circ_0000885通過靶向miR-944調控胃癌細胞的增殖和凋亡

次仁央宗, 王朝華

(西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院 消化科, 西藏 拉薩, 850000)

胃癌發(fā)病率高,其早期臨床癥狀不明顯,確診時多為晚期[1]。目前,胃癌的治療主要包括手術、化療、放療和靶向治療等手段,但由于晚期、耐藥和復發(fā)率高,患者5年生存率較低[2]。胃癌已嚴重影響患者的生活質量和生命健康。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有共價閉環(huán)的非編碼RNA,由于其環(huán)狀結構, circRNA非常穩(wěn)定,此外circRNA序列高度保守,并以組織或細胞特異性的方式表達[3-4]。研究[5]表明, circ_0000885在骨肉瘤中表達上調,可作為骨肉瘤預后不良的生物標志物。下調circ_0000885可抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和誘導細胞周期阻滯[6]。沉默circ_0000885可抑制肝癌細胞的生長能力[7]。然而, circ_0000885在胃癌中作用的相關研究較少。此外,通過Circinteractome預測軟件發(fā)現,微小RNA(miR)-944在circ_0000885上有結合位點。研究[8]表明, miR-944在胃癌細胞中表達下降,過表達miR-944可抑制胃癌細胞的上皮間質轉化,抑制其表達可促進胃癌細胞轉化。盡管已有研究確定miR-944在胃癌中的作用,但circ_0000885在胃癌中的作用以及miR-944是否參與其調控作用還尚未闡明。因此,本研究探討circ_0000885在胃癌AGS細胞增殖和凋亡中的作用以及circ_0000885與miR-944之間是否存在靶向關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究共招募30例在本院收治的胃癌患者(2017年1月—2019年1月),患者術前均未接受放療和化療,手術獲得胃癌組織及相應癌旁組織后, -80 ℃保存,每例患者均簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2 材料

人正常胃黏膜細胞GES-1和胃癌細胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484購自中國科學院上海細胞庫; 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司; 由日本Takara公司提供Trizol試劑、反轉錄、qRT-PCR試劑盒; 上海晶抗生物工程有限公司提供MTT和Annexin V-FITC/PI試劑盒; RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司; 美國Invitrogen公司提供Lipofectamine2000試劑。

1.3 細胞轉染與分組

取對數生長期AGS細胞,根據Lipofectamine2000轉染試劑說明書,將si-NC、si-circ_0000885、pcDNA、pcDNA-circ_0000885、miR-NC、miR-944、si-circ_0000885與anti-miR-NC、si-circ_0000885與anti-miR-944轉染至AGS細胞,分別記為si-NC組、si-circ_0000885組、pcDNA組、pcDNA-circ_0000885組、miR-NC組、miR-944, si-circ_0000885+anti-miR-NC組或si-circ_0000885+anti-miR-944組,未處理的細胞設為NC組。

1.4 逆轉錄-實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測circ_0000885和miR-944的表達

提取細胞總RNA,反轉錄成cDNA,將合成的cDNA用作PCR擴增的模板,分別以GAPDH和U6為內參,檢測circ_0000885和miR-944的表達水平,相對表達量采用2-△△Ct法計算。circ_0000885上游引物: 5′-ACTGCCAGAAAGTGTGTCCC-3′; 下游引物: 5′-CGGGCCTCGTTTTGAACATC-3′。miR-944上游引物: 5′-GCCGAGAAATTATTGTACAT-3′; 下游引物: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。GAPDH上游引物: 5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′; 下游引物: 5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′。U6上游引物: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′; 下游引物: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5 MTT

取各組AGS細胞懸液(2.5×104個/mL), 96孔板每孔加入100 μL, 隨后向每個孔中加入20 μL MTT (5 mg/mL), 37 ℃孵育4 h, 棄細胞上清液,用DMSO溶解MTT晶體,并在450 nm處測量吸光度。

1.6 流式細胞術

收集各組細胞,重懸于1×結合緩沖液,并用Annexin V-FITC、碘化丙啶(PI)各5 μL, 在20 ℃下染色15 min, 通過FACScan流式細胞儀對樣品凋亡進行分析。

1.7 蛋白質免疫印跡(Western blot)

用1×細胞裂解緩沖液提取細胞蛋白。將每個樣品的蛋白質(50 μg)進行電泳,并轉移到硝化纖維膜上。隨后5%脫脂牛奶封閉,一抗4 ℃孵育過夜。然后,山羊抗兔HRP標記的二抗室溫孵育2 h。ECL底物試劑盒用于進行信號的化學發(fā)光檢測, Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 circ_0000885和miR-944在胃癌組織中的表達

相較于癌旁組織,胃癌組織中circ_0000885高表達, miR-944低表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。與GES-1細胞比較,胃癌細胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中, circ_0000885表達升高, miR-944表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。circ_0000885在AGS細胞中的表達水平高于HGC-27、N87、SNU-48細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 故后續(xù)實驗選擇AGS細胞,見表2。

表1 circ_0000885和miR-944在胃癌組織中的表達

表2 circ_0000885和miR-944在胃癌細胞系中的表達

2.2 敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較, si-circ_0000885組的circ_0000885表達降低, AGS細胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); NC組和si-NC組各指標比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1和表3。

A: 細胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關蛋白表達。圖1 敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響

表3 circ_0000885敲低對AGS細胞增殖和凋亡的影響

2.3 circ_0000885靶向調控miR-944的表達

通過Circinteractome的預測, miR-944被發(fā)現在circ_0000885上有結合位點(圖2)。轉染miR-944, WT-circ_0000885組的熒光素酶活性減低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 但不影響MUT-circ_0000885組(P<0.05), 見表4。circ_0000885上調或下調可分別抑制和促進細胞中miR-944的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表5。

圖2 circ_0000885的序列中含有與miR-944互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circ_0000885調控miR-944表達

2.4 過表達miR-944對AGS細胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組比較, miR-944組的miR-944表達升高, AGS細胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平降低,凋亡率和Bax蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); NC組和miR-NC組各指標比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表6。

表6 過表達miR-944對AGS細胞增殖和凋亡的影響

2.5 miR-944敲低逆轉了敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響

相較于si-circ_0000885+anti-miR-NC組, si-circ_0000885+anti-miR-944組的miR-944表達降低, AGS細胞OD值以及PCNA、Bcl-2蛋白水平升高,凋亡率和Bax蛋白水平降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); si-circ_0000885組和si-circ_0000885+anti-miR-NC組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4、表7。

A: 細胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關蛋白表達。圖3 過表達miR-944對AGS細胞增殖和凋亡的影響

A: 細胞凋亡流式圖; B: 增殖和凋亡相關蛋白表達。圖4 下調miR-944逆轉了敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響

表7 下調miR-944逆轉了敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

circRNA異常表達與胃癌的惡性表型密切相關。如circPTK2在胃癌組織和細胞中表達顯著下調,上調circPTK2可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲,而抑制circPTK2表達則效果相反[9]。circ_0000751低表達與胃癌患者的腫瘤淋巴結轉移分期、腫瘤體積和淋巴結轉移呈反比,過表達circ_0000751可抑制胃癌腫瘤的進展、遷移、侵襲和轉移[10]。circPTK2表達下調與胃癌患者的低生存率相關,過表達circPTK2在體內外可抑制胃癌細胞的增殖、集落形成、DNA合成、侵襲、異種移植瘤生長和肺轉移,而下調circPTK2則結果相反[11]。過表達或上調circDIDO1可抑制或促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[12]。circ_0006470在胃癌細胞中表達升高,沉默circ_0006470可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13]。下調circ-HN1可通過miR-485-5p/GSK3A通路抑制胃癌進展[14]。敲除circ_0091994可通過誘導凋亡降低胃癌細胞的活力[15]。circ-RNF111敲低可誘導胃癌細胞凋亡,減弱細胞糖酵解、增殖以及移動能力[16]。本研究中,胃癌組織和細胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中高表達circ_0000885, 敲減circ_0000885降低了AGS細胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表達水平,升高了細胞凋亡率和Bax表達水平,提示敲減circ_0000885可抑制AGS細胞增殖,并促進凋亡。

研究[6]表明, circ_0000885可作為內源競爭性RNA調控微小RNA(miRNA)表達來影響骨肉瘤細胞的惡性行為。通過Circinteractome預測網站,本研究發(fā)現, miR-944在circ_0000885上存在結合位點,隨后,本研究證實miR-944是circ_0000885的靶基因,且circ_0000885負向調控胃癌細胞中miR-944的表達。研究[17]顯示, miR-944在人類多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用。肺腺癌組織和細胞低表達miR-944, 上調miR-944可抑制癌癥細胞的生長。上調miR-944可降低結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力,而敲除miR-944表達則結果相反[18]。miR-944在三陰性乳腺癌細胞中低表達,其過表達可抑制癌細胞的侵襲、遷移、和上皮間質轉化[19]。與既往研究一致,本研究也證實miR-944在為胃癌中發(fā)揮抗癌作用。胃癌組織和細胞系AGS、HGC-27、N87、SNU-484中低表達miR-944, 過表達miR-944降低了AGS細胞OD值以及PCNA、Bcl-2 表達水平,升高了細胞凋亡率和Bax表達水平。進一步回復實驗顯示,下調miR-944逆轉了敲減circ_0000885對AGS細胞增殖和凋亡的影響,OD值以及PCNA、Bcl-2 表達水平升高,凋亡率和Bax表達水平降低。

綜上所述,胃癌組織和細胞中高表達circ_0000885, 低表達miR-944。miR-944是circ_0000885的功能靶標,敲低circ_0000885可通過靶向上調miR-944抑制胃癌細胞的生長,提示circ_0000885可能是胃癌的潛在治療靶點。但本研究僅限于體外實驗,其在體內的作用還有待進一步研究。