丹參新品系多點(diǎn)品比試驗(yàn)研究

談景福陳為序高俊斌

(1.上海市藥材有限公司，上海 200000；2.上藥華宇(臨沂)中藥資源有限公司，山東 臨沂 276000)

丹參為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬植物丹參(Salviae MiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖[1]，又名紫丹參、紅根、赤參、血參等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰等功效，是一種常用大宗中藥材。但是目前丹參種質(zhì)混雜[2，3]，生產(chǎn)使用的種源多是自繁自育的農(nóng)家種，優(yōu)質(zhì)性和穩(wěn)定性無(wú)法保障，因此為保障優(yōu)質(zhì)丹參原料的穩(wěn)定供應(yīng)，亟需培育優(yōu)良品種進(jìn)行應(yīng)用推廣。本研究以前期收集的丹參種質(zhì)資源為材料，借鑒中藥材選育技術(shù)開(kāi)展實(shí)施[4-7]。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)照品種：山東省臨沂市平邑縣當(dāng)?shù)氐⑥r(nóng)家品種。參試品系：ZT-16-15、DZ-16-03、DZ-16-105、DZ-16-05，上海市藥材有限公司山東丹參基地特異單株經(jīng)系統(tǒng)選育形成的優(yōu)良品系。品比試驗(yàn)所用種根由上海市藥材有限公司山東丹參基地自繁獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)布置

田間試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中山東省臨沂市布點(diǎn)3個(gè)，山東省濰坊市布點(diǎn)1個(gè)，山東省濟(jì)寧市布點(diǎn)1個(gè)。具體位置信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)點(diǎn)位置信息

1.2.2 選址依據(jù)

試驗(yàn)點(diǎn)的選擇按照丹參產(chǎn)地適宜性區(qū)劃進(jìn)行，同時(shí)兼顧樣點(diǎn)的代表性以及實(shí)驗(yàn)操作的便捷性等因素。由表2可知，5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均位于丹參適宜生長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)。

表2 5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)生態(tài)因子數(shù)據(jù)

1.2.3 田間小區(qū)設(shè)計(jì)

4個(gè)目標(biāo)丹參種質(zhì)分別為ZT-16-15、DZ-16-03、DZ-16-105、DZ-16-05。各品系根段經(jīng)沙藏形成愈傷組織后，平行移栽于5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

1.2.4 種植及田間管理

1.2.4.1 根段催芽

1月下旬選擇根條順直、色澤紅、粗細(xì)均勻、無(wú)畸形、無(wú)破裂、健康無(wú)病蟲(chóng)害，直徑7～13mm的一年生健壯子根，截成4～5cm丹參根段，扦插于育苗基質(zhì)種催芽，根段生理上端在上。

1.2.4.2 移栽

4月上旬待根段上端分化出幼芽時(shí)開(kāi)始移栽，施用生物有機(jī)肥200kg·667m-2；起壟穴栽，壟上種植2行，株距20cm，錯(cuò)穴種植。

1.2.4.3 田間管理

移栽后鋪設(shè)滴灌管，保持土壤濕潤(rùn)；生長(zhǎng)期間適時(shí)中耕除草；11月底割去地上部植株，挖出整個(gè)地下部分進(jìn)行采收。

1.2.5 調(diào)查測(cè)定項(xiàng)目

全生育期進(jìn)行觀察記錄，出苗期、齊苗期、花期、果期等物候期進(jìn)行調(diào)查，記錄出苗情況、苗子長(zhǎng)勢(shì)和整齊度。待所有品系植株發(fā)育完全后，各小區(qū)隨機(jī)抽樣10株，調(diào)查測(cè)定苗高、復(fù)葉小葉數(shù)、頂端葉形狀、葉表面特征、葉色等生物學(xué)性狀。產(chǎn)量測(cè)定，收獲時(shí)，實(shí)測(cè)小區(qū)丹參鮮重，干燥后稱(chēng)干重，折合單位產(chǎn)量?；瘜W(xué)成分測(cè)定，丹參總酮、丹酚酸B含量按照2015年版中國(guó)藥典一部進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性考察

2.1.1 4品系地上部分特異性突出

4品系丹參地上部分性狀特征突出，特異性良好。性狀總結(jié)如下。

2.1.1.1 品系DZ-16-03

株高矮，花序短，葉片長(zhǎng)且寬，葉面積大，花序長(zhǎng)/株高小，花冠短，花冠紫色較深，葉片深綠色。

2.1.1.2 品系DZ-16-05

株高矮，花序短，葉柄長(zhǎng)，葉片長(zhǎng)且寬，葉面積大，花冠紫色淺。

2.1.1.3 品系ZT-16-15

花序長(zhǎng)，葉柄長(zhǎng)，葉片長(zhǎng)，葉片長(zhǎng)/葉片寬大，花冠長(zhǎng)，花冠紫色淺，葉片光滑。

2.1.1.4 品系DZ-16-105

株高稍矮，花序短，葉片短窄，葉面積小，花萼短，花序長(zhǎng)/株高小，花冠顏色深。

2.1.2 4品系地下部分特異性突出

4品系丹參地下部分，性狀特征突出，特異性良好。性狀總結(jié)如下。

2.1.2.1 品系DZ-16-03

一級(jí)根和二級(jí)根根粗較細(xì)，根外表皮顏色淡紅，分根數(shù)少，根幅深小，根幅寬小，根鮮重均值177.75g。

2.1.2.2 品系DZ-16-105

一級(jí)根和二級(jí)根根粗較粗，根部外表皮顏色紅色，分根數(shù)少，根幅深較大，根幅寬較大，根鮮重均值277.27g。

2.1.2.3 品系ZT-16-15

一級(jí)根和二級(jí)根根粗，根部外表皮顏色紅色，須根較多，根幅深小，根幅寬小，分根數(shù)少，根鮮重均值221.12g。

2.1.2.4 品系DZ-16-05

一級(jí)根和二級(jí)根根粗細(xì)，根部外表皮顏色紅色，分根數(shù)少，須根較多，根幅深小，根幅寬小，根鮮重均值169.01g。

2.2 穩(wěn)定性考察

2.2.1 4品系丹參地上部分性狀穩(wěn)定性考察

地上部分測(cè)定性狀包括數(shù)量性狀7個(gè)，分別為株高，花序長(zhǎng)，葉柄長(zhǎng)，葉片長(zhǎng)，葉片寬，花萼長(zhǎng)，花冠長(zhǎng)；質(zhì)量性狀7個(gè)，分別為莖生單復(fù)葉情況，花冠顏色，葉片裂葉情況，葉片顏色，葉片粗糙程度和一級(jí)莖分枝數(shù)，二級(jí)莖分枝數(shù)。進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并平行比較2019年及2020年數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖1，可知各品系地上部分性狀穩(wěn)定性均良好。其中，DZ-16-05的穩(wěn)定性稍差，推測(cè)大概率因2020年澇害嚴(yán)重，致使該品系生長(zhǎng)受到抑制所致。

注：*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2.2 4品系丹參地下部分性狀穩(wěn)定性考察

地下部分測(cè)定主要涉及數(shù)量性狀6個(gè)，分別為一級(jí)根粗、二級(jí)根粗、分根數(shù)、根幅深、根幅寬、根鮮重；質(zhì)量性狀2個(gè)，分別為有無(wú)蟲(chóng)害、有無(wú)病害。通過(guò)數(shù)據(jù)測(cè)定與連續(xù)2年數(shù)據(jù)比較，見(jiàn)圖2，分析可知各品系地下部分性狀穩(wěn)定性均良好。其中，DZ-16-05和DZ-16-03的穩(wěn)定性稍差，同樣推測(cè)可能是由于2020年澇害所致。

注：*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 一致性考察

2.3.1 地上部分一致性考察

對(duì)地上部分性狀進(jìn)行測(cè)定、統(tǒng)計(jì)，見(jiàn)圖3，發(fā)現(xiàn)各品系內(nèi)部一致性良好。

注：1為DZ-16-03；2為DZ-16-05；3為ZT-16-15；4為DZ-16-105；ck為對(duì)照。

2.3.2 地下部分一致性考察

對(duì)地下部分進(jìn)行數(shù)量性狀測(cè)定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。由圖4可知，品系內(nèi)部各性狀的標(biāo)準(zhǔn)差小，一致性良好。

注：1為DZ-16-03；2為DZ-16-05；3為ZT-16-15；4為DZ-16-105；ck為對(duì)照。

2.4 產(chǎn)量評(píng)估

對(duì)5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)各品系根鮮重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見(jiàn)圖5，顯示同一品系在不同地塊的根鮮重存在顯著差異，可能與不同地塊間田間管理方式存在差異有關(guān)。特別是2020年澇害嚴(yán)重，各試驗(yàn)樣點(diǎn)田間排水工作的好壞可直接影響丹參的生長(zhǎng)，尤其是抗?jié)衬芰ο鄬?duì)較差的品系DZ-16-03和DZ-16-05影響更為顯著。

圖5 不同地塊品系丹參根鮮重比較結(jié)果

根據(jù)田間種植參數(shù)、保苗率和根鮮重?cái)?shù)據(jù)初步評(píng)估各目標(biāo)品系產(chǎn)量，見(jiàn)表3。發(fā)現(xiàn)4個(gè)品系中，品系ZT-16-15和DZ-16-105的鮮重產(chǎn)量分別較對(duì)照高59.2%和202.3%，具有明顯產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)；品系DZ-16-03和DZ-16-05的鮮重產(chǎn)量與對(duì)照相當(dāng)。此外，由表3可知，各丹參品系的保苗率均不高，提示在進(jìn)行愈傷組織培育及根段移栽過(guò)程應(yīng)該進(jìn)一步改善相關(guān)技術(shù)，如篩選適當(dāng)?shù)呐嘤|(zhì)，提高對(duì)溫濕條件的控制，移栽過(guò)程確保根段完全埋入土中并澆足定根水，種苗破土期保持墑情等，從而提高保苗率。

表3 品系丹參產(chǎn)量評(píng)估結(jié)果

2.5 含量分析

丹參酮及丹酚酸類(lèi)成分含量測(cè)定按中國(guó)藥典方法進(jìn)行。

2.5.1 丹參酮類(lèi)化學(xué)成分的含量測(cè)定

2.5.1.1 對(duì)照品溶液的制備

取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.5.1.2 供試品溶液的制備

2020年品系包括臨沂3塊試驗(yàn)田的DZ-16-03、DZ-16-05、ZT-16-15、ZT-16-08、DZ-16-105；濰坊市的品系DZ-16-03、DZ-16-05、ZT-16-15、DZ-16-105；鄒城市的品系DZ-16-03、DZ-16-05、DZ-16-105。晾曬后，打粉。分別取丹參粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.3g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率140W，頻率42kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.1.3 含量測(cè)定

用梯度濃度對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC色譜分析，制作丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。進(jìn)樣供試品溶液進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-0.02%磷酸溶液(B)。梯度洗脫程序：0～6min，61%A；6～20min，61%～90%A；20～20.5min，90%～61%A；20.5～25min，61%A，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，流速1.0mL·min-1，柱溫20℃，進(jìn)樣量10μL。

以丹參酮ⅡA的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算品系丹參及對(duì)照中隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量。

2.5.1.4 丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

丹參酮ⅡA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5289.3x-2818.6，相關(guān)系數(shù)R=1，線性范圍為32.2096～161.0480ng。

2.5.1.5 丹參酮類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果

丹參酮類(lèi)含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表4。

表4 2019年、2020年總酮含量的比較分析

2.5.2 丹酚酸類(lèi)化學(xué)成分的含量測(cè)定

2.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取丹參酮B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇-水(8∶2)混合溶液制成每1mL含0.10mg的溶液，即得。

2.5.2.2 供試品溶液的制備

取丹參粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.15g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水(8∶2)混合溶液50mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率140W，頻率42kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇-水(8∶2)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5mL，移至10mL量瓶中，加甲醇-水(8∶2)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.2.3 含量測(cè)定

用梯度濃度對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC色譜分析，制作丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。進(jìn)樣供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：ZORBAX SB-Aq C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)。檢測(cè)波長(zhǎng)286nm，流速1.2mL·min-1，柱溫20℃，進(jìn)樣量10μL。計(jì)算丹參及對(duì)照樣品中丹酚酸B的含量。

2.5.2.4 丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=766.36x-6584.8，相關(guān)系數(shù)R=1，線性范圍為171.948～859.74ng。

2.5.2.5 丹酚酸類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果

丹酚酸B含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表5。

表5 2019年、2020年丹酚酸B含量的比較分析

自2017年測(cè)得丹參資源DZ-16-03、DZ-16-05具有高丹酚酸B含量，經(jīng)過(guò)4年的連續(xù)種植含量測(cè)定，其丹酚酸B始終保持在11%左右，因此可以確定，此2個(gè)種質(zhì)具有高丹酚酸B含量特點(diǎn)，是值得推廣的優(yōu)良丹參品種；DZ-16-105具有高產(chǎn)的特點(diǎn)，且根表皮顏色紅，多成分含量相對(duì)均衡，也是值得推廣的優(yōu)良丹參品種。

3 結(jié)論

本次研究自200余份丹參種質(zhì)資源中優(yōu)選出特異種質(zhì)進(jìn)行跟蹤，開(kāi)展多點(diǎn)試驗(yàn)，進(jìn)行穩(wěn)定性及特異性評(píng)價(jià)，挖掘4個(gè)優(yōu)良丹參品系DZ-16-03、DZ-16-05、DZ-16-105、ZT-16-15，均具有好的特異性和穩(wěn)定性。品系DZ-16-105，根條粗壯、均勻，產(chǎn)量可高達(dá)500kg·667m-2，效益顯著，此外，丹參大條得率為70%，尤其適合作為丹參飲片切制原料，是促進(jìn)農(nóng)民增產(chǎn)、增收的高潛品種，目前已申報(bào)新品種“魯豐1號(hào)”[8]。品系DZ-16-03和DZ-16-05丹酚酸B含量高達(dá)10%左右，是藥典標(biāo)準(zhǔn)2.5倍，而且單株產(chǎn)量最高可達(dá)300g，經(jīng)后續(xù)組培復(fù)壯后，也可形成具有產(chǎn)業(yè)化推廣意義的丹參新品種，目前已申報(bào)新品種“魯豐2號(hào)”[9]。