種的平板活化、液體種子搖瓶、液體發(fā)酵搖瓶,得到γ-PGA發(fā)酵液。通過(guò)無(wú)水乙醇沉淀后,經(jīng)進(jìn)一步純化除雜,最終得到固體γ-PGA。

1.2.2 培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)基:葡萄糖 25 g/L,谷氨酸鈉 10 g/L,YE 15 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,K2HPO42 g/L,瓊脂 20 g/L;種子培養(yǎng)基:葡萄糖 25 g/L,谷氨酸鈉 10 g/L,YE 15 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,K2HPO42 g/L;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 25 g/L,谷氨酸鈉 10 g/L,YE 15 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,K2HPO42 g/L;pH 6.8～7.0;裝液量40%;滅菌條件:121 ℃高溫高壓濕熱滅菌20 min,其中葡萄糖需單獨(dú)滅菌,待滅菌完成后取出與其他成分混合均勻,在固體、種子及發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入氯霉素抗性至終濃度為10 μg/mL。

培養(yǎng)方法:按照“Z”字劃線法將菌種劃在固體培養(yǎng)基上,在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中恒溫倒置培養(yǎng)14 h。挑單菌落至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中,在37 ℃,200 r/min的培養(yǎng)條件下,恒溫振蕩培養(yǎng)18 h,達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到種子培養(yǎng)液。以5%的接種量將種子培養(yǎng)液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中,相同培養(yǎng)條件下,接續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)24 h,得到γ-PGA發(fā)酵液。

1.2.3 產(chǎn)物純化與表征

1.2.3.1 產(chǎn)物純化

將γ-PGA粗品按照一定比例復(fù)溶于水溶液中,調(diào)節(jié)pH為5.0,以30 g/L加入活性炭攪拌混勻,50 ℃水浴保溫2 h,在1 000 r/min、20 min的條件下離心去除活性炭,經(jīng)500目硅藻土、200目珍珠巖吸附除雜,再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,加入無(wú)水乙醇沉淀,4 ℃靜置過(guò)夜,去上清,加無(wú)水乙醇反復(fù)脫水2次后,過(guò)濾收集沉淀,60 ℃烘干至恒重,得到γ-PGA純品。

1.2.3.2 產(chǎn)物表征

參考Kambourova等[12]的方法,采用薄層色譜法,通過(guò)分析產(chǎn)物完全水解后的單體進(jìn)行產(chǎn)物鑒別。精確稱取0.5 g干燥的γ-PGA純品,放入具塞試管中,然后加入10 mL 6 mol/L的HCl,振蕩使其充分混勻,密封,110 ℃水解24 h,待其冷卻后調(diào)pH至6.8,定容至100 mL,配制成5 mg/mL的樣品水解液。另外分別取0.5 g干燥的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品和γ-PGA純品,用純化水充分溶解,定容至100 mL,配制成5 mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液。

本實(shí)驗(yàn)中,采用酸性溶劑系統(tǒng)。展層劑的配置比例為正丁醇∶80%甲酸∶水=15∶3∶2(V/V/V)。在薄層層析硅膠板板上依次等距離點(diǎn)樣樣品溶液、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品水解液,冷風(fēng)吹干,反復(fù)點(diǎn)樣三次。展層50～60 min,以0.1%茚三酮-丙酮溶液做顯色劑均勻噴灑層析板,熱風(fēng)吹干對(duì)比氨基酸斑點(diǎn)。

1.2.4γ-PGA產(chǎn)量測(cè)定

采用干重法測(cè)定產(chǎn)量,向等量的γ-PGA發(fā)酵液中,加入4倍體積無(wú)水乙醇沉淀,4 ℃靜置過(guò)夜后抽濾取沉淀,60 ℃烘干至恒重稱量,計(jì)算產(chǎn)量。

1.2.5γ-PGA純度測(cè)定

以Na2SO4作為流動(dòng)相,以含量高于99% 的γ-PGA作為標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)不同含量γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收值進(jìn)行檢測(cè)。在檢測(cè)柱溫為30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量20 μL的色譜條件下,采用高效液相色譜法測(cè)定,記錄峰面積,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品溶液中γ-PGA的濃度(c),以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示的γ-PGA含量按照公式(1)計(jì)算。

(1)

式中,c:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的樣品溶液中γ-PGA的濃度,g/L;100:γ-PGA樣品溶解的體積,mL;m:精確稱取的γ-PGA樣品的質(zhì)量,g。

1.2.6γ-PGA降解

γ-PGA的結(jié)構(gòu)易受溫度和pH值的影響。因此,采用高溫酸降的方式降解γ-PGA。配制4%的γ-PGA水溶液調(diào)節(jié)pH值為3.0,將其置于90 ℃的水浴鍋中進(jìn)行酸性條件下的高溫降解,分別降解15、30、45、60、75、90、105和120 min,降解結(jié)束后迅速冰浴使樣品冷卻至室溫,調(diào)pH至中性(6.8～7.2),加4倍無(wú)水乙醇,以500 r/min的轉(zhuǎn)速邊攪拌邊加醇,沉淀靜置2～4 h,棄上清后再加2倍無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水,過(guò)濾收集沉淀,于60 ℃烘干至恒重以除去乙醇?xì)埩?收集沉淀樣品。

1.2.7γ-PGA分子量測(cè)定

以0.3 mol/L Na2SO4作為流動(dòng)相,通過(guò)窄分布標(biāo)準(zhǔn)品獲取儀器常數(shù),寬分布標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證儀器常數(shù)。在檢測(cè)柱溫為30 ℃,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量100 μL的條件下通過(guò)檢測(cè)γ-PGA樣品在示差折光檢測(cè)器下的出峰時(shí)間,利用GPC測(cè)定γ-PGA樣品的分子量。

1.2.8 不同分子量γ-PGA胞外酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

人體內(nèi)各類色素分布情況是影響人體皮膚正常狀態(tài)的主要因素之一,其中黑色素的合成、分泌、轉(zhuǎn)移以及脫落對(duì)于皮膚狀態(tài)發(fā)揮著尤為重要的影響[13]。而酪氨酸酶是黑色素的合成途徑中的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是一種活性中心包含3個(gè)組氨酸(His)殘基和2個(gè)Cu離子的多功能酶,廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物中。它不僅可以氧化酪氨酸形成多巴,也可以繼續(xù)氧化多巴形成多巴醌。多巴醌是一種高活性的物質(zhì),它可以和氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成高分子復(fù)合物或褐色素,最終形成黑色素。在TYR參與催化反應(yīng)過(guò)程中,兩步催化反應(yīng)分別體現(xiàn)了酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性。

1.2.8.1 胞外酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

參考Wang[14]的方法。將5組不同分子量的γ-PGA用0.05 mol/L PBS緩沖液配成10 mg/mL的樣品溶液,酪氨酸酶提前溫浴5 min后,按照表1依次添加各組分,其中A1為空白背景組、A2為空白組、A3為樣品背景組、A4樣品組。28 ℃水浴恒溫10 min后,利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在475 nm處的吸光度值,酪氨酸酶的抑制率按照公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

表1 酪氨酸酶活性抑制率測(cè)定

(2)

1.2.8.2 胞外酪氨酸單酚酶抑制率測(cè)定

參考Chen等[15]的方法并稍做改動(dòng)測(cè)定酪氨酸酶單酚酶抑制率。用0.05 mol/L PBS緩沖液將5組不同分子量的γ-PGA配成10 mg/mL的樣品溶液,采用200 μL的反應(yīng)體系,酪氨酸酶溶液提前溫浴5 min后,按照表2依次加入除酪氨酸酶溶液以外的各組分,酶標(biāo)儀恒溫28 ℃,加入酪氨酸酶溶液后立刻在475 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度值直至穩(wěn)定不變。其中(A4-A3)為添加樣品的吸光度曲線,(A2-A1)為未添加樣品的吸光度曲線。反應(yīng)速率恒定階段的直線與橫軸截距為遲滯時(shí)間。酪氨酸單酚酶抑制率按照公式(3)計(jì)算。

表2 降解產(chǎn)物含量測(cè)定

(3)

式中,tA:添加樣品的遲滯時(shí)間,min;tB:未添加樣品的遲滯時(shí)間,min。

1.2.8.3 胞外酪氨酸二酚酶抑制率測(cè)定

參考Ochiai等[16]的方法并稍做改動(dòng)。用0.05 mol/L PBS緩沖液將5組不同分子量的γ-PGA配成10 mg/mL的樣品溶液,將表2中單酚酶的反應(yīng)底物L(fēng)-酪氨酸置換為二酚酶的反應(yīng)底物左旋多巴,其余組分和條件保持不變,測(cè)定酪氨酸酶二酚酶抑制率。酶標(biāo)儀恒溫28 ℃,加入酪氨酸酶溶液后立刻在475 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度值直至穩(wěn)定不變。以每分鐘475 nm處吸光度值變化表示反應(yīng)速率。酪氨酸二酚酶抑制率按照公式(4)計(jì)算。

(4)

式中,VA:添加樣品的反應(yīng)速率;VB:未添加樣品的反應(yīng)速率。

1.2.9 不同分子量γ-PGA胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

B16-F10細(xì)胞是小鼠黑色素瘤細(xì)胞,呈上皮細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng)。因其與人體黑色素細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理活動(dòng)相似,相比人體黑色素細(xì)胞更易培養(yǎng),因此被用于美白活性物質(zhì)的細(xì)胞評(píng)價(jià)模型。

1.2.9.1 B16-F10細(xì)胞毒性試驗(yàn)

參考Wu[17]的方法并稍作改動(dòng)。采用MTT法對(duì)不同分子量γ-PGA的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定,以得到后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的安全濃度范圍。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞,以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞完全貼壁。移去舊培養(yǎng)基,加PBS清洗兩遍,加入由含有0.1%DMSO培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的樣品溶液,空白組及陽(yáng)性對(duì)照組由培養(yǎng)基和曲酸替代,置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。移去舊培養(yǎng)基后,向各孔內(nèi)加入以培養(yǎng)基稀釋的5 mg/mL的MTT溶液10 μL和90 μL的新培養(yǎng)基,繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄去舊培養(yǎng)基后,向各孔中加入150 μL的DMSO溶劑,震蕩10 min,使紫色甲臜晶體完全溶解。采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定96孔板中每孔細(xì)胞的吸光度值,設(shè)定空白組細(xì)胞存活率為100%,細(xì)胞存活率按公式(5)計(jì)算。

(5)

1.2.9.2 抑制B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)

為了測(cè)定樣品對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)TYR活性的抑制能力,采用酪氨酸形成多巴醌的速率對(duì)細(xì)胞內(nèi)的TYR活性進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞,以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞完全貼壁。移去舊培養(yǎng)基,加PBS清洗,加入由培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的樣品溶液,以曲酸為陽(yáng)性對(duì)照,空白組用培養(yǎng)基替代,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。向各孔內(nèi)加入10 μL的1 mg/mL的L-酪氨酸溶液和90 μL含1%體積分?jǐn)?shù)的TritonX-100溶液。超聲破碎7 min(功率20%,超聲3 s,間隔10 s,重復(fù)30次)。37 ℃水浴1 h后,采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在475 nm處的吸光度值,細(xì)胞內(nèi)的TYR活性抑制率按照公式(6)計(jì)算。

(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 27.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素顯著性分析(ANOVA),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物表征

γ-PGA屬于均聚氨基酸的一種,其由單一氨基酸,即谷氨酸聚合而成。因此采用薄層色譜法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征,通過(guò)上行展開(kāi)法,從左至右依次點(diǎn)樣γ-PGA樣品溶液、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和γ-PGA樣品水解液,顯色結(jié)果如圖1所示,水解前γ-PGA樣品溶液顯色后無(wú)層析斑點(diǎn),水解后的樣品水解液與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一水平上有且只有一個(gè)層析斑點(diǎn),說(shuō)明γ-PGA水解后只含有谷氨酸一種氨基酸,充分說(shuō)明了γ-PGA是由谷氨酸聚合而成。

圖1 薄層層析結(jié)果

2.2 γ-PGA產(chǎn)量測(cè)定

采用干重法進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定,取發(fā)酵液加入一定體積倍數(shù)的無(wú)水乙醇,置于4 ℃靜置過(guò)夜,經(jīng)重復(fù)脫水2次后,過(guò)濾取沉淀,60 ℃烘干至恒重稱量,計(jì)算產(chǎn)量。

2.3 γ-PGA純度測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定γ-PGA樣品的含量。首先以標(biāo)準(zhǔn)溶液中γ-PGA的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,測(cè)定γ-PGA樣品峰如圖3所示。將峰面積代入公式計(jì)算得γ-PGA樣品的含量為97.69%。

圖3 γ-PGA樣品紫外檢測(cè)色譜圖

2.4 γ-PGA降解產(chǎn)物純度測(cè)定

采用HPLC法對(duì)5組降解產(chǎn)物進(jìn)行了含量測(cè)定。具體方法同上。測(cè)定5組降解產(chǎn)物含量如表2所示。點(diǎn)

2.5 γ-PGA降解產(chǎn)物分子量測(cè)定

采用GPC法,使用凝膠色譜柱,利用空間排阻原理,分子量大的先流出,對(duì)5組降解產(chǎn)物進(jìn)行了重均分子量測(cè)定。測(cè)定5組降解產(chǎn)物分子量如表3所示。

表3 降解產(chǎn)物的分子量分布

2.6 不同分子量γ-PGA胞外酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

2.6.1 胞外酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

由圖4可知,γ-PGA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制效果隨分子量的增加而增大,抑制率隨作用時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先升高后逐漸降低至平緩狀態(tài),在10 min時(shí)抑制效果明顯,分子量由低到高,γ-PGA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制率分別達(dá)到15.61%、41.08%、63.05%、79.57%和90.97%。

圖4 不同分子量γ-PGA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制效果

2.6.2 胞外酪氨酸單酚酶抑制率的測(cè)定

以L-酪氨酸為底物,測(cè)定5組分子量的γ-PGA樣品抑制酪氨酸單酚酶的活性。遲滯效應(yīng)是單酚酶的特征反應(yīng),以直線反應(yīng)部分外推與橫軸的截距表示遲滯時(shí)間,遲滯時(shí)間越長(zhǎng),表示樣品抑制單酚酶的活性越強(qiáng)。由圖5A可知,隨著γ-PGA分子量的增加單酚酶活力逐漸減弱且均弱于空白曲線,表示5組分子量的γ-PGA均具有一定的抑制效果且遲滯效應(yīng)越來(lái)越明顯。如圖5B所示,5組樣品的遲滯時(shí)間隨分子量的增大而增加,表示γ-PGA抑制酪氨酸單酚酶的活性隨分子量的增加而增大。

圖5 不同分子量γ-PGA對(duì)酪氨酸單酚酶的抑制效果

2.6.3 胞外酪氨酸二酚酶抑制率的測(cè)定

以左旋多巴為底物,測(cè)定5組分子量的γ-PGA樣品抑制酪氨酸二酚酶的活性。二酚酶的抑制效果通過(guò)催化反應(yīng)速率進(jìn)行表征,以直線反應(yīng)部分的斜率表示反應(yīng)速率,反應(yīng)速率越慢,表示樣品抑制二酚酶的活性越強(qiáng)。由圖6A可知,隨著γ-PGA分子量的增加二酚酶活力逐漸減弱且均弱于空白曲線,表示5組分子量的γ-PGA均具有一定的抑制效果且反應(yīng)速率逐漸降低。如圖6B所示,5組樣品的反應(yīng)速率隨著分子量的增大而降低,表示γ-PGA抑制酪氨酸二酚酶的活性隨分子量的增加而增大。

圖6 不同分子量γ-PGA對(duì)酪氨酸二酚酶的抑制效果

2.7 不同分子量γ-PGA胞內(nèi)酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定

2.7.1 B16-F10細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

為了更加準(zhǔn)確地測(cè)定不同分子量γ-PGA的皮膚美白效果,使其可以作為美白活性物質(zhì)解決色素沉積等問(wèn)題,確保其使用安全性是研究的首要前提。因此,本研究采用MTT法對(duì)不同分子量γ-PGA作用于B16細(xì)胞的安全濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定基礎(chǔ)。以曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照,本實(shí)驗(yàn)共設(shè)立了5種樣品濃度(0.05、0.1、0.5、1和5 mg/mL)進(jìn)行測(cè)定。

如圖7所示,5組分子量的γ-PGA對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響無(wú)明顯差別,但在分子量增大至501 kDa時(shí),在5 mg/mL的濃度下細(xì)胞存活率出現(xiàn)明顯降低。而當(dāng)樣品濃度低于或等于1 mg/mL時(shí),5組分子量γ-PGA的作用下,細(xì)胞存活率均超過(guò)90%,對(duì)B16細(xì)胞無(wú)明顯毒性,因此,以低于或等于1 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的安全濃度范圍。

圖7 不同分子量γ-PGA的B16細(xì)胞毒性

2.7.2 抑制B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)

如圖8所示,經(jīng)5組分子量γ-PGA處理后,細(xì)胞內(nèi)TYR活性均顯著降低,且不引起細(xì)胞毒性。其中21 kDa的γ-PGA在0.05 mg/mL的濃度下,對(duì)細(xì)胞內(nèi)TYR的抑制率最高,達(dá)到41.77%。

圖8 不同分子量γ-PGA對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

γ-PGA是一種胞外分泌型產(chǎn)物。長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)其性質(zhì)、產(chǎn)生菌改良和基因特性、發(fā)酵過(guò)程以及提取純化進(jìn)行了大量研究[19-22]。γ-PGA的分子量直接影響著其在諸多領(lǐng)域中的應(yīng)用[23]。隨著研究人員發(fā)現(xiàn)γ-PGA具有抗黑素化的作用,γ-PGA逐漸成為了一種潛在的美白劑成分。

減少黑色素的生成量是發(fā)揮美白效果的關(guān)鍵一步。積累的研究表明,酪氨酸酶是參與黑色素生成過(guò)程中的重要限速酶,其表達(dá)水平和活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[24]。因此,其抑制劑通常被篩選為美白劑。2004年Sasaki等[25]發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白可通過(guò)直接抑制黑素體中的酪氨酸酶活性,有效抑制NO和其他黑素原刺激的黑素生成。2013年Jeong等[26]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh4苷元(A-Rh4)通過(guò)蛋白激酶A途徑抑制了B16黑色素瘤細(xì)胞的黑色素合成。在黑素合成中觀察到酪氨酸酶活性增加,它的下調(diào)可以抑制黑素生成。因此,尋找具有抗酪氨酸酶活性的天然生物材料已被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)新的皮膚色素沉著調(diào)節(jié)產(chǎn)品的重要策略。

本文選用谷氨酸依賴型桿菌-枯草芽孢桿菌作為菌種發(fā)酵制備γ-PGA,γ-PGA的產(chǎn)量為8 g/L,含量為97.69%。利用其在結(jié)構(gòu)上對(duì)物理化學(xué)條件敏感的特性,結(jié)合化學(xué)降解手段,制備了重均分子量依次為21、117、282、432和501 kDa五組不同分子量的γ-PGA。為保證細(xì)胞生物安全性,對(duì)細(xì)胞可使用的安全濃度范圍首先進(jìn)行了評(píng)估。后以酪氨酸酶活性抑制率為指標(biāo),測(cè)定了五組不同分子量的γ-PGA在胞內(nèi)及胞外的酪氨酸酶活性抑制率。綜合細(xì)胞毒性和酪氨酸酶的抑制活性結(jié)果顯示,5組分子量的γ-PGA均具有酪氨酸酶活性抑制作用,且胞外對(duì)酪氨酸酶的抑制活性隨分子量的增加而增大,為未來(lái)γ-PGA作為潛在美白成分的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

通過(guò)微生物發(fā)酵法制備的γ-PGA分子量是有限的。Jiang等[27]通過(guò)構(gòu)建了一種含γ-PGA降解酶基因簇pgsBAE的重組枯草芽孢桿菌,能夠合成低分子量(約10 kDa)的γ-PGA。喬長(zhǎng)盛等采用發(fā)酵罐發(fā)酵,通過(guò)調(diào)控發(fā)酵過(guò)程,優(yōu)化發(fā)酵條件,制備了1 000 kDa的γ-PGA。因此,下一步,可結(jié)合基因工程等手段通過(guò)導(dǎo)入降解酶或合成酶的關(guān)鍵基因片段構(gòu)建工程菌株以制備更高或更低分子量的γ-PGA,以進(jìn)一步研究其美白活性。

目前,已有天然成分作為美白劑添加在化妝品配方中使用,常見(jiàn)的包括曲酸、熊果苷、煙酰胺、蝦青素以及水楊酸、果酸等,不同的美白成分因其發(fā)揮美白作用機(jī)制的不同,其美白活性也不同,相同的美白成分,因其添加的濃度不同,其在化妝品中發(fā)揮的作用也有所差異。因此,通過(guò)對(duì)不同分子量聚谷氨酸美白活性的研究,不僅為化妝品領(lǐng)域提供了一個(gè)潛在的美白成分,并且根據(jù)不同分子量之間發(fā)揮美白活性的差異,或可添加到化妝品配方中發(fā)揮不同的效果,適配不同的人群,滿足不同人群所需的美白效果。未來(lái),通過(guò)改進(jìn)天然提取物的提取技術(shù),可以對(duì)提取物的活性成分進(jìn)行定性和定量分析,確定活性成分的作用,并找到在自然生物中具有最佳美白效果的活性物質(zhì)[28,29]。